厄洛替尼調(diào)節(jié)肺腺癌細(xì)胞中ABCG2表達(dá)變化的機(jī)制

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1、基金項(xiàng)目 國(guó)家自然科學(xué)基金（81272496） 通信作者 陳正堂，電話（023-68755626），E-mail：czt05@ 厄洛替尼調(diào)節(jié)肺腺癌細(xì)胞中ABCG2表達(dá)變化的機(jī)制 張靖1 馬虎2 韓靜1 李雪濤1 陳正堂1 （重慶 400037，第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院全軍腫瘤研究所1；遵義 563003，遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤醫(yī)院2） 摘要 目的 研究PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)厄洛替尼作用后的肺腺癌細(xì)胞中ABCG2表達(dá)變化的影響。方法 不同濃度厄洛替尼處理A549細(xì)胞及其獲得性耐厄洛替尼細(xì)胞(A549/ER)12h、24h、48h后,熒光實(shí)時(shí)定量PCR和Wester

2、n blot觀察ABCG2 mRNA及蛋白表達(dá)變化。結(jié)果 與未加入厄洛替尼的A549、A549/ER細(xì)胞相比，厄洛替尼（1μmol/L、5μmol/L、25μmol/L)作用12h、24h、48h后，隨著劑量的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，ABCG2的表達(dá)與PI3K/AKT信號(hào)通路抑制或激活呈正相關(guān)。結(jié)論 厄洛替尼作用后的肺腺癌細(xì)胞中ABCG2的表達(dá)變化可由PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)。 關(guān)鍵詞 肺癌；厄洛替尼；PI3K/AKT；ABCG2 中國(guó)法分類號(hào) R73.3 Mechanism of Erlotinib Regulating Changes of ABCG2 Expressi

3、on in Lung Adenocarcinoma Cells Zhang jing，Cheng zhengtang (Institute of Cancer，Xinqiao Hospital，Third Military Medical University，Chongqing 400037，China) Abstract Objective To study the influences of PI3K/AKT signaling pathway on the changes of ABCG2 expression in lung adenocarcinoma cells treat

4、ed by erlotinib.Methods A549 cells andits acquired erlotinib-resistant cells (A549/ER) were treated with different concentration of erlotinib for 12 h, 24 h and 48 h. Real-time fluorescent quantitative PCR and Western blot were used to observethe changes of ABCG2 mRNA and protein expressions. Result

5、s:Compared with the A549 and A549/ER cells without erlotinib, after treated by erlotinib (1μmol/L, 5μmol/L and 25μmol/L)for 12 h, 24 h and 48 h, the expression of ABCG2 and inhibition or activation of PI3K/AKT signaling pathway were positively correlated as the increase of dosage andthe extension

6、of action time.Conclusion Changes of ABCG2 expression in lung adenocarcinoma cells treated by erlotinibcan be regulated by the PI3K/AKT signal pathway. Keywords: Lung cancer; erlotinib; PI3K/AKT; ABCG2 磷醇酰肌醇3激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶( phpsphatidylinositol 3-kinase/ serine- threonine kinase,PI3K/AKT)通路參與多種腫瘤的發(fā)生和

7、演進(jìn)，是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，主要通過(guò)影響下游AKT的活化狀態(tài)，參與并調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展的細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程[1]。而在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中，PI3K/AKT信號(hào)通路起著至關(guān)重要的作用，其磷酸化AKT的過(guò)度活化可以進(jìn)一步激活PI3K/AKT通路，誘導(dǎo)癌細(xì)胞抗凋亡，從而引起耐藥[2]。ABCG2是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)超家族成員之一，能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)藥物主動(dòng)外排，引起腫瘤的多藥耐藥[3-4]。本課題組前期結(jié)果表明，經(jīng)厄洛替尼處理的肺腺癌細(xì)胞株，其ABCG2表達(dá)呈時(shí)間和劑量依賴性。但厄洛替尼影響ABCG2表達(dá)的機(jī)制仍然不明。PI3K/AKT信

8、號(hào)通路即是厄洛替尼作用的主要抑制通路，又在NSCLC中起著至關(guān)重要的作用，故此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究厄洛替尼作用于肺腺癌細(xì)胞株A549及 A549/ER細(xì)胞后，p-AKT及ABCG2的表達(dá)變化，探討肺腺癌細(xì)胞中ABCG2的表達(dá)是否經(jīng)由PI3K/AKT信號(hào)通路介導(dǎo)。 1材料和方法 1.1 材料 細(xì)胞株：人肺腺癌細(xì)胞株A549株（上海復(fù)祥生物有限公司），A549獲得性耐厄洛替尼細(xì)胞（A549/ER）為本實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)所得。藥品與試劑：鹽酸厄洛替尼（上海安格化工有限公司），純度為99.31%。miRNA提取試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒 (TaKaRa，Japan)；一抗：GAPDH（武漢博

