山東大學 分子生物學 相關(guān)資料

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1、 分 子 生 物 學 教材：生物化學（第五版）周愛儒 主編 人民衛(wèi)生出版社 課時：38學時 教學參考資料： 生物化學應試指南 周愛儒 主編 北京醫(yī)科大學出版社 輔助資料：生物化學與分子生物學習題集 于雪艷 張蓮英 主編 第二章 核酸的結(jié)構(gòu)與功能（4學時） 本章重點: 1．DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點。 2．核小體的概念。 3．DNA的變性、復性及分子雜交。 本章難點： DNA在真核細胞內(nèi)的組裝。 一、核酸的化學組成 基本要點： 1．核苷酸中的堿基成分 核苷酸由 堿基 嘌呤(A,G) 嘧啶（T

2、，C，U） 戊糖 β-D-核糖，β-D-2-核糖 磷酸 2．戊糖與核苷 核苷酸（脫氧核苷酸） 核苷（脫氧核苷）與磷酸通過酯鍵結(jié)合。 3．核苷酸的結(jié)構(gòu)與命名 核苷一磷酸（nucleoside monophosphate,NMP） 核苷二磷酸（nucleoside diphosphate,NDP） 核苷三磷酸（nucleoside triphosphate,NTP） 環(huán)腺苷酸（cycle AMP,cAMP） 環(huán)鳥苷酸（cycle GMP,cGMP） 基本概念： 基本要求：了解核苷酸的結(jié)構(gòu)。熟悉核苷酸的命名。掌握核苷酸的化學組成。

3、 二、核酸的一級結(jié)構(gòu) 基本要點： 1．DNA和RNA的一級結(jié)構(gòu) 四種核苷酸或脫氧核苷酸按照一定的排列順序以3’，5’磷酸二酯鍵（phosphodiester linkage）相連形成的多聚核苷酸鏈或脫氧核苷酸（polydeoxynucleotides）, 稱為核苷酸序列(也稱為堿基序列)。脫氧核苷酸或核苷酸的連接具有嚴格的方向性，是前一核苷酸的３’-OH與下一位核苷酸的5’-位磷酸間形成3’，5’磷酸二酯鍵，構(gòu)成一個沒有分支的線性大分子。DNA的書寫應從5'到3'。 2．RNA與DNA的差別 戊糖成分是核糖不是脫氧核糖; 嘧啶為胞嘧啶和尿嘧啶而不含有胸腺嘧啶, U代替了DNA

4、的T。DNA和RNA對遺傳信息的攜帶和傳遞是依靠核苷酸中的堿基排列順序變化而實現(xiàn)的。 基本概念：核酸的一級結(jié)構(gòu)。 基本要求：熟悉DNA與RNA的區(qū)別。 掌握核酸的一級結(jié)構(gòu)。 三、DNA的空間結(jié)構(gòu)與功能 基本要點： 1．DNA的二級結(jié)構(gòu)——雙螺旋結(jié)構(gòu)模型 ＤＮＡ的雙螺旋結(jié)構(gòu)的研究背景 Chargaff規(guī)則：①腺嘌呤與胸腺嘧啶的摩爾數(shù)總是相等（Ａ=T），鳥嘌呤的含量總是與胞嘧啶相等（G=C）；②不同生物種屬的DNA堿基組成不同，③同一個體不同器官、不同組織的DNA具有相同的堿基組成。 ＤＮＡ雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的要點 ①ＤＮＡ是一反向平行的互補雙鏈結(jié)構(gòu) 親水的脫氧核糖

5、基和磷酸基骨架位于雙鏈的外側(cè)、而堿基位于內(nèi)側(cè)，兩條鏈的堿基互補配對， A---T形成兩個氫鍵，G---C形成三個氫鍵。堆積的疏水性堿基平面與線性分子結(jié)構(gòu)的長軸相垂直。兩條鏈呈反平行走向，一條鏈５’→３’，另一條鏈是３’→５’。）。 ②DNA是右手螺旋結(jié)構(gòu) DNA線性長分子在小小的細胞核中折疊形成了一個右手螺旋式結(jié)構(gòu)（圖３-7）。螺旋直徑為２nm。螺旋每旋轉(zhuǎn)一周包含了10對堿基，每個堿基的旋轉(zhuǎn)角度為36°。螺距為3.4nm；堿基平面之間的距離為0.34nm。DNA雙螺旋分子存在一個大溝（major groove）和一個小溝（minor groove），目前認為這些溝狀結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)和DNA間

