現(xiàn)代生物制藥技術(shù).ppt

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1、生 物 制 藥 技 術(shù),第二章 基因工程制藥 第三章 細(xì)胞工程制藥 第四章 酶工程制藥 第五章 動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)制藥 第六章 生物藥物的提取純化技術(shù),第一章 緒論,第一章 緒論,第一節(jié) 生物制藥的概念和內(nèi)容 生物制藥是指利用生物體或生物過程生產(chǎn)藥物的技術(shù)。 分類： 發(fā)酵工程制藥 基因工程制藥 細(xì)胞工程制藥 酶工程制藥,第二節(jié) 生物藥物的性質(zhì)與分類,生物藥物的性質(zhì) 優(yōu)點(diǎn)：毒性低、副作用小、療效可靠。特異性 特別要提到的是利用重組DNA 技術(shù)生產(chǎn) 的藥品，即新生物技術(shù)藥品，或簡(jiǎn)稱生物新藥。 劣點(diǎn)： 1 成分復(fù)雜 2 不穩(wěn)定、易變性、易失活 3 易為微生物污染、破壞 4 生產(chǎn)條件的變化對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量影

2、響較大,二 生物新藥的質(zhì)量保證,要點(diǎn)：產(chǎn)品的鑒別、純度、活性、安全性、穩(wěn)定性和抑制性。 鑒定方法 電泳方法、免疫學(xué)分析方法、受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)、各種高效液相色譜分析法、肽圖分析法、Edman N-末端序列分析法、圓二色譜法、核磁共振法 安全性評(píng)價(jià) 無病毒、無菌、無熱源、無致敏源 致突變、致癌和致畸,三 生物藥物的分類,1 氨基酸類 2 有機(jī)酸、醇酮類 3 維生素 4 酶及輔酶類 （1）酶類藥物 ：助消化酶類；消炎酶類； 心血管疾病治療酶； 抗腫瘤酶； 其他酶類：超氧化物歧化酶 （SOD） PEG-腺苷脫氨酶 RNA酶 （2）輔酶類藥物：ATP NAD CoA FAD 5 脂類 （1）磷脂類,（2）多

3、價(jià)不飽和脂肪酸（PUFA）和前列腺素 （3）膽酸類 （4）固醇類 （5）卟啉類 6 多肽和蛋白質(zhì)類 人體內(nèi)的生物活性因子，如激素、免疫球蛋白和細(xì) 胞生長(zhǎng)因子。 紅細(xì)胞生成素（EPO） 白細(xì)胞介素-2（IL-2） 粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF） 粒/巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF） 腫瘤壞死因子（TNF） 表皮生長(zhǎng)因子（EGF）（用于傷口愈合）,7 核酸類及其衍生物 （1）核酸類 （2）多聚核苷酸 （3）核苷、核苷酸及其衍生物 8 多糖 升白：增加白細(xì)胞 （1）抗生素 （2）酶抑制劑 （3）免疫調(diào)節(jié)物質(zhì) （4）其他生物活性物質(zhì),第三節(jié) 新型生物藥物研制的理論和方法,新的化學(xué)實(shí)體（New c

4、hemical entity，簡(jiǎn)稱NCE） 根據(jù)NCE來源將生物藥物大致分為兩類： 一類是利用重組DNA技術(shù) 二類是利用微生物、動(dòng)植物或酶生產(chǎn)的非上述藥品，通過篩遠(yuǎn)可獲得這類新藥的NCE的先導(dǎo)物。 新藥研究和開發(fā)的主要過程： 1 確定研究計(jì)劃 2 準(zhǔn)備化合物 3 藥理篩選 4 化學(xué)試驗(yàn) 5 臨床前I期 6 臨床前II期 7 I期臨床 8 II期臨床 9 III期臨床 10注冊(cè)申請(qǐng)上市 11售后監(jiān)測(cè),提供6000-8000個(gè)化合物 9-13年 耗資約2.3億美元 先導(dǎo)化合物的尋找,1 篩選模型的確定 篩選模型的核心是藥物作用靶 大規(guī)模篩選（High-throughput screening，簡(jiǎn)稱

5、HTS） （1）用動(dòng)物細(xì)胞和組織建立的篩選模型 LC50 （2）酶抑制劑的篩選 （3）受體拮抗劑的篩選 基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄因子為對(duì)象的治療 （1）轉(zhuǎn)錄因子的多樣性 （2）轉(zhuǎn)錄因子具有特異性 （3）基因特異性轉(zhuǎn)錄因子與人類疾病有關(guān),開始考慮以凋亡為靶治療,2 先導(dǎo)化合物來源 一是從化學(xué)庫(kù)或天然產(chǎn)物中篩選 二是與受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)（合理新藥設(shè)計(jì)） 合理藥物設(shè)計(jì)（Rational drug design）則是基于受體三維立體結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)，通過計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)全程合成新分子。 現(xiàn)今從生物中篩選新藥重點(diǎn)放在微生物 人們也開始關(guān)注植物、動(dòng)物 人類和動(dòng)物方面，則關(guān)注自身免疫系統(tǒng) 新藥的研究與開發(fā)是一個(gè)將化學(xué)結(jié)構(gòu)

6、研究與生物活性研究連接起來的創(chuàng)造性過程。,第四節(jié) 生物藥物的發(fā)展歷史和概況,生物制藥的發(fā)展歷史 李時(shí)珍本草綱目 醫(yī)生琴納（Jenner ）發(fā)明了用牛痘疫苗治療天花 1860年，巴斯德發(fā)現(xiàn)細(xì)菌，開創(chuàng)了第一次藥學(xué)革命 1928年英國(guó)弗萊明發(fā)明青霉素至1941年在美國(guó)開發(fā)成功。 從生物體內(nèi)分離純化酶制劑的技術(shù)日趨成熟，酶類藥物得 到廣泛應(yīng)用。 70年代Zenk 應(yīng)用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)植物藥物 50年代提出的DNA 雙螺旋理論及70年代發(fā)展的重組DNA,技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)使生物制藥進(jìn)入一嶄新的時(shí)代 1982年，第一個(gè)基因工程藥物人胰島素上市 另一重大認(rèn)識(shí)就是認(rèn)識(shí)到生物多樣性對(duì)生物制藥的決定性 在基因工

7、程和細(xì)胞工程技術(shù)方面的研究水平與國(guó)外水平相比差距已不大，國(guó)內(nèi)已建立了40多個(gè)臨床藥理試驗(yàn)基地。,二 生物制藥的發(fā)展概況 1 基因工程 所依托的基礎(chǔ)理論為Watson-Crick的DNA 模板學(xué)說、Monod和Jacob的操縱子學(xué)說。,（1）基因工程藥物品種的開發(fā) （2）應(yīng)用基因工程技術(shù)建立新藥的篩選模型 （3）應(yīng)用基因工程技術(shù)改良菌種 （4）基因工程技術(shù)在改進(jìn)藥物生產(chǎn)工藝中的應(yīng)用 （5）利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)、植物生產(chǎn)蛋白質(zhì)類藥物 （6）基因工程抗體在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用 抗體工程 細(xì)胞工程 奠定了細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞融合技術(shù)的理論基礎(chǔ) （1）單克隆抗體技術(shù) 生物導(dǎo)彈,（2）通過植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物 （3

8、）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 三 微生物工程 微生物工程也稱發(fā)酵工程 所采用的新技術(shù)主要應(yīng)用于3個(gè)方面： 工藝改進(jìn)、新藥研制和菌種改造。 微生物藥物： 即在微生物生命活動(dòng)過程中產(chǎn)生的具有生理活性（或稱藥理活性）的次級(jí)代謝產(chǎn)物及其衍生物。 有酶抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、受體拮抗劑、抗氧化劑。,四 酶工程,酶工程是酶學(xué)與化工技術(shù)二者結(jié)合的產(chǎn)物 第五節(jié) 生物制藥的發(fā)展趨勢(shì) 一 生物制藥中的新技術(shù) 1 大規(guī)模篩選的采用與創(chuàng)新 大規(guī)模篩選是大規(guī)模測(cè)試化合物的方法，采用機(jī)器人自動(dòng)尋找特殊生物靶，如某個(gè)細(xì)胞表面受體或一個(gè)代謝有關(guān)酶的抑制劑（拮抗劑）或激動(dòng)劑（興奮劑）的技術(shù)。 2 高效分離純化系統(tǒng)的采用 （1）固相化金屬親和層析