9、士德）； ABCG2(Abcam，USA) ；AKT及p-AKT(abcam);HRP標(biāo)記的二抗 (中杉金橋) ；PRMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清（Gibco，USA）。 1.2 方法 1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺腺癌A549細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的PRMI-16401640培養(yǎng)基，A549/ER細(xì)胞培養(yǎng)與厄洛替尼終水平為25μmol/L的含10%胎牛血清的PRMI-16401640培養(yǎng)基。兩種細(xì)胞均置于37°C、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。 1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn) A549細(xì)胞及A549/ER細(xì)胞以5x103/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24

10、h后加厄洛替尼0.01μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L、10μmol/L和100μmol/L，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（0.1%DMSO）和空白孔，每組5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48h后進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，根據(jù)公式求出相應(yīng)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，求得IC50值。 1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)厄洛替尼作用A549、A549ER細(xì)胞12h、24h、48h后ABCG2 mRNA表達(dá) 將細(xì)胞以5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，每孔加液量1ml于培養(yǎng)24h后換液，A549及A549ER細(xì)胞加入厄洛替尼濃度為1μmol/L、5μmol/L、25μmol/L；分別于培養(yǎng)12h、2h4、48h，按照TaKaRa RN

11、A提取說(shuō)明書(shū)提取總RNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)定上述RNA樣品的濃度和純度。用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) (TaKaRa 公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后, 采用 Real-time PCR 儀(ABI7500公司)對(duì)上述獲得的 cDNA 進(jìn)行檢測(cè)。引物為：b-actin 和 ABCG2(引物序列見(jiàn)表 1)。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 30s, 95 ℃ 5 s, 60℃ 34s, 40 個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt法分析樣品中目的基因的相對(duì)表達(dá)率。（引物圖見(jiàn)表1） 表1 用于Real-time RT-PCR的引物

12、 Gene Bank號(hào) 名 稱 堿基序列 產(chǎn)物大小 NM_031512 人ABCG2上游 5’- GAAACCTGGTCTCAACGCCATCC -3’ 194 bp 下游 5’- CGTCAGAGTGCCCATCACAACAT -3’ NM-001101.3 b-actin 上游 5’-GTGAAGGTGACAGCAGTCGGTT-3’ 159 bp 下游 5’- GAAGTGGGGTGGCTTTTAGGA -3’ 1.2.4Western blot檢測(cè)厄洛替尼作用A549、A549ER細(xì)胞12h、24h、48h后p-AKT、AKT

13、、ABCG2 mRNA表達(dá) 將細(xì)胞以5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，每孔加液量1ml于培養(yǎng)24h后換液，A549及A549ER細(xì)胞加入厄洛替尼濃度為1μmol/L、5μmol/L、25μmol/L；分別于培養(yǎng)12h、2h4、48h，分別于培養(yǎng)6、12、24h提取總蛋白（整個(gè)過(guò)程冰上進(jìn)行）。BAC測(cè)定蛋白濃度，并將所有樣品濃度調(diào)至一致，加入1/5體積的上樣緩沖液，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，濕轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上。然后5％BSA室溫封閉1h，分別加入一抗GAPDH、p-AKT、ABCG2（TBST與一抗稀釋比例為1:1000）4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜 5 次，每次 3 分鐘。加入二抗，室

14、溫孵育1小時(shí)，TBST 洗膜 3 次后加顯影液曝光。結(jié)果用QuantityOne軟件分析灰度值。 1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 18.0軟件包，數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)(()±標(biāo)準(zhǔn)差(s))，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以p<0.05為差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2 結(jié)果 2.1MTT法檢測(cè)A549/ER耐藥性 不同水平的厄洛替尼對(duì)A549細(xì)胞及A549/ER細(xì)胞的抑制效應(yīng)見(jiàn)表1.根據(jù)SPSS軟件及IC50計(jì)算軟件得到厄洛替尼對(duì)A549細(xì)胞的IC50值為15.71μmol/L；厄洛替尼對(duì)A549/ER細(xì)胞的IC50值為109.41μmol/L。A549/ER細(xì)胞的IC50值

15、是A549細(xì)胞的IC50值的6.95倍，說(shuō)明A549/ER細(xì)胞具有耐藥性。（見(jiàn)表2） 表2 厄洛替尼對(duì)A549細(xì)胞及A549/ER細(xì)胞抑制效應(yīng) 厄洛替尼水平（μmol/L） 抑制率（%） A549 細(xì)胞 A549/ER 細(xì)胞 0.01 8.18±3.12 8.303±4.046 0.1 27.42±3.65 15.4±6.5 1 36.45±4.

