醫(yī)療器械微生物檢驗(yàn).ppt

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1、1,醫(yī)療器械微生物限度檢驗(yàn),2,概述,微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。,微生物限度檢查,細(xì)菌、真菌菌落數(shù),控制菌,3,概述,微生物:形體微小,結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,通常要用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡才能看清楚的生物 特點(diǎn): 1、個(gè)體微小,一般0.1mm 2、構(gòu)造簡(jiǎn)單,有單細(xì)胞的,簡(jiǎn)單多細(xì)胞 的,非細(xì)胞的 3、進(jìn)化地位低 分類(lèi):原核類(lèi):二菌,四體(細(xì)菌、放線菌、螺旋體、支原體、立克次氏體、衣原體) 真核類(lèi):真菌,原生動(dòng)物,顯微藻類(lèi) 非細(xì)胞類(lèi):病毒,亞病毒,4,5,概述,醫(yī)療用品的分類(lèi) 按醫(yī)療用品與人體接觸的性質(zhì)以及對(duì)人體使用安全性要求分三類(lèi): a) 類(lèi)醫(yī)療用品:接觸人體

2、完整皮膚的醫(yī)療用品 b) 類(lèi)醫(yī)療用品:接觸人體未破損粘膜的醫(yī)療用品 c) 類(lèi)醫(yī)療用品:進(jìn)入人體無(wú)菌組織、器官和血液 以及接觸破損皮膚和粘膜的醫(yī)療 用品,6,常用檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn),中華人民共和國(guó)藥典 2010年版二部附錄XI J “微生物限度檢查法” GB 15979-2002 一次性衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)附錄B ISO11737-1:2006 Sterilization of medical devices Microbiological methodsPart1: Determination of a population of microorganisms on products,7,8,實(shí)驗(yàn)條件,無(wú)菌

3、操作技術(shù) 實(shí)驗(yàn)環(huán)境 實(shí)驗(yàn)器材,9,無(wú)菌操作技術(shù),微生物學(xué)基礎(chǔ) 微生物實(shí)踐基礎(chǔ) 無(wú)菌操作意識(shí),10,實(shí)驗(yàn)環(huán)境,潔凈度10000級(jí)下的局部潔凈度100級(jí)的單向流空氣區(qū)域或隔離系統(tǒng); 定期按GB/T16292-16294:2010醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測(cè)試方法的現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證; 實(shí)驗(yàn)中監(jiān)控:實(shí)驗(yàn)時(shí)將制備好的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板打開(kāi)放于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上,至實(shí)驗(yàn)結(jié)束收起,30 35培養(yǎng)48h,菌落平均數(shù)應(yīng)小于1cfu/90mm。,11,實(shí)驗(yàn)器具,儀器 超凈工作臺(tái)、光學(xué)顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、壓力蒸汽滅菌器、薄膜過(guò)濾裝置、比濁儀等。 用具 試管、注射器、三角瓶、刻度吸管、移液器、精密PH試

4、紙、濾膜、濾杯、剪刀、鑷子、無(wú)菌服、牛皮紙等。,12,實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備,實(shí)驗(yàn)環(huán)境保證 實(shí)驗(yàn)試液 培養(yǎng)基 滅菌方法,13,實(shí)驗(yàn)環(huán)境保證,環(huán)境清潔,表面消毒( 75%(V/V)乙醇、新潔爾滅(1:1000)溶液或其他適宜消毒溶液) 空氣過(guò)濾系統(tǒng),紫外燈或臭氧空氣消毒儀,14,實(shí)驗(yàn)試液,稀釋劑 1.0.9%氯化鈉溶液 2.pH6.8無(wú)菌磷酸鹽緩沖液、pH7.6無(wú)菌磷酸鹽緩沖液 3.pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液:調(diào)解pH至近中性,其中蛋白胨對(duì)細(xì)菌細(xì)胞有保護(hù)作用有利于菌落數(shù)及控制菌測(cè)定。 表面活性劑、中和劑或滅活劑 鑒定用試劑 1.靛基質(zhì)試液 2.1%二鹽酸二甲基對(duì)苯二胺試液(氧化酶試液) 3.三氯甲烷 4.