9、 （2）超擴(kuò)散層析,（3）灌注層析 BioCADworkstation （4）其他快速分離純化系統(tǒng) AKTA explorer快速化工工藝開拓系統(tǒng) Streamline擴(kuò)張柱床吸附技術(shù) 快速蛋白液相色譜（FPLC ） The biological system 高分辨生物分子純化而設(shè)計(jì)的層析系統(tǒng) 二 Human genome project，簡(jiǎn)稱 HGP 約10萬(wàn)個(gè)gene 30億對(duì)堿基,三 基因治療,基因治療從基因角度可以理解為將外來的基因?qū)爰?xì)胞，用正常的基因置換病源基因或補(bǔ)充缺失的基因，從而達(dá)到治療的效果。 基因治療的疾病有三類： 致死性遺傳性疾病 用過去的治療法很難根治的癌癥 愛滋病等

10、后天性疾病 RNA 病毒可望用RNA 酶消滅 圖1-4為用核酸酶（RNA 酶）,解決的問題：提供更多可供利用的基因 設(shè)計(jì)定向整合的載體：反轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒 人類將逐漸具備在原子水平解決問題和在基因水平上治療疾病的能力。 四 糖鏈工程 糖科學(xué)（Glycoscience）和糖鏈工程 即糖生物學(xué) 蛋白或糖脂類 對(duì)生態(tài)信息的傳遞起著重要的作用 糖類藥物,五 細(xì)胞因子類藥物,細(xì)胞因子是淋巴細(xì)胞來源的淋巴因子或巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞來源的單核因子、免疫系統(tǒng)中具有各種生物活性的一類因子的總稱。 對(duì)細(xì)胞因子的受體結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞因子糖鏈部分的結(jié)構(gòu)和功能也做了大量研究。,第二章 基因工程制藥,第一節(jié) 基因工程制藥概述

11、基因工程（Gene engineering），又稱重組DNA 技術(shù)。 它能使帶有支配各種各樣遺傳信息基因的DNA 片段越過不同生物間特異的細(xì)胞壁而組入到完全不同的生物體內(nèi)，定向的控制、修飾和改變生物體的遺傳和變異。 人胰島素（Insulin） 具有多種生物功能，維持血糖恒定，增加糖原、脂肪、某些氨基酸和蛋白質(zhì)的合成。 生產(chǎn)方式：一是分別在大腸桿菌中合成A 鏈和B 鏈，再在體外用化學(xué)方法連接兩條肽鏈組成胰島素。 另一種是用分泌型載體表達(dá)胰島素原。,2 人生長(zhǎng)激素 人生長(zhǎng)激素是人的垂體腺前葉嗜酸細(xì)胞分泌的一種非糖基化多肽激素。 刺激身體生長(zhǎng) hGH 對(duì)一些細(xì)胞的增殖和分化以及DNA 合成有直接效應(yīng)

12、。 干擾素（Interferon，IFN ） 同種細(xì)胞上具有廣譜抗病毒活性的蛋白質(zhì)，其活性的發(fā)揮又受細(xì)胞基因組的調(diào)節(jié)和控制，涉及RNA 和蛋白質(zhì)的合成。 本身不能直接滅活病毒，而是細(xì)胞在干擾素作用后產(chǎn)生出多種抗病毒蛋白，從而阻斷病毒的繁殖。,分為a b t三型 基本特性包括種屬特異性、作用廣譜性和選擇性、相對(duì)無害性和特殊穩(wěn)定性。 抗細(xì)胞內(nèi)侵害微生物活性；抗細(xì)胞分裂活性；調(diào)節(jié)免疫功能活性。 用于治療惡性腫瘤和病毒性疾病 4 白細(xì)胞介素 白細(xì)胞介素是由白細(xì)胞或其他體細(xì)胞產(chǎn)生的又在白細(xì)胞間起調(diào)節(jié)作用和介導(dǎo)作用的因子，是一類重要的免疫調(diào)節(jié)劑。 激活并刺激T、B淋巴細(xì)胞的增殖和分化 刺激巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞

13、的活性,各種細(xì)胞的絲裂原 治療惡性腫瘤和病毒性疾病 5 集落刺激因子 是一類能參與造血調(diào)節(jié)過程的糖蛋白分子，又稱造血刺激因子或造血生長(zhǎng)因子。 分類：粒細(xì)胞集落刺激因子 巨噬細(xì)胞集落刺激因子 粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子 多能集落刺激因子 功能：刺激造血細(xì)胞增殖、維系細(xì)胞存活、分化 定型、刺激終末細(xì)胞的功能活性 臨床多用作癌化療的輔助藥物,6 促紅細(xì)胞生成素 腎臟分泌的重要激素 與多種貧血尤其與終末期腎臟疾病貧血密切相關(guān) 能促進(jìn)紅細(xì)胞系列的增殖、分化及成熟 治療慢性腎功能衰竭引起的貧血和治療腫瘤化療后貧血 7 腫瘤壞死因子 除具有抗腫瘤外，還有抗炎活性，促凝血活性，促進(jìn)細(xì)胞因子分泌，免疫調(diào)節(jié)作用

14、，抗病毒、細(xì)菌和真菌作用，熱原質(zhì)以及參與骨質(zhì)重吸收 淋巴細(xì)胞毒素 8 組織型纖溶酶原激活劑 tPA是一種絲氨酸蛋白酶，能激活纖溶酶原生成纖熔酶，纖溶,酶水解血凝塊中的纖維蛋白網(wǎng)，導(dǎo)致血栓溶解。 主要用于治療血栓性疾病 9 心鈉素 較強(qiáng)的利鈉、利尿、擴(kuò)張血管和降低血壓 治療充血性心臟衰竭、高血壓、腎功能衰竭、水腫、氣喘 10 重組乙肝疫苗 美、法和德國(guó)都已研制出人工合成的前S多肽疫苗，具有很強(qiáng)的免疫原性 由化學(xué)合成的H BsAg多肽與破傷風(fēng)類毒素偶聯(lián)形成復(fù)合蛋白分子制成的疫苗,第二節(jié) 基因工程制藥中常用的 工具酶和克隆載體,一 常用工具酶 1 限制酶 它們對(duì)堿基作用的專一性上及對(duì)磷酸二酯鍵的斷裂

15、方式上具有一些獨(dú)特的性質(zhì) 種類：I型酶 II型酶：簡(jiǎn)單的單功能酶，作用時(shí)無需輔助因子或只需Mg2+ ，能識(shí)別雙鏈DNA 上特異的核苷酸序列，底物作用的專一性強(qiáng)，而且其識(shí)別序列與切斷序列相一致。 限制酶的命名 以寄主微生物屬名的第一個(gè)字母（大寫）和種名的前兩個(gè)字母（小寫）寫成斜體字的3 個(gè)字母,縮寫，菌株名以非斜體符號(hào)加在這三個(gè)字母的后面。若同 一菌株中有幾種不同的限制酶時(shí)，則以羅馬數(shù)字加以區(qū)分。 例如 HindIII 限制酶的特性 （1）不同限制酶能專一地識(shí)別不同的特異核苷酸序列 （2）各種限制酶的識(shí)別序列都具有回文結(jié)構(gòu) 雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱排列 回文結(jié)構(gòu) 即正讀與反讀都相同 （3）各種限制酶的切割類

16、型是各式各樣的，切后形成各種 粘性末端或平整末端,錯(cuò)位切斷DNA -Cohesive ends Flush ends 識(shí)別序列不同的限制酶，切割后有可能產(chǎn)生相同的粘性末端。 同切口限制酶或同裂酶 在連接酶的作用下，可以得到嵌合DNA ，稱為異源二聚體。 來源不同的限制酶，其識(shí)別序列可以相同，但其切點(diǎn)位置可不 同或相同。 （4）某些限制酶在非標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，可能導(dǎo)致酶的識(shí)別序列特異性發(fā)生改變 在非標(biāo)準(zhǔn)條件下，每種限制酶都有上述嚴(yán)格的識(shí)別序列 導(dǎo)致限制酶的識(shí)別序列特異性發(fā)生改變，在DNA 內(nèi)產(chǎn)生附加切割。稱為限制酶的第2活性，又稱為星活性。,2 DNA 聚合酶,大腸桿菌DNA 聚合酶I （1）5-

17、3DNA 聚合酶活力 （2）5-3外切核酸酶活力 降解RNA ：DNA 雜交體的RNA 部分 （3）3-5外切核酸酶活力 主要功能是校對(duì)所合成的鏈?zhǔn)欠衲芘c模板精確無誤地配對(duì)在一起。 切口平移反應(yīng)：當(dāng)雙鏈DNA 的一條鏈產(chǎn)生缺口時(shí)，DNA 聚合酶I將脫氧核苷酸添加到3羥基末端上，與此同時(shí)，其5-3外切酶從切口的5磷酸末端切除原有核苷酸,使切口沿著DNA 平移,稱為切口平移反應(yīng),又稱為缺口翻譯。 以放射性脫氧核苷酸置換原來的脫氧核苷酸標(biāo)記DNA ，從而制作DNA 探針。,大片段即Klenow 片段是用枯草芽孢桿菌蛋白酶裂解完整的DNA 聚合酶I而產(chǎn)生或者通過克隆技術(shù)而得到的單一多肽鏈。 全酶中去除