6、的識別有關(guān)。 ③DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的維系 橫向靠兩條鏈間互補堿基的氫鍵維系，縱向則靠堿基平面間的疏水性堆積力維持，尤以堿基堆積力更為重要。 2．ＤＮＡ結(jié)構(gòu)的多樣性 B-DNA(Ｗatson-Crick模型結(jié)構(gòu)) Z-DNA A-DNA 3．DNA的超螺旋結(jié)構(gòu) DNA在雙鏈螺旋式結(jié)構(gòu)基礎上,進一步折疊成為超級螺旋結(jié)構(gòu),在蛋白質(zhì)的參與下構(gòu)成核小體(nucleosome),再進一步折疊將DNA緊密壓縮于染色體中。DNA的超螺旋-原核生物DNA的高級結(jié)構(gòu) 絕大部分原核生物的DNA都是共價封閉的環(huán)狀雙螺旋分子。這種雙螺旋分子還需再次螺旋化形成超螺旋結(jié)構(gòu)以保證其可以較致密的形式

7、存在于細胞內(nèi)(圖3-9)。 4．DNA在真核生物細胞核內(nèi)的組裝 染色體的基本單位核小體。核小體由DNA和組蛋白共同構(gòu)成。組蛋白分子共有五種,分別稱為H1,H2A,H2B,H3和H4共同構(gòu)成了核小體的核心,稱為組蛋白八聚體(又稱核心組蛋白)。DNA雙螺旋分子纏繞在這一核心上構(gòu)成了核小體的核心顆粒（core particle）。核小體的核心顆粒之間再由DNA (約60個堿基對,bp)和組蛋白H1構(gòu)成的連接區(qū)連接起來形成串珠樣的結(jié)構(gòu)(圖3-10)。在此基礎上,核小體又進一步旋轉(zhuǎn)折疊,形成纖維狀結(jié)構(gòu)及襟狀結(jié)構(gòu)、最后形成棒狀的染色體,將近l m長的DNA分子容納于直徑只有數(shù)微米的細胞核中。 DNA

8、雙螺旋分子→組蛋白八聚體→DNA雙螺旋分子纏繞(核心顆粒)→串珠樣的結(jié)構(gòu)→維狀結(jié)構(gòu)及襟狀結(jié)構(gòu)→棒狀的染色體 5．DNA的功能 基因(gene) 就是DNA分子中的某一區(qū)段,經(jīng)過復制可以遺傳給子代,經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯可以保證支持生命活動的各種蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)有序地合成。 DNA的基本功能就是作為生物遺傳信息復制的模板和基因轉(zhuǎn)錄的模板,它是生命遺傳繁殖的物質(zhì)基礎,也是個體生命活動的基礎。 一個生物體的全部基因序列稱為基因組(genome)。 基本概念：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)、核小體 基本要求：了解DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的研究背景及意義。 熟悉DNA結(jié)構(gòu)的多樣性及超螺旋結(jié)構(gòu)。 掌握DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模

9、型的要點及DNA的功能。 四、RNA的空間結(jié)構(gòu)與功能 基本要點： 1．信使RNA的結(jié)構(gòu)與功能 細胞核內(nèi)合成的mRNA 初級產(chǎn)物比成熟的mRNA大得多,這種初級的RNA被稱為不均一核RNA (Hetergeneou nuclear RNA,hnRNA),它們在細胞核內(nèi)存在時間極短,經(jīng)過剪接成為成熟的mRNA并移位到細胞質(zhì)(見十二章)。成熟的mRNA由編碼區(qū)和非編碼區(qū)構(gòu)成,它的結(jié)構(gòu)特點(圖3-11)如下: ①大多數(shù)的真核mRNA轉(zhuǎn)錄后在5'-端加一個7-甲基鳥苷,同時第一個核苷酸的C'2也是甲基化的,這種m7G ppp N m結(jié)構(gòu)被稱為帽子結(jié)構(gòu)(cap sequence)。帽子結(jié)構(gòu)具有促