5、1mol/l鹽酸試液,15,培養(yǎng)基,標(biāo)準(zhǔn)菌株處理及增菌用培養(yǎng)基 選擇性培養(yǎng)基 鑒別培養(yǎng)基,16,培養(yǎng)基,培養(yǎng)基的酸堿度應(yīng)符合細(xì)菌生長(zhǎng)要求。應(yīng)按各種培養(yǎng)基要求準(zhǔn)確測(cè)定調(diào)節(jié)pH值。多數(shù)細(xì)菌生長(zhǎng)的適宜pH值為7.27.6。酵母菌霉菌(6.06.5)。調(diào)節(jié)可用1N HCl或NaOH。 培養(yǎng)基的滅菌時(shí)間和溫度,應(yīng)按照各種培養(yǎng)基的規(guī)定進(jìn)行,以保證滅菌效果及不損失培養(yǎng)基的必需營(yíng)養(yǎng)成分。 制成的培養(yǎng)基應(yīng)透明,以便觀察細(xì)菌生長(zhǎng)性狀以及其他代謝活動(dòng)所產(chǎn)生的變化。,17,滅菌方式,濕熱:115 121 ,15min30min 物品切勿立即取出置冷處,以免急速冷卻,使滅菌物品內(nèi)蒸氣冷凝造成負(fù)壓,以致染菌。 干熱:16

6、0 170 ,2h 適于耐高溫的玻璃、陶瓷或金屬器皿的滅菌。 滅菌程序需要經(jīng)過(guò)驗(yàn)證。,18,計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查,細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查,成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查。,19,計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查,菌種 大腸埃希菌 CMCC(B)44 102 金黃色葡萄球菌 CMCC(B) 26 003 枯草芽孢桿菌 CMCC(B) 63 501 白色念珠菌 CMCC(F) 98 001 黑曲霉 CMCC(F) 98 003 驗(yàn)證試驗(yàn)所用的菌株傳代次數(shù)不得超過(guò)5代(從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代),并采用適宜的菌種保藏技術(shù),以保證試驗(yàn)菌株的生物

7、學(xué)特性。,20,計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查,菌液制備 取細(xì)菌新鮮培養(yǎng)物(一般18h24h,白念24h48h ,黑曲霉 57天 ),用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml 含菌數(shù)50cfu100cfu的菌懸液 (黑曲霉用含0.05%聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液); 菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用,若保存在2 8可以在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2 8,在驗(yàn)證過(guò)的貯存期內(nèi)使用。,21,計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查,培養(yǎng)基接種 金黃色葡萄球菌2個(gè)平皿 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 大腸埃希菌2個(gè)平皿 枯草芽孢桿菌2個(gè)平皿 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基 白色念珠菌2個(gè)平皿 黑典霉2個(gè)平皿 酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基:

8、白色念珠菌2個(gè)平皿 用相同的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基做對(duì)照,22,計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查,結(jié)果判定 若被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)不小于對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的70%,且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致,判該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。,23,樣品準(zhǔn)備,供試品進(jìn)入無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室前應(yīng)作表面消毒,用適宜的消毒液對(duì)供試品容器表面進(jìn)行徹底消毒。 檢驗(yàn)數(shù)量:應(yīng)從2個(gè)以上最小包裝單位中抽取供試品,膜劑還不得少于4片。 一般應(yīng)隨機(jī)抽取不少于檢驗(yàn)用量(兩個(gè)以上最小包裝單位)的3倍量供試品。,24,樣品準(zhǔn)備,檢驗(yàn)量:除另有規(guī)定外,一般供試品的檢驗(yàn)量為10 g或10ml;化學(xué)膜劑100cm2;貴重藥品、微量包裝藥品

9、的檢驗(yàn)量可以酌減。要求檢查沙門(mén)菌的供試品,其檢驗(yàn)應(yīng)增加20g或20ml(其中10g或10ml用于陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn))。,25,供試液制備,液體供試品、固體、半固體或黏稠液供試品 取10ml或10g用pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100ml,混勻,作為1:10的供試液。油劑可加入適量的無(wú)菌吐溫80使供試品分散均勻; 水溶性液體亦可用混合供試品原液作為供試液; 非水溶性供試品 :乳化或萃取; 膜劑供試品 :取供試品100cm2,剪碎,加pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml浸泡,振搖,作為1:10的供試液; 腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品:取供試品10g ,加pH6.8無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(用于腸溶