16、21 30.54±6.95 10 36.1±4.21 30.54±6.95 100 67.53±7.85 52.68±7.94 IC50 15.71μmol/L 109.41μmol/L 2. 2厄洛替尼作用A549、A549ER細(xì)胞12h、24h、48h后ABCG2 mRNA表達(dá) qRT-PCR檢測(cè)表明：厄洛替尼（1μmol/L、5μmo

17、l/L、25μmol/L)作用A549細(xì)胞12h、24h、48h后，相較于未加入厄洛替尼的細(xì)胞，其p-AKT、ABCG2 mRNA表達(dá)明顯下調(diào) (P<0.05)。同樣時(shí)間、劑量的厄洛替尼作用A549/ER細(xì)胞后，加入厄洛替尼的A549/ER細(xì)胞中p-AKT、ABCG2 mRNA表達(dá)較未加藥細(xì)胞，表達(dá)明顯上調(diào) (P<0.05)。結(jié)果顯示，隨著劑量的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，ABCG2的表達(dá)與PI3K/AKT信號(hào)通路抑制或激活呈正相關(guān)。（見(jiàn)圖1） 圖1 a:control(未加厄洛替尼)； b:1μmol/L；c:5μmol/L；d：25μmol/L 2.2厄洛替尼作用A549、A549

18、ER細(xì)胞12h、24h、48h后p-akt、ABCG2 mRNA表達(dá) Western blot檢測(cè)顯示：厄洛替尼（1μmol/L、5μmol/L、25μmol/L)作用A549細(xì)胞12h、24h、48h后，相較于未加藥的細(xì)胞，其p-AKT、ABCG2 mRNA表達(dá)明顯下調(diào) (P<0.05)。同樣時(shí)間、劑量的厄洛替尼作用A549/ER細(xì)胞后，加入厄洛替尼的A549/ER細(xì)胞中p-AKT、ABCG2 mRNA表達(dá)較未加藥細(xì)胞表達(dá)明顯上調(diào) (P<0.05)。結(jié)果顯示（見(jiàn)圖3-6），ABCG2的表達(dá)與PI3K/AKT信號(hào)通路具有相關(guān)性并呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性。 圖3、A549細(xì)胞

19、 12h 24h 48h GAPDH(37KD) p-akt(60KD) ABCG2(72KD) a:control(未加厄洛替尼)； b:1μmol/L；c:5μmol/L；d：25μmol/L 圖4、A549/ER細(xì)胞 12h 24h 48h ABCG2(72KD) p-akt(60KD) GAPDH(37KD) a:control(未加厄洛替尼)； b:1μmol/L；c:5μmol/L；d：25μmol/L 圖5 a:

20、control(未加厄洛替尼)； b:1μmol/L；c:5μmol/L；d：25μmol/L 圖6 a:control(未加厄洛替尼)； b:1μmol/L；c:5μmol/L；d：25μmol/L 3 討論 厄洛替尼主要通過(guò)抑制表皮生長(zhǎng)因子受體（Epidermal growth factor receptor, EGFR）介導(dǎo)的下游MAPK-ERK1/2 和PI3K-Akt通路起作用。其中，PI3K信號(hào)通路被視為癌細(xì)胞生存的首要通路[5]。它的激活或關(guān)閉可以影響癌細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞生物學(xué)改變。Akt也被稱作蛋白激酶B (protein kinase B ,PKB)，是PI3K通路重

21、要的下游分子，持續(xù)的AKT活化會(huì)引起PI3K/AKT信號(hào)通路的過(guò)度激活，導(dǎo)致多種細(xì)胞生物學(xué)改變。國(guó)內(nèi)外研究也證實(shí)，抑制p-AKT能夠降低多種腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力[6-7]。故PI3K/AKT信號(hào)通路與腫瘤的關(guān)系得到越來(lái)越多的關(guān)注。ABCG2最初在乳腺癌耐藥細(xì)胞株中被發(fā)現(xiàn)，因此也被稱為乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）。大量的研究表明ABCG2可以將底物排出細(xì)胞而介導(dǎo)腫瘤多藥耐藥（MDR），絡(luò)氨酸激酶抑制劑就是其底物之一。ABCG2可以在多種耐藥細(xì)胞系和腫瘤中過(guò)表達(dá)[8]。并證實(shí)與吉非替尼等有較高的親和力，二者結(jié)合會(huì)導(dǎo)致EGFR-TKI主動(dòng)外排到胞外，從而抑制吉非替尼的生物活性，產(chǎn)生耐藥[9]。本課題