18、了5-3外切核酸酶活力，而聚合酶活力及3-5外切核酸酶活力均不受影響。 補(bǔ)平限制酶切割DNA 后產(chǎn)生的3凹端 用32PdNTP 補(bǔ)平3凹端，對(duì)DNA 片段進(jìn)行末端標(biāo)記 在cDNA 克隆中，用于合成cDNA 第二鏈 應(yīng)用Sanger雙脫氧鏈末端終止法進(jìn)行DNA 測(cè)序 T4 噬菌體DNA 聚合酶 與Klenow 片段相似的是都具有5-3聚合酶活力及3-5外切核酸酶活力，而且3-5外切酶活力對(duì)單鏈DNA 的作用比對(duì)雙鏈DNA 更強(qiáng)。,經(jīng)修飾的T7 噬菌體DNA 聚合酶 更強(qiáng)的3-5外切核酸酶活力 DNA 平均長(zhǎng)度比其他聚合酶大得多 拷貝長(zhǎng)段模板 測(cè)序酶，測(cè)序酶（2.0版）完全喪失了核酸外切酶活力 T

19、aq DNA 聚合酶及AmpliTaqTM DNA 聚合酶 水生棲熱菌 具有5-3聚合酶活力和依賴于聚合作用的5-3外切核酸酶活力。 最佳作用溫度為75-80。C，為避免引物自模板上解離往往需在低于最適溫度條件下起始聚合反應(yīng)。 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),反轉(zhuǎn)錄酶 鼠或禽反轉(zhuǎn)錄病毒 H活力 主要用于將 mRNA 轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA ，也可用于制備雜交用探針和標(biāo)記帶5突出端的DNA 片段。 DNA 連接酶 能將兩段DNA 拼接起來的酶叫DNA 連接酶。 T4噬菌體DNA 聚合酶 連接帶有匹配粘性末端的雙鏈DNA 連接平整末端的雙鏈DNA,大腸桿菌DNA 連接酶 需NAD 輔助因子 基因工程中常用的其他酶 末

20、端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（簡(jiǎn)稱末端轉(zhuǎn)移酶或TDT酶） 作用底物是帶3羥基端的單鏈DNA 或帶3羥基突出端的雙鏈DNA 。 主要用于給載體或cDNA 加上互補(bǔ)的同聚尾以及用32P 標(biāo)記的一種d NTP 來標(biāo)記DNA 片段的3端。 T4噬菌體多核苷酸激酶 它能催化ATP 的-磷酸基轉(zhuǎn)移至去磷酸化的DNA 或RNA 的5末端 該酶可用于標(biāo)記DNA 5末端,核酸酶 BLA31核酸酶 主要活力是3外切核酸酶活力，DNA 內(nèi)切酶活力 反應(yīng)絕對(duì)依賴于鈣離子 （1）通過可控方式去除雙鏈DNA 的末端核苷酸從而縮短DNA 分子 （2）用于確定DNA 小片段的限制酶切圖 S1核酸酶 單鏈特異性的內(nèi)切酶 可降解單鏈DNA

21、 或RNA （1）去除DNA 片段中突出的單鏈尾部 （2）打開從 mRNA 合成雙鏈cDNA 時(shí)產(chǎn)生的發(fā)夾環(huán),堿性磷酸酯酶 細(xì)菌堿性磷酸酯酶（BAP ）和牛小腸堿性磷酸酯酶（CIP ）兩種 催化去除單鏈或雙鏈DNA 和RNA 分子中的5-磷酸基（脫磷酸作用） 去除切割載體DNA 兩端的5-磷酸基，防止自身環(huán)化 二 常用的克隆載體 具有在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行自我復(fù)制的DNA 子就是外源DNA 片段（基因）的運(yùn)載體，又可稱為分子載體或無性繁殖載體。 有了復(fù)制子作為外源DNA 的載體 質(zhì)粒 質(zhì)粒（Plasmid ）是一些存在于微生物細(xì)胞內(nèi)染色體外的閉合環(huán)狀 雙鏈的小型DNA 分子。,質(zhì)粒載體的改造和構(gòu)建 特性

22、 （1）要有復(fù)制子 （2）要有能促進(jìn)外源DNA 高水平表達(dá)的調(diào)控區(qū)，如含有強(qiáng)啟動(dòng)子 （3）要有多種限制酶的單一切點(diǎn) （4）具有兩種以上易被檢測(cè)的選擇性遺傳標(biāo)記，作為對(duì)重組與非重組轉(zhuǎn)化體的選擇標(biāo)記（最好有一個(gè)具有插入性失活功能）。 （5）質(zhì)粒載體DNA 的分子量要盡可能小，以利于載體容納較長(zhǎng)區(qū)段外源DNA 片段。 （6）應(yīng)屬于松弛型復(fù)制 （7）質(zhì)粒載體應(yīng)為非傳遞性，有較小的宿主范圍，不為傳遞性載體所誘導(dǎo)。,階段 （1）將選擇標(biāo)記引入含有pMB I或ColE1復(fù)制子的質(zhì)粒中 pBR322 僅4.36kb （2）調(diào)整質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)，提高質(zhì)粒載體的效率 新型載體都引入一個(gè)人工合成的由多種常用限制酶單一

23、識(shí)別序列組成的多克隆位點(diǎn)或多聚接頭。 （3）引入多種用途的輔助序列，構(gòu)建具有某些特化功能的質(zhì)粒載體 構(gòu)建可用組織化學(xué)方法鑒定重組克隆的質(zhì)粒載體 如pUC 載體帶有一個(gè)Lac操縱子的DNA 片段，該區(qū)段編碼b-半乳糖苷酶氨基端的一個(gè)片段，該片段能與宿主細(xì)胞所編碼的缺陷型b-半乳糖苷酶實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ)。外源DNA插入載體的多克隆位點(diǎn)后，可使酶的氨基端片段失活而破壞這種互補(bǔ)作用，導(dǎo)致帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌在含有誘導(dǎo)物IPTG和生色底物X-gal培養(yǎng)基上產(chǎn)生白色菌落，從而可用肉眼鑒定重組克隆。,構(gòu)建帶有單鏈?zhǔn)删w復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒載體 可大量獲得載體DNA 雙鏈中的一條鏈 構(gòu)建帶有噬菌體啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體 體外得

24、以轉(zhuǎn)錄RNA 而翻譯 構(gòu)建可對(duì)重組克隆進(jìn)行正選擇的質(zhì)粒載體 某些宿主菌致死的基因產(chǎn)物 構(gòu)建含有強(qiáng)啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體 常用的幾種質(zhì)粒載體 （1）pBR322 及其衍生載體 非必需區(qū)域，分子量相對(duì)較大，能被Colk 帶動(dòng)轉(zhuǎn)移 有關(guān)轉(zhuǎn)移的mob 區(qū)段剛好在非必需區(qū)域內(nèi),pAT153載體 之間缺失2個(gè)片段 包含結(jié)合轉(zhuǎn)移的有關(guān)序列 pBR327載體 （2）pUC系列載體 pUC18、 pUC19質(zhì)粒載體 pUC質(zhì)粒缺乏與控制拷貝數(shù)有關(guān)的rop 基因，故這些質(zhì)粒復(fù)制的拷貝數(shù)要比帶有pMB1或ColE1復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒高得多。 PUC118 、pUC119質(zhì)粒載體 帶有M13 絲狀噬菌體DNA 合成的起始、終止

25、及DNA 包裝進(jìn)入噬菌體顆粒所必需的序列。,這些質(zhì)粒的宿主細(xì)胞被適當(dāng)?shù)慕z狀噬菌體感染時(shí)，可合成質(zhì)粒 DNA 中一條鏈，并能將此單鏈DNA 包裝進(jìn)入子代噬菌體。 pUC 的衍生質(zhì)粒載體 噬菌體編碼的依賴于DNA 的RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄單位的啟動(dòng)子 噬菌體 噬菌體載體的構(gòu)建 噬菌體基因組為雙鏈線狀DNA 感染時(shí)，DNA 的兩末端配對(duì)并由連接酶的作用閉合成環(huán)狀 （1）A至J區(qū)段：分布在基因組左臂，約占1/3基因組。 噬菌體頭部（A-F ）、尾部（Z-J ） （2）J至N之間非必需區(qū)段：約占1/3基因組 控制重組及溶源性的基因，可被消除和取代,（3）N 至R 區(qū)段：分布在基因組右臂，與噬菌斑的形成有關(guān)。