10、制劑)PH7.6無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(用于結(jié)腸溶制劑)至100ml,置45水浴中,振搖,使溶解,作為1:10的供試液; 氣霧劑、噴霧劑供試品 ,經(jīng)處理后同第一項(xiàng)制備供試液; 貼劑供試品 具抑菌活性的供試品 :培養(yǎng)基稀釋法 、離心沉淀法 、薄膜過(guò)濾法 、中和法;,26,細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù),實(shí)驗(yàn)方法 傾注平皿法 薄膜過(guò)濾法 培養(yǎng)基 細(xì)菌總數(shù):營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 霉菌及酵母菌計(jì)數(shù):玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄瓊脂培養(yǎng)基,27,細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù),培養(yǎng)和計(jì)數(shù) 除另有規(guī)定外,細(xì)菌培養(yǎng)3天,逐日點(diǎn)計(jì)菌落數(shù) 霉菌、酵母菌培養(yǎng)5天,逐日點(diǎn)計(jì)菌落數(shù) 必要時(shí)可延長(zhǎng)至7天進(jìn)行菌落計(jì)數(shù) 點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)后,計(jì)算各稀

11、釋級(jí)供試液的平均菌落數(shù),按菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù),28,細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù),方法驗(yàn)證 (1)試驗(yàn)組 平皿法:供試液1ml +1ml 試驗(yàn)菌菌懸液,平行制備2個(gè)平皿,菌落計(jì)數(shù); 薄膜過(guò)濾法:供試液,過(guò)濾,沖洗,在最后一次的沖洗液中加入1ml試驗(yàn)菌,過(guò)濾,菌落計(jì)數(shù); (2)菌液組 測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù); (3)供試品對(duì)照組 取規(guī)定量供試液,按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定供試品本底菌數(shù); (4)稀釋劑對(duì)照組 若供試液制備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過(guò)濾等特殊處理時(shí),應(yīng)增加稀釋劑對(duì)照組,以考察供試液制備過(guò)程中微生物受影響的程度。稀釋劑+試驗(yàn)菌菌懸液;,29,細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù),驗(yàn)證試驗(yàn)至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立的

12、平行試驗(yàn),并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率。 結(jié)果判斷 在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中,稀釋劑對(duì)照組的菌數(shù)回收率應(yīng)均不低于70%; 若試驗(yàn)組的菌數(shù)回收率均不低于70%,可照該供試液制備方法和計(jì)數(shù)法測(cè)定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù); 若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌數(shù)回收率低于70%,應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過(guò)濾法、中和 法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性,并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。,30,細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù),1.平皿法 采用平皿法進(jìn)行菌數(shù)測(cè)定時(shí),應(yīng)取適宜的連續(xù)23個(gè)稀釋級(jí)的供試液。 取供試液1ml,置直徑90mm的無(wú)菌平皿中,注入1520ml 溫度不超過(guò)45的溶化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰

13、紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄瓊脂培養(yǎng)基,混勻,凝固,倒置培養(yǎng)。每稀釋級(jí)每種培養(yǎng)基至少制備2個(gè)平板。 陰性對(duì)照試驗(yàn) 取試驗(yàn)用的稀釋液1ml,置無(wú)菌平皿中,注入培養(yǎng)基,凝固,倒置培養(yǎng)。每種計(jì)數(shù)的培養(yǎng)基各制備2個(gè)平板,均不得有菌生長(zhǎng)。,31,細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù),營(yíng)養(yǎng)瓊脂-細(xì)菌 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基-霉菌,32,細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù),1.平皿法 菌數(shù)報(bào)告規(guī)則: 細(xì)菌、酵母菌宜選取平均菌落數(shù)小于300、霉菌宜選取平均菌落數(shù)小于100的稀釋級(jí),作為菌數(shù)報(bào)告(取兩位有效數(shù)字)的依據(jù); 以最高平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告1g、1ml或10cm2供試品中所含的菌數(shù); 如果各稀釋級(jí)的平板均無(wú)菌落生長(zhǎng),或