10、進核蛋白體與mRNA的結(jié)合、加速翻譯起始速度的作用,同時可以增強mRNA的穩(wěn)定性。 ②在真核mRNA的3'末端,有一多聚腺苷酸(poly A)結(jié)構(gòu),通常稱為多聚A尾。一般由數(shù)十個至一百幾十個腺苷酸連接而成。poly A是RNA生成后加上去的。poly A與mRNA從核內(nèi)向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位及mRNA的穩(wěn)定性有關(guān)。 各種mRNA的長短差別很大, mRNA分子的長短,決定翻譯的蛋白質(zhì)分子量的大小。各種RNA分子中, mRNA的半衰期最短,由幾分鐘到數(shù)小時不等,是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成速度的調(diào)控點之一。 mRNA的功能是把核內(nèi)DNA的堿基順序(遺傳信息),按照堿基互補的原則,抄錄并轉(zhuǎn)送至胞質(zhì),在蛋白質(zhì)合成中

11、用以翻譯成蛋白質(zhì)中氨基酸的排列順序。mRNA分子上每3個核苷酸為一組,三聯(lián)體密碼(triplet code)。 2．轉(zhuǎn)運RNA的結(jié)構(gòu)與功能 轉(zhuǎn)運RNA (transfer RNA,tRNA)是細胞內(nèi)分子量最小的一類核酸, 100多種tRNA都由70至90個核苷酸構(gòu)成。tRNA的功能是在細胞蛋白質(zhì)合成過程中作為各種氨基酸的載體并將其轉(zhuǎn)呈給mRNA。 tRNA的結(jié)構(gòu)特點: ①分子中含10%~20%的稀有堿基(rare bases)。稀有堿基是指除A、G、C、U外的一些堿基,包括雙氫尿嘧啶(DHU)、假尿嘧啶(ψ,pseudouridine)和甲基化的嘌呤(mG,mA)等(圖3-12)。一般的

12、嘧啶核苷以雜環(huán)上N-1與糖環(huán)的C-1’連成糖苷鍵,假尿嘧啶核苷則用雜環(huán)上的C-5與糖環(huán)的C-1’相連。 ②tRNA核苷酸中存在局部互補配對的區(qū)域,可以形成局部雙鏈,進而形成一種莖-環(huán)樣(stem-loop)結(jié)構(gòu)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。中間不能配對的部分則膨出形成環(huán)狀或襻狀。tRNA形成三葉草形(cloverleaf pattern)二級結(jié)構(gòu)。分別稱為DHU環(huán)和Tψ環(huán),以及反密碼環(huán)。 反密碼子(anticoden)與mRNA相應的三聯(lián)體密碼子堿基互補。例如負責轉(zhuǎn)運酪氨酸的tRNA(tRNATyr)的反密碼子5'-GUA-3'與mRNA上相應的三聯(lián)體密碼子5'-UAC-3'(編碼酪氨酸)呈反向互補。 不

13、同的tRNA依照其轉(zhuǎn)運的氨基酸的差別,有不同的反密碼子。 X射線衍射結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)tRNA的共同三級結(jié)構(gòu)是倒L型(圖3-13b)。倒L形三級結(jié)構(gòu)中Tψ環(huán)與DHU環(huán)相距很近。 3．核蛋白體RNA的結(jié)構(gòu)與功能 核蛋白體RNA(ribosomal RNA,rRNA)約占RNA總量的80%以上。rRNA與核蛋白體蛋白共同構(gòu)成核蛋白體或稱為核糖體(ribosome),原核生物和真核生物的核蛋白體均由易于解聚的大、小兩個亞基組成。 真核生物的核蛋白體小亞基由18S rRNA及30余種蛋白質(zhì)構(gòu)成；大亞基則由5S、5.8S、及28S三種rRNA加上近50種蛋白質(zhì)構(gòu)成(表3-3)。真核生物的18S rRN