26、 包括調(diào)控及免疫性基因、DNA 復(fù)制基因、轉(zhuǎn)錄和裂解基因等。 消除多余限制性內(nèi)切酶位點(diǎn) 消除基因組必需區(qū)內(nèi)的酶切位點(diǎn)，保留非必需區(qū)內(nèi)1-2個(gè)位點(diǎn) 方法：點(diǎn)突變、基因組的置換和缺失 去除DNA 中一些非必需區(qū)段 有75 %-105 % 38-52 kb DNA 才能被包裝成噬菌體顆粒 插入型載體 DNA 基因組中缺失部分非必需基因，只含有一個(gè)可供外源DNA 插入的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的DNA 載體。,替換型載體 在DNA 的可替換片段兩端具有兩個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，酶切后替換片段與帶有所有必需基因的左右雙臂分開，有外源DNA 代之。 攜帶外源DNA 的重組體的正選擇標(biāo)記。 提高載體在生物學(xué)防護(hù)上的安全

27、性，引入了WES三個(gè)基因的琥珀突變，這些特性使從實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中逃逸出重組噬菌體的可能性大大降低。 Charon16A 載體的基因A 和B 上誘變產(chǎn)生了琥珀突變。 結(jié)果在含有色原底物Xgal和Lac-指示菌的平板培養(yǎng)基上形成無色的噬菌斑。 常用載體 （1）Charon系列載體 Charon40 載體是專門設(shè)計(jì)用來容納大片段,（2）EMBL系列載體 EMBL3 、EMBL4 對(duì)稱的兩個(gè)多酶位點(diǎn)聚合接頭序列 EMBL3A 帶有兩個(gè)琥珀突變，可篩選出SUPF（琥珀抑制基因）相聯(lián)的DNA 序列。 構(gòu)建基因文庫(kù) （3）gt系列載體 為插入型系列載體，包括gt10、pgt11、gt18-23等 gt10：專門

28、為在其免疫區(qū)（imm434 ？）內(nèi)單一的EcoR I位點(diǎn)上克隆小的cDNA 片段（約6kb）而設(shè)計(jì)的。 阻遏子基因CI，CI基因失活形成了重組的CI-噬菌體，噬菌斑為清亮斑，可與非重組的CI-噬菌體所產(chǎn)生的陰暗噬菌斑相區(qū)別。,gt11：是一個(gè)常用的，可用于免疫學(xué)篩選的載體。 如果插入的DNA 片段方向正確且轉(zhuǎn)譯讀框與LacZ基因一致，則重組噬菌體能在宿主菌內(nèi)指導(dǎo)b-半乳糖苷酶。 含有對(duì)溫度敏感的阻遏子（43。失活），可作為抗溶源性生長(zhǎng)的選擇性。 M13 噬菌體 M13 噬菌體的基本特性 基因組為環(huán)狀單鏈DNA 分子 雄性專一性，即只吸附于帶有F質(zhì)粒的雄性大腸桿菌（F+）的性纖毛 上而引起感染。

29、 轉(zhuǎn)換成雙鏈復(fù)制型（RF ） 在基因3產(chǎn)物的作用下，以單鏈DNA 為模板，先從一個(gè)RNA 引物開始， 通過宿主DNA 聚合酶III延伸，合成雙鏈DNA（RFDNA ）。 然后在基因2,產(chǎn)物作用下RFDNA 進(jìn)行復(fù)制，每個(gè)細(xì)胞可產(chǎn)生50-100 RFDNA 拷貝。由基因5產(chǎn)生的M13 單鏈結(jié)合蛋白與通過滾環(huán)復(fù)制合成的DNA 單鏈結(jié)合并進(jìn)行包裝形成子代噬菌體。 通過細(xì)胞壁擠出，并不殺死細(xì)胞 細(xì)胞生長(zhǎng)速率降低，并不斷釋放子代噬菌體繼續(xù)感染周圍細(xì)胞 在平板上不形成空斑，形成緩慢生長(zhǎng)的慢性感染細(xì)胞圈 M13絲狀噬菌體載體的構(gòu)建 將含有大腸桿菌乳糖操縱子調(diào)節(jié)區(qū)段和編碼b-半乳糖苷酶基因的頭145個(gè)密碼插入

30、這個(gè)區(qū)的酶切位點(diǎn)，得M13 mp1，可被轉(zhuǎn)譯為多肽。 多肽雖然沒有酶活力，但當(dāng)M13 mp1感染特殊的宿主菌JM103時(shí)，會(huì)導(dǎo)致多互補(bǔ)而產(chǎn)生有活性的b-半乳糖苷酶，在含有誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基上形成藍(lán)色噬菌斑。 這兩個(gè)載體對(duì)于具有兩個(gè)不同酶切位點(diǎn)末端的外源DNA片段，可通過強(qiáng)制克隆而定向連接。,常用的M13 噬菌體載體 M13 mp18、M13 mp19 LacZ區(qū)內(nèi)的多克隆位點(diǎn)中都含有13個(gè)不同的酶切位點(diǎn) 兩個(gè)載體不會(huì)輕易自身再環(huán)化 外源DNA 在M13 mp18、M13 mp19中以兩個(gè)互為相反的方向插入 pBR322質(zhì)粒載體的復(fù)制起點(diǎn)（Ori）和氨芐青霉素抗性基因（Ampr） 粘粒 粘粒是一種有

31、噬菌體粘性末端的雜種質(zhì)粒，由DNAcos區(qū)與質(zhì)粒DNA 重 組構(gòu)建而成。 是為克隆和增殖基因組DNA 的大片段而設(shè)計(jì)的和組建真核生物基因文庫(kù) 最大DNA 可達(dá)52kb，粘粒大小為4-7kb，適宜35-45kb cosDNA 序列（將DNA 包裝到噬菌體顆粒中所必需的序列），攜有一個(gè)復(fù),制起點(diǎn)（通常是ColE1復(fù)制起點(diǎn)）和一個(gè)抗藥性標(biāo)記（通常是Ampr ）。 將兩個(gè)cos位點(diǎn)組合到同一個(gè)粘粒載體中，從而大大簡(jiǎn)化在粘粒載體 中的定向克隆。 哺乳動(dòng)物細(xì)胞載體系統(tǒng) 一類是不帶真核復(fù)制子的質(zhì)粒型載體，是在原核質(zhì)粒中插入一個(gè)完整 的哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄單位和一個(gè)選擇標(biāo)記基因而組成的簡(jiǎn)單載體系統(tǒng)。 如 pTK2

32、、pHyg、pRSVneo 另一類是帶有真核病毒調(diào)控序列元件的質(zhì)粒表達(dá)載體。,第三節(jié) 基因工程藥物無性繁殖系的組建,目的基因的制取 構(gòu)建基因文庫(kù)法分離目的基因 1 用一種或兩種限制酶消化噬菌體替換型載體，選用適當(dāng)方法將載體左、 右臂與中間部位的填充片段分離開。 2 用一種或幾種限制酶部分消化高分子量的真核基因組DNA ，再用凝膠電 泳或密度梯度離心法分離出適宜長(zhǎng)度的DNA 。 3 噬菌體載體臂與真核DNA 片段連接成較長(zhǎng)的多聯(lián)體，再利用體外包裝系 統(tǒng)裝入噬菌體頭部，成為有感染力的噬菌體。 4 重組噬菌體通過在大腸桿菌中生長(zhǎng)而得以繁殖，所獲得的基因組DNA 文 庫(kù)可被長(zhǎng)時(shí)間利用和貯存 酶促合成法

33、制取目的基因 平均每個(gè)細(xì)胞約含10-5 g總RNA,Mrna 總RNA 的1 %-5 % 從某些特定型別的分化細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中，編碼某特種蛋白質(zhì)的目 mRNA 占總 mRNA 的50 %-90 %，稱為高豐度 mRNA 。 低豐度 mRNA 或稀有 mRNA 真核細(xì)胞的 mRNA 分子在其3端均有一多聚腺苷酸poly（A），20-250個(gè)殘基組成的尾，可吸附于寡脫氧胸苷酸-Oligo（dT ）纖維素。 構(gòu)建cDNA 文庫(kù) P T-PCR 法 從構(gòu)建的cDNA 文庫(kù)中篩選目的cDNA （1）真核細(xì)胞總RNA 的分離 釋放的內(nèi)源性RNA 酶（Rnase）的活力 外源性Rnase對(duì)RNA 制品的污染,硫