14、僅是最低稀釋級(jí)的平板有菌落生長(zhǎng),但平均菌落數(shù)小于1時(shí),以1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。,33,細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù),2. 薄膜過(guò)濾法 取相當(dāng)于每張濾膜含1g或1ml供試品的供試液,加至適量的稀釋劑中,混勻,過(guò)濾。若供試品每1g或1ml 所含的菌數(shù)較多時(shí),可取適宜稀釋級(jí)的供試液1ml ,過(guò)濾。用pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜,沖洗后取出濾膜,菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。 陰性對(duì)照試驗(yàn) 取試驗(yàn)用的稀釋液1ml,照上述薄膜過(guò)濾法操作,作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照不得有菌生長(zhǎng)。,34,細(xì)菌、

15、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù),2. 薄膜過(guò)濾法 菌數(shù)報(bào)告規(guī)則:以相當(dāng)于1g或1ml供試品的菌落數(shù)報(bào)告菌數(shù);若濾膜上無(wú)菌生長(zhǎng),以1報(bào)告菌數(shù)(每張濾膜過(guò)濾 1g或1ml供試品),或1乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。,35,細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù),在特殊情況下,若營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)有霉菌和酵母菌、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)有細(xì)菌,則應(yīng)分別點(diǎn)計(jì)霉菌和酵母菌、細(xì)菌菌落數(shù)。然后將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的霉菌和酵母菌數(shù)或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上的細(xì)菌數(shù),與玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基中的霉菌和酵母菌數(shù)或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的細(xì)菌數(shù)進(jìn)行比較,以菌落數(shù)較高的培養(yǎng)基中的菌數(shù)為計(jì)數(shù)結(jié)果。,36,37,控制菌檢查法驗(yàn)證,菌種(菌液制備同前) 大腸埃希菌 CMCC

16、(B)44 102 金黃色葡萄球菌 CMCC(B) 26 003 乙型副傷寒沙門(mén)菌CMCC(B) 50 094 銅綠假單胞菌 CMCC(B) 10 104 生孢梭菌 CMCC(B) 64 941,38,控制菌檢查法驗(yàn)證,(1)試驗(yàn)組 取規(guī)定量供試液及10cfu100cfu試驗(yàn)菌加入增菌培養(yǎng)基中,依相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行檢查。當(dāng)采用薄膜過(guò)濾法時(shí),取規(guī)定量供試液,過(guò)濾,沖洗,試驗(yàn)菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中,過(guò)濾后,注入增菌培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。 (2)陰性菌對(duì)照組 設(shè)立陰性菌對(duì)照組是為了驗(yàn)證該控制菌檢查方法的專屬性。方法同試驗(yàn)組,驗(yàn)證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門(mén)菌檢查法時(shí)的陰性對(duì)照菌采用金黃

17、色葡萄球菌;驗(yàn)證銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌,梭菌檢查法時(shí)的陰性對(duì)照菌采用大腸埃希菌。陰性對(duì)照菌不得檢出。 結(jié)果判斷 陰性菌對(duì)照組不得檢出陰性對(duì)照菌。若試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌,按此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行供試品的該控制菌檢查;若試驗(yàn)組未檢出試驗(yàn)菌,應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法 、薄膜過(guò)濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性,并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。,39,大腸埃希菌檢驗(yàn),取供試液10ml(相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm2),直接或處理后接種至適量(不少于100ml)的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中,培養(yǎng)1824小時(shí),必要時(shí)可延長(zhǎng)至48小時(shí)。 取上述培養(yǎng)物0.2ml,接種至含5ml MUG