14、A的二級結(jié)構(gòu)呈花狀(圖3-14),形似40S小亞基,其中多個莖環(huán)結(jié)構(gòu)為核蛋白體蛋白的結(jié)合和組裝提供了結(jié)構(gòu)基礎。 4．其他小分子ＲＮＡ 細胞的不同部位還存在著另外一些小分子的RNA，它們分別被稱為小核ＲＮＡ、小核仁ＲＮＡ、小胞質(zhì)RＮＡ等。這些小RNA分別參與hnRNA和rRNA的轉(zhuǎn)運和加工。 5．核酶 某些RNA分子本身具有自我催化能力，可以完成rRNA的剪接。這種具有催化作用的ＲＮＡ被稱為核酶（ribozyme）。 基本概念：核酶 基本要求：了解HnRNA、SnRNA等小分子RNA的功能。 掌握mRNA、tRNA、rRNA的結(jié)構(gòu)特點和功能。 五、核酸的理化性質(zhì)及其應用 基本要

15、點： 1．核酸的一般理化性質(zhì) 核酸具有較強的酸性。DNA是線性高分子，粘度極大，RNA分子遠小于DNA，粘度也小得多。DNA分子在機械力的作用下易發(fā)生斷裂。嘌呤和嘧啶環(huán)中均含有共軛雙鍵，因此對波長260ｎｍ左右的紫外光有較強吸收。這是DNA和RNA定量最常用的方法。 2．ＤＮＡ的變性 ＤＮＡ變性 在某些理化因素作用下，DNA分子互補堿基對之間的氫鍵斷裂，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)松散，變成單鏈。 加熱是實驗室最常用的DNA變性的方法。 DNA的增色效應（hyperchromic effect） 加熱時，DNA雙鏈解鏈過程中，內(nèi)部的堿基暴露，對260nm波長紫外光吸收增加，DNA的A260增

16、加，并與解鏈程度有一定的比例關(guān)系。這種關(guān)系稱為DNA的增色效應（hyperchromic effect）。 解鏈曲線 連續(xù)加熱DNA的過程中以溫度對A260的關(guān)系作圖，所得的曲線（圖3-15）。從曲線中可以看出，DNA的變性從開始解鏈到完全解鏈，是在一個相當窄的溫度內(nèi)完成的，在這一范圍內(nèi)，紫外光吸收值達到最大值的50％時的溫度稱為DNA的解鏈溫度（融解溫度）（melting temprature,Tm）。在Tm時，核酸分子內(nèi)50%的雙鏈結(jié)構(gòu)被解開。一種DNA分子的Tm值的大小與其所含堿基中的G+C比例相關(guān)，G+C比例越高，Tm值越高。 Tm值計算公式：Tm＝69.3+0.41（%G+C

17、）， ＜20bp的寡核苷酸的Tm計算：Tm＝4（G+C）+2（A+T）。 3．ＤＮＡ的復性與分子雜交 DNA復性 變性DNA在適當條件下，分開的兩條單鏈分子按照堿基互補原則重新恢復天然的雙螺旋構(gòu)象的現(xiàn)象。熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復性，又稱為退火（annealing）。 DNA的復性速度受到溫度的影響，復性時溫度緩慢下降才可使其重新配對復性。如加熱后，將其迅速冷卻至４℃以下，則幾乎不可能發(fā)生復性。這一特性被用來保持DNA的變性狀態(tài)，一般認為，比Tm 低25℃的溫度是DNA復性的最佳條件。 核酸分子雜交（hybridization） 在DNA復性過程中，如果將不同來源的DNA單

18、鏈分子放在同一溶液中，或者將DNA和RNA分子放在一起，雙鏈分子的再形成既可以發(fā)生在序列完全互補的核酸分子間，也可以發(fā)生在那些堿基序列部分互補的不同的DNA之間或DNA與RNA之間。 核酸分子探針 用同位素、生物素或熒光染料標記一小段已知序列的多聚核苷酸的末端或全鏈就可以作為探針，探針的序列如果與DNA或RNA序列互補，就可以探知核酸分子。 基本概念：DNA變性和復性、Tm值、增色效應、減色效應、核酸分子雜交 基本要求：了解核酸的一般理化性質(zhì)。 熟悉Tm值的計算。 掌握DNA的變性、復性及分子雜交。 六、核酸酶 基本要點： 核酸酶（nucleases）是指所有可以水解核酸的酶