34、氰酸胍提取和氯化銫離心法 鹽酸胍和有機(jī)溶劑提取法 （2）帶poly（A ）的RNA- mRNA 的分離純化與分析 常用Northern雜交（RNA 印跡法）測(cè)定總RNA 或poly（A ）RNA 樣品中特 定 mRNA 分子的大小和豐度。 （3）cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建 cDNA 第一鏈的酶促合成 禽源和鼠源反轉(zhuǎn)錄酶 cDNA 第二鏈的合成 自身引導(dǎo)法：雜交體變性而分開后，單鏈cDNA 端能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)而引導(dǎo)E.coliDNA 聚合酶I Klenow 片段酶促合成cDNA 第一鏈。 置換合成法：利用cDNA：mRNA 雜交體為切口平移的模板，由RNA 酶 H在 mRNA 鏈上造成切口和缺口而產(chǎn)生

35、一系列RNA 引物，再由DNA 聚,合酶I 用這些引物以切口平移反應(yīng)合成cDNA 第二鏈。 雙鏈cDNA 載體DNA 的連接 噬菌體體外包裝及感染構(gòu)建cDNA 文庫(kù) 目的cDNA 克隆的篩選 核酸雜交法 特異性抗原的免疫學(xué)檢測(cè)法 cDNA 克隆的同胞選擇法 R T-PCR 法合成目的cDNA 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 從真核生物細(xì)胞中提取純化總RNA 在Oligo(dT )的引導(dǎo)下,以總RNA 中的總 mRNA 為模板,在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下,合成總cDNA 的第一鏈,以兩個(gè)引物所結(jié)合的單鏈cDNA (靶序列)為模板,在Taq 聚合酶的作用下進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,合成雙鏈目的cDNA (1)聚合酶鏈?zhǔn)椒?/p>

36、應(yīng)（PCR ）體外擴(kuò)增DNA 技術(shù) Polymerase chain reaction 應(yīng)用該技術(shù)可在很短的時(shí)間內(nèi)得到數(shù)百萬(wàn)個(gè)特異DNA 序列的拷貝 宏觀與微觀的聯(lián)系 PCR 技術(shù)的基本原理：首先使雙鏈DNA 在反應(yīng)液中熱變性而分開成單 鏈，然后在低溫下與兩個(gè)引物進(jìn)行退火，使引物與單鏈DNA 配對(duì)結(jié)合 ，再在中溫下利用Taq DNA 聚合酶的聚合活性及熱穩(wěn)定性進(jìn)行聚合（ 延伸）反應(yīng)。每經(jīng)過一次變性、退火、延伸三個(gè)步驟為一個(gè)循環(huán)，通 過三個(gè)溫度的不同循環(huán)。,PCR 反應(yīng)體系的組成 a. 含靶序列的DNA 需用0.2-2g 基因組DNA b. 寡核苷酸（引物） 20-24個(gè)核苷酸 1 mol/ L

37、 盡量選擇堿基隨機(jī)分布的序列 GC含量盡可能接近50 % 避免因較長(zhǎng)的互補(bǔ)序列而形成引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu) 使其5端帶一罕有的限制酶序列，使擴(kuò)增產(chǎn)物既含有目標(biāo)序列，兩側(cè) 又帶有限制酶切位點(diǎn)。 Taq DNA 聚合酶 工程酶（AmpliTaqTM ） 酶量為1-5u,d. 四種d NTP 50-200 mol/ L PCR緩沖液 10 mmol/ L Tris HCl（pH 8.3 ，于室溫） 1.5 mmol/ L MgCl2 Mg2+ 為1.5 mmol/ L PCR 體外擴(kuò)增DNA 操作過程 PCR 自動(dòng)擴(kuò)增儀 （2）PCR 擴(kuò)增由 mRNA 反轉(zhuǎn)錄而成的cDNA 上游寡核苷酸引物 下游寡核

38、苷酸引物,DNA 體外重組是將目的基因（外源DNA 片段）用DNA 連接酶在體 外連接到合適的載體DNA 上，這種重新組合的DNA 稱為重組DNA ，簡(jiǎn)稱 重組體。 目的基因DNA 與質(zhì)粒載體DNA 的連接 定向克隆法 當(dāng)用兩種不同的限制酶（如用BamH I和Hind III）消化外源DNA 時(shí)，可以產(chǎn)生帶有非互補(bǔ)突出末端的外源DNA 片段。 排阻凝膠層析 以便與切下來的小片段分開 避免使用在多克隆位點(diǎn)上彼此直接相鄰的限制酶切位點(diǎn) 粘性末端連接法 質(zhì)粒載體和外源DNA 都可能發(fā)生自身環(huán)化或形成串聯(lián)寡聚物 用堿性磷酸酶去除線狀載體DNA 兩端的5磷酸基團(tuán)以盡量減少載,目的基因與克隆載體的體外重組

39、,體DNA 的自身環(huán)化或連接。 經(jīng)去磷酸化的載體DNA 仍然可有效的與具有5末端磷酸的外源DNA 相連接，產(chǎn)生含有兩個(gè)切口的環(huán)狀重組DNA 分子，可直接轉(zhuǎn)化并由宿主菌 修復(fù)切口。 這種帶切口的環(huán)狀DNA 的轉(zhuǎn)化效率比線狀DNA 高得多 應(yīng)含有足量的載體DNA 平端連接法 平整末端連接屬于低效反應(yīng) 極高濃度的T4 噬菌體DNA 連接酶 高濃度的平整末端外源DNA 和質(zhì)粒DNA 低濃度（0.5 mmol/ L）的ATP 不存在亞精胺一類的多胺,適量的凝聚劑 快速克隆法 需從純化的凝膠中回收含目的條帶的瓊脂糖塊，熔化后直接進(jìn)行 質(zhì)粒載體和外源DNA 的連接。 同聚物加尾法 末端轉(zhuǎn)移酶可催化dNTP

40、加到單鏈或雙鏈DNA 3羥基端的能力，在 目的DNA 和質(zhì)粒載體上加入互補(bǔ)同聚物，兩者在通過互補(bǔ)同聚物之間氫 鍵形成可轉(zhuǎn)化大腸桿菌的開環(huán)重組分子。 采用GC加尾，即將dC殘基加到雙鏈cDNA 上，而將互補(bǔ)的dG殘基加到 用Pst I消化的質(zhì)粒載體上。 加合成接頭或銜接頭法,合成接頭是化學(xué)合成的兩個(gè)自相互補(bǔ)的核苷酸寡聚體（8-12bp ）而 兩個(gè)寡聚體可形成帶一個(gè)或一個(gè)以上限制酶切位點(diǎn)的平整末端雙鏈體。 第一次反應(yīng)是使平整末端的雙鏈接頭與平整末端的目的DNA 相連 第二次連接反應(yīng)則是將加上接頭的目的DNA 片段與帶有匹配粘性末端 的載體DNA 相連接。 銜接頭與接頭不同，它是一小段帶有一個(gè)平整末

41、端（與雙鏈DNA 連接 ）和一個(gè)粘性末端（與載體的相應(yīng)末端連接）的雙鏈寡核苷酸。 其他轉(zhuǎn)換末端形式連接法 （1）部分補(bǔ)平3凹端 （2）完全補(bǔ)平3凹端 （3）除3突出端,目的基因DNA 與噬菌體載體DNA 的連接 （1）用于構(gòu)建真核基因組DNA 文庫(kù) （2）用于構(gòu)建復(fù)雜的cDNA 文庫(kù) （3）用于亞克隆在粘性載體中增殖的外源目的DNA 序列 噬菌體載體臂DNA 的制備 酶切后將填充片段從載體臂中除去 用堿性磷酸酶處理酶切載體片段 用雙酶切割載體 （1）常用蔗糖或氯化鈉密度梯度離心法，也有用0.5 % 瓊脂糖凝膠制 備電泳純化載體臂。 （2）用堿性磷酸酶處理噬菌體臂,末端的5磷酸基團(tuán) 這樣能夠有效

42、的防止自身環(huán)化。并降低載體左右臂連接以后所形成 的非重組載體的數(shù)目。 用堿性磷酸酶處理之前一定要使噬菌體臂的粘性末端退火并連接， 否則將抑制噬菌體多聯(lián)體的形成，使下一步的包裝效率大大降低。 （3）用雙酶消化噬菌體載體 噬菌體載體臂與外源目的DNA 片段的連接 一個(gè)是載體臂與外源DNA 片段的比例 另一個(gè)是這兩種DNA 片段在連接反應(yīng)混合液中的濃度 一般都必須進(jìn)行連接預(yù)試驗(yàn)，以檢查其效率,以微生物（主要有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌） 受體細(xì)胞是指在轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)（感染）中接受外源基因的宿主細(xì)胞 （1）成感受態(tài)細(xì)胞 （2）應(yīng)為限制酶缺陷型 （3）一般應(yīng)為DNA 重組缺陷型 （4）不適于在人體內(nèi)或在