18、培養(yǎng)基的試管內(nèi),培養(yǎng),于5小時(shí)、24小時(shí)在366nm紫外線下觀察,同時(shí)用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對(duì)照。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光,為MUG陽(yáng)性,不呈現(xiàn)熒光,為MUG陰性。觀察后,沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液,液面呈玫瑰紅色,為靛基質(zhì)陽(yáng)性;呈試劑本色,為靛基質(zhì)陰性。本底對(duì)照應(yīng)為MUG陰性和靛基質(zhì)陰性。,40,大腸埃希菌檢驗(yàn),MUG 靛基質(zhì)試驗(yàn),41,大腸埃希菌檢驗(yàn),如MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陽(yáng)性,判供試品檢出大腸埃希菌;如MUG陰性,靛基質(zhì)陰性,判供試品未檢出大腸埃希菌;如MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陰性,或MUG陰性、靛基質(zhì)陽(yáng)性,均應(yīng)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)物劃線于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上

19、,培養(yǎng)1824小時(shí)。 若平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)、或生長(zhǎng)的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征不符,判供試品未檢出大腸埃希菌 。若平板上生長(zhǎng)的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似,應(yīng)進(jìn)行分離、純化、染色鏡檢和適宜的生化試驗(yàn),確認(rèn)是否為大腸埃希菌。,42,大腸埃希菌檢驗(yàn),大腸埃希菌菌落形態(tài)特征,43,大腸菌群檢驗(yàn),取含適量(不少于10ml)的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支,分別加入1:10的供試液1ml(含供試品0.1g或 0.1ml)、1:100的供試液1ml(含供試品0.01g或 0.01ml )、1:1000的供試液1ml(含供試品0.001g或 0.001ml),另取1支膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基加入稀釋液1ml作

20、為陰性對(duì)照管。培養(yǎng)1824小時(shí)。,44,大腸菌群檢驗(yàn),膽鹽乳糖發(fā)酵管若無(wú)菌生長(zhǎng)、或有菌生長(zhǎng)但不產(chǎn)酸產(chǎn)氣,判該管未檢出大腸菌群;若產(chǎn)酸產(chǎn)氣,應(yīng)將發(fā)酵管中的培養(yǎng)物分別劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上,培養(yǎng)1824小時(shí)。 若平板上無(wú)菌落生長(zhǎng),或生長(zhǎng)的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征不符或?yàn)榉歉锾m陰性無(wú)芽孢桿菌,判該管未檢出大腸菌群;若平板上生長(zhǎng)的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似,且為革蘭陰性無(wú)芽孢桿菌,應(yīng)進(jìn)行確證試驗(yàn)。,45,大腸菌群檢驗(yàn),大腸菌群落形態(tài)特征,46,大腸菌群檢驗(yàn),確證試驗(yàn) 從上述分離平板上挑選45個(gè)疑似菌落,分別接種于乳糖發(fā)酵管中,培養(yǎng)2448小時(shí)。若產(chǎn)酸產(chǎn)氣,

21、判該乳糖發(fā)酵管檢 出大腸菌群,否則判未檢出大腸菌群。 根據(jù)大腸菌群的檢出管數(shù),按下表報(bào)告1g或1ml供試品 中的大腸菌群數(shù)。,47,可能的大腸菌群數(shù)表,48,沙門(mén)菌檢驗(yàn),取供試品10g或10ml,直接或處理后接種至適量(不少于200ml)的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,用勻漿儀或其他適宜方法混勻,培養(yǎng)1824小時(shí)。 取上述培養(yǎng)物1ml,接種于10ml四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中,培養(yǎng)1824小時(shí)后,分別劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂(或沙門(mén)、志賀菌屬瓊脂)培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂(或曙紅亞藍(lán)瓊脂)培養(yǎng)基的平板上,培養(yǎng)1824小時(shí)(必要時(shí)延長(zhǎng)至4048小時(shí))。 若平板上無(wú)菌生長(zhǎng),或生長(zhǎng)的菌落不同于下表所列的特征,判供試品未檢出