22、組前期的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，厄洛替尼作用于肺腺癌細(xì)胞株可以影響其ABCG2的表達(dá)，本研究在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，著眼于厄洛替尼通過(guò)怎樣的機(jī)制影響ABCG2的表達(dá)。PI3K/AKT信號(hào)通路即作為癌細(xì)胞中重要的信號(hào)通路，又是厄洛替尼重要下游通路，由此，我們推測(cè)厄洛替尼對(duì)ABCG2的影響可能是通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路來(lái)完成的。 在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中我們對(duì)厄洛替尼影響肺腺癌細(xì)胞中ABCG2表達(dá)的機(jī)制進(jìn)行了研究?，F(xiàn)有研究顯示：表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑如吉非替尼等通過(guò)PI3K信號(hào)通路降低了EGFR陽(yáng)性MDCK細(xì)胞中ABCG2總的表達(dá)[10].乳腺癌細(xì)胞中PI3K是abcg2亞細(xì)胞定位的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)器[11]。PI3

23、K信號(hào)在不同條件下的BCRP基因轉(zhuǎn)錄的反式作用元件的功能調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用[12]。本研究證明，厄洛替尼抑制了EGFR下游PI3K/AKT信號(hào)通路中p-akt的活性，顯著下調(diào)A549中ABCG2的表達(dá)，而厄洛替尼作用的A549/ER細(xì)胞中，ABCG2表達(dá)明顯上調(diào)，與p-akt表達(dá)一致，認(rèn)為耐藥細(xì)胞中p-akt增加，導(dǎo)致了PI3K/AKT信號(hào)通路過(guò)度激活，從而影響了ABCG2的表達(dá)。故此，我們推論，厄洛替尼通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路可以調(diào)控ABCG2的表達(dá)，這可能為逆轉(zhuǎn)ABCG2介導(dǎo)的NSCLC靶向耐藥提供新的思路和策略。 參考文獻(xiàn) 1. Gentry, L.R., T.D. Mart

24、in, and C.J. Der, Mechanisms of targeted therapy resistance take a de-TOR. Cancer Cell, 2013. 24(3): p. 284-6. 2. Bartholomeusz, C. and A.M. Gonzalez-Angulo, Targeting the PI3K signaling pathway in cancer therapy. Expert Opin Ther Targets, 2012. 16(1): p. 121-30. 3. Stacy, A.E., P.J. Jansson, and

25、D.R. Richardson, Molecular pharmacology of ABCG2 and its role in chemoresistance. Mol Pharmacol, 2013. 84(5): p. 655-69. 4. Meyer zu Schwabedissen, H.E. and H.K. Kroemer, In vitro and in vivo evidence for the importance of breast cancer resistance protein transporters (BCRP/MXR/ABCP/ABCG2). Handb E

26、xp Pharmacol, 2011(201): p. 325-71. 5. Burris, H.A., 3rd, Overcoming acquired resistance to anticancer therapy: focus on the PI3K/AKT/mTOR pathway. Cancer Chemother Pharmacol, 2013. 71(4): p. 829-42. 6. Liang, Y.C., et al., Effects of PI3K inhibitor NVP-BKM120 on acquired resistance to gefitinib o

27、f human lung adenocarcinoma H1975 cells. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci, 2013. 33(6): p. 845-51. 7. Wang, L., et al., [The effect of leptin and its mechanisms on the migration and invasion of human breast cancer MCF-7 cells]. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi, 2013. 29(12): p. 1272-6. 8.

28、Natarajan, K., et al., Role of breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) in cancer drug resistance. Biochem Pharmacol, 2012. 83(8): p. 1084-103. 9. Hegedus, C., et al., Interaction of the EGFR inhibitors gefitinib, vandetanib, pelitinib and neratinib with the ABCG2 multidrug transporter: implic

29、ations for the emergence and reversal of cancer drug resistance. Biochem Pharmacol, 2012. 84(3): p. 260-7. 10. Pick, A. and M. Wiese, Tyrosine kinase inhibitors influence ABCG2 expression in EGFR-positive MDCK BCRP cells via the PI3K/Akt signaling pathway. ChemMedChem, 2012. 7(4): p. 650-62. 11. G

30、oler-Baron, V., I. Sladkevich, and Y.G. Assaraf, Inhibition of the PI3K-Akt signaling pathway disrupts ABCG2-rich extracellular vesicles and overcomes multidrug resistance in breast cancer cells. Biochem Pharmacol, 2012. 83(10): p. 1340-8. 12. Nakanishi, T. and D.D. Ross, Breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2): its role in multidrug resistance and regulation of its gene expression. Chin J Cancer, 2012. 31(2): p. 73-99.