43、非培養(yǎng)條件下生存 （5）它的DNA 不易轉(zhuǎn)移，重組載體DNA 只在宿主中復(fù)制 大腸桿菌K12的突變型H B101和C600等作為當(dāng)前重組DNA 的主要受 體菌。 把帶有目的基因的重組質(zhì)粒DNA 引入受體細(xì)胞的過程稱為轉(zhuǎn)化。 將重組噬菌體DNA 直接引入受體細(xì)胞的過程稱為轉(zhuǎn)染。,重組克隆載體引入宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化與感染,重組噬菌體DNA 被包裝到噬菌體頭部成為有感染力的噬菌體顆粒， 再以此噬菌體為運(yùn)載體，這一過程稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)，通常稱為感染。 重組質(zhì)粒DNA 引入大腸桿菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 感受態(tài)：細(xì)菌吸收轉(zhuǎn)化因子（DNA ）的生理狀態(tài)，細(xì)菌在體溫下經(jīng) CaCl2 溶液處理，再做短暫加熱后，會(huì)使受體細(xì)菌中誘導(dǎo)產(chǎn)生

44、出一種短 暫的感受態(tài)。 在此期間他們能夠攝取各種不同來源的DNA 原生質(zhì)體化假說和酶受體假說 用氯化鈣制備新鮮感受態(tài)細(xì)胞及重組質(zhì)粒DNA 的轉(zhuǎn)化 存于-70C， 貯存時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)在一定程度上影響轉(zhuǎn)化效率,用復(fù)合劑制備新鮮或冷凍的感受態(tài)細(xì)胞及重組質(zhì)粒DNA 的轉(zhuǎn)化 二價(jià)陽(yáng)離子（MnCl2 和CaCl2 ）中更長(zhǎng)時(shí)間，并且用氯化六氨合高鈷、 D M S O 、DTT（二硫蘇糖醇）等試劑復(fù)合處理細(xì)菌可提高轉(zhuǎn)化效率。 高壓電穿孔轉(zhuǎn)化法（電轉(zhuǎn)化法） 重組噬菌體DNA 的體外包裝與感染 用噬菌體突變株（參與包裝的基因發(fā)生突變）感染適當(dāng)細(xì)菌，再?gòu)母?染細(xì)菌中制備包裝提取物。用此提取物對(duì)完整的噬菌體DNA 進(jìn)行

45、體外包裝。 包裝提取物的制備 （1）用兩個(gè)不同的溶源性菌株制備包裝提取物 BHB2690菌株，用超聲破碎法處理制備含前頭部的包裝提取物 BHB2668菌株，用凍融裂菌法處理，制備含D蛋白和其他必需成分的包 裝提取物。,大腸桿菌C菌株的非抑制性溶源菌SMR10 內(nèi)源性噬菌體DNA 的COS 位點(diǎn)缺失，不能被A蛋白識(shí)別因而不能插入前 頭部?jī)?nèi)，而帶有COS 位點(diǎn)的外源DNA 則可被A蛋白識(shí)別并被插入前頭部，包 裝過程可繼續(xù)進(jìn)行，產(chǎn)生感染性噬菌體顆粒。 大腸桿菌C菌株缺少EcoK 限制系統(tǒng)，在包裝過程中使含有未經(jīng)修飾的 EcoK 識(shí)別位點(diǎn)的外源DNA 免受限制系統(tǒng)作用。 重組噬菌體DNA 的體外包裝與

46、感染 （1）用兩種不同的提取物進(jìn)行體外包裝和感染 （2）用一種提取物進(jìn)行體外包裝和感染 重組克隆載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染 DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染 利用Polybrene的DNA 轉(zhuǎn)染 利用原生質(zhì)體融合的DNA 轉(zhuǎn)染,（2）只用一個(gè)溶源性菌株制備包裝提取物,電穿孔法DNA 轉(zhuǎn)染 受體細(xì)胞的型別、不同的培養(yǎng)細(xì)胞系、其攝取和表達(dá)外源DNA 的能力 相差達(dá)幾個(gè)數(shù)量級(jí)。 （1）磷酸鈣和DNA 共沉淀物轉(zhuǎn)染法 重組載體以磷酸鈣-DNA 共沉淀物形式出現(xiàn)，培養(yǎng)細(xì)胞攝取DNA 的能 力將顯著提高。 最佳鈣離子濃度為125 mmol/L，最佳DNA 濃度為5-30g/ ml 沉淀反應(yīng)最佳

47、時(shí)間為20-30 min 細(xì)胞在沉淀物中的最佳暴露時(shí)間為5-42h （2）DEAE- 葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法 這一聚合物 可能與DNA 結(jié)合從而抑制核酸酶的作用， 或者與細(xì)胞結(jié)合從而促進(jìn)DNA 的內(nèi)吞作用,DEAE-葡聚糖的濃度及細(xì)胞暴露于DNA / DEAE-葡聚糖混合液的時(shí)間是兩個(gè)大大影響本法效率的重要參數(shù)。 （3）利用Polybrene的DNA 轉(zhuǎn)染法 （4）利用原生質(zhì)體融合的DNA 轉(zhuǎn)染法 用于克隆化目的基因的瞬時(shí)表達(dá) 用于建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系 轉(zhuǎn)染效率較高 （5）電穿孔法DNA 轉(zhuǎn)染 受外加電場(chǎng)強(qiáng)度、電泳沖長(zhǎng)度、溫度、DNA的構(gòu)象和濃度、培養(yǎng)液的離子成分的影響。,含目的基因重組的篩

48、選、鑒定與分析,重組體（菌）的篩選 抗生素抗性基因插入失活法 用某種限制酶消化并在此位點(diǎn)插入外源目的DNA 時(shí)，抗藥性基因不在 被表達(dá)，稱為基因插入失活。 b-半乳糖苷酶基因插入失活法 放射性標(biāo)記核酸探針雜交篩選法 優(yōu)點(diǎn)：具有高度的特異性和敏感性 它不要求插入的外源基因表達(dá) 先在一種固體支持膜（如硝酸纖維素濾膜、尼龍膜和Whatman541濾紙） 上原位裂解待篩選的細(xì)菌菌落并使釋放出的DNA 固定于膜上，然后在溶液 中與放射性標(biāo)記的核酸探針雜交，從而很容易的同時(shí)篩選大量菌落，從中 找出帶有含目的基因重組質(zhì)粒的菌落。 （1）切口平移法,（2）引物延伸法 純化的DNA 與過量的隨機(jī)引物相混合，煮沸

49、變性，然后用E。coliDNA 聚合酶I的Klenow 片段進(jìn)行合成 （3）體外轉(zhuǎn)錄合成RNA 探針 一種是合成可與克隆于M13 噬菌體載體上的序列互補(bǔ)的單鏈DNA探針 另一種是將克隆于特定載體的靶序列轉(zhuǎn)錄成RNA 探針 只需要不含RNA 酶的DNA 酶I便可容易的除去DNA 模板 RNA 探針與DNA 和RNA 形成的雜交體更穩(wěn)定也不會(huì)被Rnase消化，可用 該酶除去非特異結(jié)合的探針。 （4）cDNA 探針的合成 一種是用Oligo（dT）做引物 另一種則采用隨機(jī)引物,某一特定序列的濃度得以提高。 （5）合成寡核苷酸探針 將菌落或噬菌斑原位轉(zhuǎn)移或影印到硝酸纖維素濾膜上 裂解菌落或噬菌體并使釋

50、放的DNA 原位結(jié)合與濾膜上 扣除雜交的方法，制取單鏈標(biāo)記cDNA 吸收探針，使cDNA 探針中 固定于濾膜上的細(xì)菌DNA 或噬菌體DNA 與標(biāo)記探針進(jìn)行雜交 免疫化學(xué)篩選法 該法的特點(diǎn)是直接檢測(cè)克隆基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，故應(yīng)用該法時(shí) 必須事先制備針對(duì)該蛋白質(zhì)或多肽的抗血清或單克隆抗體，而最佳抗體應(yīng) 當(dāng)是與目的蛋白（抗原）不同表位反應(yīng)的一組單克隆抗體混合物，或者是 不與宿主成分反應(yīng)的高滴度多克隆抗體。,放射化學(xué)檢測(cè)制劑可用抗第一抗體種特異性決定簇的125I標(biāo)記抗抗體 或125I標(biāo)記金黃色葡萄球菌A 蛋白。 酶法檢測(cè)制劑可用與辣根過氧化物酶（H R P ）綴合的第二抗體或 與堿性磷酸酶（AP