22、沙門(mén)菌。,49,沙門(mén)菌檢驗(yàn),沙門(mén)菌菌落形態(tài)特征,50,沙門(mén)菌檢驗(yàn),若平板上生長(zhǎng)的菌落與上表所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似,用接種針挑選23個(gè)菌落分別于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進(jìn)行斜面和高層穿刺接種,培養(yǎng)1824小時(shí),如斜面未見(jiàn)紅色、底層未見(jiàn)黃色;或斜面黃色、底層無(wú)黑色,判供試品未檢出沙門(mén)菌。否則,應(yīng)取三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基斜面的培養(yǎng)物進(jìn)行適宜的生化試驗(yàn)和血清凝集試驗(yàn),確認(rèn)是否為沙門(mén)菌。,51,銅綠假單胞菌檢驗(yàn),取供試液10ml(相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm2),直接或處理后接種至適量(不少于100ml)的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中,培養(yǎng)1824小時(shí)。取上述培養(yǎng)物,劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基的

23、平板上,培養(yǎng)1824小時(shí)。 銅綠假單胞菌典型菌落呈扁平、無(wú)定形、周邊擴(kuò)散、表面濕潤(rùn),灰白色,周?chē)鷷r(shí)有藍(lán)綠色素?cái)U(kuò)散。如平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符,判供試品未檢出銅綠假單胞菌。如平板上的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似,應(yīng)挑選23個(gè)菌落,分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上,培養(yǎng)1824小時(shí)。取斜面培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色、鏡檢及氧化酶試驗(yàn)。,52,銅綠假單胞菌檢驗(yàn),氧化酶試驗(yàn) 取潔凈濾紙片置于平皿內(nèi),用無(wú)菌玻棒取斜面培養(yǎng)物涂于濾紙片上,滴加新配置的1%二鹽酸二甲基對(duì)苯二胺試液,在30秒內(nèi)培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性,否則為陰性。 若斜面培養(yǎng)物為非革蘭陰性無(wú)芽孢桿菌或

24、氧化酶試驗(yàn)陰性,均判供試品未檢出銅綠假單胞菌。否則,應(yīng)進(jìn)行綠膿菌素試驗(yàn)。 綠膿菌素試驗(yàn) 取斜面培養(yǎng)物接種于PDP瓊脂培養(yǎng)基斜面上,培養(yǎng)24小時(shí),加三氯甲烷35ml至培養(yǎng)管中,攪碎培養(yǎng)基并充分振搖。靜置片刻,將三氯甲烷相移至另一試管中,加入1mol/l鹽酸試液約1ml,振搖后,靜置片刻,觀察。若鹽酸溶液呈粉紅色,為綠膿菌素試驗(yàn)陽(yáng)性,否則為陰性。同時(shí)用未接種的PDP瓊脂培養(yǎng)基斜面同法作陰性對(duì)照,陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)呈陰性。 若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性及綠膿菌素試驗(yàn)陽(yáng)性,判供試品檢出銅綠假單胞菌。若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性及綠膿菌素試驗(yàn)陰性,應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行適宜的生化試驗(yàn),確認(rèn)是

25、否為銅綠假單胞菌。,53,金黃色葡萄球菌檢驗(yàn),取供試液10ml(相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm2),直接或處理后接種至適量(不少于100ml)亞碲酸鈉(鉀)肉湯(或營(yíng)養(yǎng)肉湯)培養(yǎng)基中,培養(yǎng)1824小時(shí),必要時(shí)可延至48小時(shí)。取上述培養(yǎng)物,劃線接種于卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基或甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上,培養(yǎng)2472小時(shí)。若平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)的菌落不同于下表所列特征,判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。 若平板上生長(zhǎng)的菌落與下表所列的菌落特征相符或疑似,應(yīng)挑選23個(gè)菌落,分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上,培養(yǎng)1824小時(shí)。取營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色,并接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,培養(yǎng)1824

26、小時(shí),作血漿凝固酶試驗(yàn)。,54,金黃色葡萄球菌檢驗(yàn),金黃色葡萄球菌菌落形態(tài)特征,55,金黃色葡萄球菌檢驗(yàn),血漿凝固酶試驗(yàn) 取滅菌小試管3支,各加入血漿和 無(wú)菌水混合液(1:1)0.5ml,再分別加入可疑菌株的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物(或由營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物制備的濃菌懸液)0.5ml、金黃色葡萄球菌營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物(或由營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物制備的濃菌懸液)0.5ml、營(yíng)養(yǎng)肉湯或0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液0.5ml,即為試驗(yàn)管、陽(yáng)性對(duì)照管和陰性對(duì)照管。將3管同時(shí)培養(yǎng),3小時(shí)后開(kāi)始觀察直至24小時(shí)。陰性對(duì)照管的血漿應(yīng)流動(dòng)自如,陽(yáng)性 對(duì)照管血漿應(yīng)凝固,若試驗(yàn)管血漿凝固者為血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性,否則為陰性。如陽(yáng)