51、）綴合的第二抗體形成不溶性有色沉淀。 重組體的鑒定 凝膠電泳鑒定法 標(biāo)準(zhǔn)方法 直接用溴化乙錠進(jìn)行染色以確定DNA 在凝膠中的位置，并直接與紫外 燈下觀察DNA 條帶。 應(yīng)有兩條帶：一條是泳動(dòng)速度較慢分子量較大的帶（相當(dāng)于質(zhì)粒載體DNA ） 另一條是泳動(dòng)速度較快分子量較小的帶（相當(dāng)于目的 基因DNA 片段）,平板裂解物法和液體培養(yǎng)法 Southern轉(zhuǎn)移雜交法 （1）瓊脂糖凝膠電泳分離重組DNA 的限制酶切片段 （2）將DNA 從瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持體上 硝酸纖維素濾膜或尼龍膜 毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法 真空轉(zhuǎn)移法 （3）放射性標(biāo)記探針與固著于膜上的DNA 雜交 基因產(chǎn)物鑒定法 常用體外轉(zhuǎn)譯法對(duì)基因產(chǎn)物

52、進(jìn)行鑒定。從細(xì)胞中提取的天然mRNA 或通 過克隆化的DNA在體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA，在無細(xì)胞提取液中能被翻譯而合成 蛋白質(zhì)，這些體外翻譯反應(yīng)產(chǎn)物可通過免疫沉淀或SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 加以分析鑒定，對(duì)原核生物的基因產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，常用大腸桿菌或枯草芽,胞苷菌無細(xì)胞系統(tǒng)，而對(duì)真核生物基因產(chǎn)物常用兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液或麥胚 提取物 重組DNA 的序列分析 一種是Sanger雙脫氧鏈終止法（酶法）測(cè)序 另一種是Maxam-Gilbert DNA 化學(xué)降解法測(cè)序 1 Sanger雙脫氧鏈終止法DNA 測(cè)序的主要試劑 （1）模板 （2）通用引物 （3）DNA 聚合酶I的Klenow 段、反轉(zhuǎn)錄酶、Taq

53、 DNA 聚合酶、測(cè)序酶、 測(cè)序酶2.0版 （4）采用32SdATP （5）采用諸如dITP或7-脫氮-dGTP,Sanger雙脫氧鏈終止法測(cè)序過程 一是退火反應(yīng)，即寡核苷酸引物與模板DNA 雜交 二是4組鏈延伸-鏈終止反應(yīng) 96孔U形孔微量滴定板中進(jìn)行 測(cè)序儀：P E公司推出的ABI PRISM310型全自動(dòng)DNA 測(cè)序儀 310型測(cè)序儀采用毛細(xì)管電泳技術(shù)取代傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠平板 電泳進(jìn)行DNA 測(cè)序分析，不僅具有DNA 測(cè)序、PCR 片段大小分析和定量分析功能，而且實(shí)現(xiàn)了全部操作自動(dòng)化，包括自動(dòng)灌膠、自動(dòng)進(jìn)樣、自動(dòng)數(shù)據(jù)收集分析。 377型測(cè)序儀采用四種熒光染料標(biāo)記、激光檢測(cè)的方法。,五

54、 目的基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá),基因表達(dá)在原核生物和真核生物中是有區(qū)別的，在原核生物中基因表 達(dá)是以操縱子形式進(jìn)行，磚錄是在核內(nèi)進(jìn)行，先生成hnRNA ，再加工去掉 內(nèi)含子，修飾5和3末端才形成mRNA 。而mRNA 只能在細(xì)胞漿的核糖體 中轉(zhuǎn)譯成多肽或蛋白質(zhì)，再經(jīng)加工、糖化、形成高級(jí)結(jié)構(gòu)。 原核細(xì)胞（主要是大腸桿菌） 真核細(xì)胞表達(dá)體系，如酵母與哺乳動(dòng)物細(xì)胞系 目的基因在原核細(xì)胞中的表達(dá) 在大腸桿菌中表達(dá)合成完整天然蛋白 在細(xì)菌中表達(dá)原核蛋白時(shí)，首先必須選擇帶有可調(diào)控的強(qiáng)原核啟動(dòng)子 的表達(dá)載體。 噬菌體PL啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子和T7噬菌體10啟動(dòng)子 從外部同時(shí)提供啟動(dòng)子和有效的核糖體結(jié)合位點(diǎn),起

55、始密碼子（ATG）和Shine-D-algarno序列，后者簡(jiǎn)稱SD序列 mRNA 上的SD序列與16SrRNA上的3端序列之間形成堿基配對(duì)，由此 帶動(dòng)核糖體與mRNA 的結(jié)合。 一種是可使克隆化目的基因表達(dá)為融合蛋白的一部分 融合蛋白由位于其氨基端的原核蛋白、能被蛋白酶或溴化氰裂解的序列以及目的蛋白三部分組成。 融合蛋白通常較穩(wěn)定，易于鑒定并可用作抗原，也可產(chǎn)生不含氨基端甲硫氨酸的蛋白 高效表達(dá) 由雙分子胰島素原組成 另一種是外源蛋白的分泌型表達(dá)系統(tǒng) 融合到編碼信號(hào)肽的DNA 中而實(shí)現(xiàn)的 可使蛋白質(zhì)按適當(dāng)方式折疊 通常產(chǎn)量不高,克隆化目的基因表達(dá)水平的提高與檢測(cè) RNA 不穩(wěn)定、過早終止、無

56、效翻譯及蛋白質(zhì)不穩(wěn)定 蛋白質(zhì)缺陷型菌株 在培養(yǎng)和收獲細(xì)胞期間使用蛋白酶抑制劑 通過提高目的蛋白的合成量加以克服 （1）運(yùn)用定點(diǎn)誘變技術(shù)使核糖體結(jié)合位點(diǎn)（SD 序列和起始密碼子ATG ） 周圍的堿基對(duì)發(fā)生突變。 （2）試用不同表達(dá)水平的大腸桿菌宿主菌株，如利用轉(zhuǎn)錄終止缺陷型菌株 或RNA 代謝突變株，可提高功能性RNA 的合成量。 （3）在目的基因DNA 的下游裝置一段DNA 序列 （4）通過改變溫度、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、啟動(dòng)子強(qiáng)度、質(zhì)?？截悢?shù)或誘導(dǎo)物 的量。,目的基因在真核細(xì)胞中的表達(dá) 原核細(xì)胞對(duì)真核生物活性蛋白不能進(jìn)行有效的翻譯后加工 包括二硫鍵形成、糖基化、磷酸化、寡聚體形成、特異性蛋白裂解

57、真核蛋白比活力都很低，與蛋白質(zhì)的折疊方式不正確或折疊效率低有關(guān) 真核細(xì)胞（如哺乳動(dòng)物細(xì)胞）表達(dá)系統(tǒng)可以分為兩類： 一類是采用病毒載體的表達(dá)系統(tǒng) 另一類是轉(zhuǎn)染DNA 的表達(dá)系統(tǒng) 克隆化的目的基因必須插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體并在細(xì)菌中克隆和復(fù)制擴(kuò) 增后才轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞。 用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中導(dǎo)入和表達(dá)克隆化目的基因的質(zhì)粒載體經(jīng)過改 造后既帶有與待表達(dá)基因序列5端和3端相匹配的限制酶切位點(diǎn)，又帶 有具備所需特異性的調(diào)控序列元件。 復(fù)制子、抗生素抗性基因、單一限制酶切位點(diǎn),（1）啟動(dòng)子與增強(qiáng)子 根據(jù)用于表達(dá)重組基因的細(xì)胞型別來決定 TATA 25-30bp 引導(dǎo)RNA 聚合酶II在正確位點(diǎn)上起始RNA 的

58、合成 100-200bp 決定轉(zhuǎn)錄起始的速率 SV40早期基因增強(qiáng)子 （2）加poly（A）信號(hào) 一種是位于poly（A）位點(diǎn)下游的GU 豐富區(qū)或U豐富區(qū) 另一種是位于poly（A）位點(diǎn)上游11-30個(gè)核苷酸的一段高度保守的六 核苷酸序列A A U A A A。 （3）剪接信號(hào) 在一級(jí)轉(zhuǎn)錄物上加上poly（A）后通過剪接除去內(nèi)含子并產(chǎn)生成熟的 mRNA ，然后在從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)。,內(nèi)含子最前面（G U）和最后面（A G）的兩個(gè)核苷酸總是保持不變 剪接點(diǎn)之間的距離和周圍的DNA 序列，包括剪接點(diǎn)側(cè)翼的外顯子序列的 改變，顯著影響 mRNA 前體的剪接歷程和剪接點(diǎn)的使用效率。 （4）用于復(fù)制和

59、選擇的元件 病毒復(fù)制子 表達(dá)轉(zhuǎn)染目的基因的重組細(xì)胞必須通過在同一細(xì)胞中引入另一種選擇標(biāo) 記基因才能得以識(shí)別分離。 將編碼目的蛋白的目的基因（在一個(gè)質(zhì)粒上）和編碼選擇標(biāo)記蛋白的基 因用共轉(zhuǎn)染方法同時(shí)導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。,六 基因工程藥物無性繁殖系的組建實(shí)例,人胰島素原融合蛋白重組菌株的組建 重組表達(dá)質(zhì)粒pJG202的構(gòu)建與鑒定 重組質(zhì)粒pJG202在大腸桿菌中的表達(dá) 人a2b型干擾素（hIFN-a2b）工程菌株的組建 雙SD 順序 hIFN-a2b基因的獲得 重組表達(dá)質(zhì)粒pMZI2 B的構(gòu)建 人a2b型干擾素工程菌株的形成與基因的表達(dá) 粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子工程菌株的組建 R T-PCR 法制

60、備GM-CSF cDNA GM-CSF重組表達(dá)載體與工程菌株的組建,乙型肝炎表面抗原重組酵母的組建 H BsAg基因重組表達(dá)質(zhì)粒pLS1和pLS2的構(gòu)建 這個(gè)質(zhì)粒在乳酸克魯維酵母及大腸桿菌中都能復(fù)制 Xba I Sal I 插入片段的方向通過電泳檢查Xba I和Sal I雙酶切片段的大小來確定 2 重組表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及H BsAg的表達(dá) 人組織型纖溶酶原激活劑組合突變株CHO 細(xì)胞株的組建 真核表達(dá)質(zhì)粒pLFrGGI的構(gòu)建 FrGGI SV40E Ad M LP SV40P 采用二氫葉酸還原酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑氨甲喋呤(M T X)選擇加壓共擴(kuò)增 外源基因。 2 高效表達(dá)FrGGI（t P A突變

61、體）的C H O 細(xì)胞株的獲得,紅細(xì)胞生成素中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞株的組建 質(zhì)粒與細(xì)胞株 EPO 真核重組表達(dá)質(zhì)粒p M G L4的構(gòu)建 重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞及產(chǎn)物表達(dá) 重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染C H O-dhfr-細(xì)胞及EPO 表達(dá) 氨甲喋呤（M T X） 可以 控制 人腫瘤壞死因子昆蟲細(xì)胞株的組建 含h T N F-a基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建 共轉(zhuǎn)染與重組病毒的獲得 重組病毒感染Sf21細(xì)胞及h T N F-a的表達(dá),第四節(jié) 基因工程藥物的生產(chǎn),基因工程菌株（細(xì)胞）的培養(yǎng)與發(fā)酵 宿主、載體和克隆基因 環(huán)境條件 工程細(xì)菌的培養(yǎng)與發(fā)酵 （1）發(fā)酵用工程菌株的篩選 （2）發(fā)酵培養(yǎng)基的選用 （3）接種量對(duì)

62、發(fā)酵的影響 （4）溶解氧（DO ）水平對(duì)發(fā)酵的影響 （5）pH對(duì)工程菌株生長(zhǎng)和表達(dá)的影響 前期培養(yǎng)階段著重于優(yōu)化工程菌株的最佳生長(zhǎng)條件 后期培養(yǎng)階段著重于優(yōu)化外源蛋白的表達(dá)條件,（6）熱誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)產(chǎn)物表達(dá)量的影響 一般在菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或?qū)?shù)生長(zhǎng)后期進(jìn)行生溫誘導(dǎo)表達(dá) 分批發(fā)酵培養(yǎng) （7）熱誘導(dǎo)的升溫時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響 （8）高密度對(duì)發(fā)酵的影響 單純追求高密度發(fā)酵的結(jié)果是徒然的 沒有明顯的蛋白產(chǎn)物條帶，發(fā)酵產(chǎn)物沒有生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值 工程酵母的培養(yǎng)與發(fā)酵 基因工程乙肝疫苗通?？墒褂萌N表達(dá)系統(tǒng)，即酵母系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物 細(xì)胞系統(tǒng)及疫苗病毒載體系統(tǒng)。 （1）乙肝基因工程酵母細(xì)胞 重組質(zhì)粒由三部分組成穿梭質(zhì)粒,（

63、2）工程酵母菌株的制備與培養(yǎng) （3）工程酵母的發(fā)酵 工程細(xì)胞的培養(yǎng)與發(fā)酵 （1）工程細(xì)胞株 （2）工程細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng) （3）生物反應(yīng)器的細(xì)胞培養(yǎng)與rhEPO的生產(chǎn) 填充床生物反應(yīng)器 基因工程藥物的分離純化 基因工程藥物分離純化的費(fèi)用占整個(gè)生產(chǎn)費(fèi)用的80%-90% 特點(diǎn)：（1）產(chǎn)物大多數(shù)處于細(xì)胞內(nèi)，提取前需將細(xì)胞破碎 （2）產(chǎn)物濃度較低、雜質(zhì)多，而最后成品要求達(dá)到的純度高 （3）產(chǎn)物都是大分子蛋白質(zhì)，通常不穩(wěn)定，遇熱、極端pH、有機(jī),溶劑和剪切力等易引起失活。 影響基因工程產(chǎn)物分離純化工藝設(shè)計(jì)的主要因素 產(chǎn)物活性、純度和雜質(zhì) 首先應(yīng)建立基因工程產(chǎn)物活性、純度及可能含有雜質(zhì)的有效檢測(cè)方法 SDS-

64、PAGE、HPLC、毛細(xì)管電泳、等電點(diǎn)聚焦、肽譜分析和氨基酸分析 產(chǎn)物表達(dá)形式和表達(dá)水平 真菌和動(dòng)植物細(xì)胞一般以分泌的形式表達(dá) 特點(diǎn)：其表達(dá)基因產(chǎn)物的形式有胞內(nèi)不溶性表達(dá)（包涵體）、胞內(nèi)可 溶性表達(dá)、細(xì)胞周質(zhì)表達(dá)等多種 產(chǎn)物本身的分子特性 產(chǎn)物的用途和需求量 體外診斷試劑純度在80%以上，體內(nèi)治療產(chǎn)品應(yīng)達(dá)到98%以上,各種產(chǎn)物表達(dá)形式采用的分離純化方法 細(xì)胞內(nèi)不溶性表達(dá)產(chǎn)物-包涵體 高產(chǎn)量使某些目的蛋白質(zhì)以不溶性形式產(chǎn)生并聚集形成蛋白質(zhì)聚合物 -包涵體。 （1）菌體細(xì)胞的收集與破碎 物理、化學(xué)和酶學(xué)三種方法 超聲波破碎、高壓勻漿和加沙研磨 堿和表面活性劑 （2）包涵體的分離、洗滌與溶解 離心法

65、 低濃度弱變性劑（如尿素） 表面活性劑（如Triton X-100） 硫酸鏈霉素沉淀和酚抽提,溶解包涵體打斷蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的非共價(jià)鍵、離子鍵和疏水作用 溶解包涵體的試劑包括尿素、煙酸胍、SDS 、堿性溶劑和有機(jī)溶劑 還有一種用離子交換樹脂溶解包涵體的方法 （3）變性蛋白質(zhì)的純化 柱層析、凝膠過濾、離子交換層析和高效液相色譜（H P L C） （4）重組蛋白質(zhì)的復(fù)性 分泌型表達(dá)產(chǎn)物 濃縮的方法包括沉淀和超濾 沉淀包括中性鹽、有機(jī)溶劑和高分子聚合物等方法 截留不同分子量的膜供應(yīng) 3 大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)可溶性表達(dá)產(chǎn)物 親和層析分離法,大腸桿菌細(xì)胞周質(zhì)表達(dá)蛋白 滲透壓休克的方法 回收到高質(zhì)量的蛋白產(chǎn)物 基因工程藥物的質(zhì)量控制 產(chǎn)品的鑒別、純度、活性、安全性、穩(wěn)定性和一致性,第三章 細(xì) 胞 工 程 制 藥,Question one：1 什么叫細(xì)胞工程？它有哪幾大核心技術(shù) 2 舉例說明細(xì)胞工程的應(yīng)用 3 什么叫細(xì)胞融合？有哪些主要類型？哪些方法？ 第一節(jié)細(xì)胞工程概 述 它是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科的理論和技術(shù)，按照人們的需要，有計(jì)劃、大規(guī)模地培養(yǎng)生物組織和細(xì)胞以獲得生物及其產(chǎn)品，或者通過改變細(xì)胞的遺傳組成以產(chǎn)生新的種或品種。 動(dòng)植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞融合和細(xì)胞器操作技術(shù) 染色體工程技術(shù)、DNA 重組技術(shù) 菌苗、疫苗、抗生素、生物活性物質(zhì)、抗體等五大類