27、性對(duì)照管或陰性對(duì)照管不符合規(guī)定時(shí),應(yīng)另制備血漿,重新試驗(yàn)。,56,金黃色葡萄球菌檢驗(yàn),若上述疑似菌為非革蘭陽(yáng)性球菌、血漿凝固酶試驗(yàn)陰性,判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。,57,梭菌檢驗(yàn),取供試液10ml (相當(dāng)于供試品1g,1ml)2份,其中1份置80保溫10分鐘后迅速冷卻。上述2份供試液直接或處理后分別接種至100ml的0.1%新鮮庖肉培養(yǎng)基中。各培養(yǎng)基管在厭氧條件下培養(yǎng)48小時(shí)。再取上述培養(yǎng)物0.2ml,涂抹接種于含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上,在厭氧條件下培養(yǎng)4872小時(shí)。若平板上無(wú)菌落生長(zhǎng),判供試品未檢出梭菌;若平板上有菌落生長(zhǎng),應(yīng)挑選23個(gè)菌落分別進(jìn)行革蘭染色和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)。

28、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn) 取上述平板上的菌落,置潔凈玻片上,滴加3%過(guò)氧化氫試液,若菌落表面有氣泡產(chǎn)生,為過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陽(yáng)性,否則為陰性。 若上述可疑菌落為革蘭陽(yáng)性梭菌,有或無(wú)卵圓形或球形的芽孢,過(guò)氧化氫酶陰性,判供試品檢出梭菌,否則判供試品未檢出梭菌。,58,白色念珠菌檢驗(yàn),取供試液10ml(相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm2),直接或處理后接種至適量(不少于100ml)的沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)4872小時(shí),取上述培養(yǎng)物,劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上,培養(yǎng)2448小時(shí)。 菌落特征:乳白色,偶見(jiàn)淡黃色,表面光滑有濃酵母氣味,培養(yǎng)時(shí)間稍久則菌落增大,顏色變深,質(zhì)地變硬或有皺褶。 若平板上無(wú)

29、菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)的菌落不同于上述特征,判供試品未檢出白色念珠菌。 若平板上生長(zhǎng)的菌落與上述特征相符或疑似,應(yīng)挑選23個(gè)菌落,分別接種念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上,培養(yǎng)2448小時(shí)。若平板上無(wú)綠色或翠綠色的菌落生長(zhǎng),判供試品未檢出白色念珠菌。 若有綠色或翠綠色的菌落生長(zhǎng),則挑取相符或疑似菌落接種于1%聚山黎脂80-玉米瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)2448小時(shí),進(jìn)行染色鏡檢及芽管試驗(yàn)。 若上述疑似菌為非革蘭陽(yáng)性菌,顯微鏡下未見(jiàn)厚膜孢子、假菌絲、芽管,判供試品未檢出白色念珠菌。,59,結(jié)果判斷,供試品檢出控制菌或其他致病菌時(shí),按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn),不再?gòu)?fù)試。 供試品的細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定,應(yīng)從同一批樣品中隨機(jī)抽樣,獨(dú)立復(fù)試兩次,以3次結(jié)果的平均值報(bào)告菌數(shù)。 眼用制劑檢出霉菌和酵母菌數(shù)時(shí),須以兩次復(fù)試結(jié)果均不得長(zhǎng)菌,方可判供試品的霉菌和酵母菌數(shù)符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定。 若供試品的細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)及控制菌三項(xiàng)檢驗(yàn)結(jié)果均符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定,判供試品符合規(guī)定;若其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定,判供試品不符合規(guī)定。,60,謝謝大家!,知識(shí)回顧Knowledge Review,

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