19、，在細胞內(nèi)催化核酸的降解，以維持核酸（尤其是RNA）的水平與細胞功能相適應。食物中的核酸也需要在核酸酶的作用下被消化。 按照作用底物 DNA酶（DNase）、RNA酶（RNase）。 核酸外切酶 ５’末端外切酶、３’末端外切酶 核酸內(nèi)切酶 作用于鏈的內(nèi)部，其中一部分具有嚴格的序列依賴性（4～8 bp），稱為限制性內(nèi)切酶。 核酸酶在DNA重組技術(shù)中是不可缺少的重要工具，尤其是限制性核酸內(nèi)切酶的應用更是所有基因人工改造的基礎。 基本概念：核酸酶 基本要求：了解核酸酶的分類。掌握核酸酶的特性及應用。 第九章 核苷酸代謝(3學時) 本章重點： 核苷酸最

20、主要的功能是作為核酸合成的原料，體內(nèi)核苷酸的合成有兩條途徑，一條是從頭合成途徑，一條是補救合成途徑。肝組織進行從頭合成途徑，腦、骨髓等則只能進行補救合成，前者是合成的主要途徑。核苷酸合成代謝中有一些嘌呤、嘧啶、氨基酸或葉酸等的類似物，可以干擾或阻斷核苷酸的合成過程，故可作為核苷酸的抗代謝物。體內(nèi)核苷酸的分解代謝類似于食物中核苷酸的消化過程，嘌呤核苷酸的分解終產(chǎn)物是尿酸，嘧啶核苷酸的分解終產(chǎn)物是β-丙氨酸或β-氨基異丁酸。核苷酸的合成代謝受多種因素的調(diào)節(jié)。 本章難點： 嘌呤核苷酸、嘧啶核苷酸從頭合成的原料及關(guān)鍵步驟、關(guān)鍵酶，嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的從頭合成代謝調(diào)節(jié)機制。核苷酸合成代謝過程中的

21、一些抗代謝物，以及它們的作用機理。 一、概述 要點： 1．核酸的消化 食物中的核酸大多以核蛋白的形式存在。核蛋白在胃中受胃酸的作用，分解成核酸與蛋白質(zhì)。核酸在小腸中受胰液和腸液中各種水解酶的作用逐步水解，最終生成堿基和戊糖。產(chǎn)生的戊糖被吸收參加體內(nèi)的戊糖代謝；嘌呤和嘧啶堿主要被分解排出體外。食物來源的嘌呤和嘧啶很少被機體利用。 2．核苷酸的分布 核苷酸是核酸的基本結(jié)構(gòu)單位，人體內(nèi)的核苷酸主要有機體細胞自身合成，核苷酸不屬于營養(yǎng)必需物質(zhì)。核苷酸在體內(nèi)的分布廣泛。細胞中主要以5′-核苷酸形式存在。細胞中核糖核苷酸的濃度遠遠超過脫氧核糖核苷酸。不同類型細胞中的各種核苷酸含量差異很大，同一

22、細胞中，各種核苷酸含量也有差異，核苷酸總量變化不大。 3．核苷酸的生物學功用 ①作為核酸合成的原料，這是核苷酸最主要的功能；②體內(nèi)能量的利用形式；③參與代謝和生理調(diào)節(jié)；④組成輔酶；⑤活化中間代謝物。 基本要求：掌握核苷酸的生物學功用。了解核酸消化概況，及核苷酸的分布情況。 二、嘌呤核苷酸代謝 要點： （一）嘌呤核苷酸的合成代謝 體內(nèi)嘌呤核苷酸的合成有兩條途徑，一是從頭合成途徑，一是補救合成途徑，其中從頭合成途徑是主要途徑。 1．嘌呤核苷酸的從頭合成 肝是體內(nèi)從頭合成嘌呤核苷酸的主要器官，其次是小腸粘膜和胸腺。嘌呤核苷酸合成部位在胞液，合成的原料包括磷酸核糖、天冬

23、氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、一碳單位及CO2等。主要反應步驟分為兩個階段：首先合成次黃嘌呤核苷酸（IMP），然后IMP再轉(zhuǎn)變成腺嘌呤核苷酸（AMP）與鳥嘌呤核苷酸（GMP）。嘌呤環(huán)各元素來源如下：N1由天冬氨酸提供，C2由N10-甲酰FH4提供、C8由N5，N10-甲炔FH4提供，N3、N9由谷氨酰胺提供，C4、C5、N7由甘氨酸提供，C6由CO2提供。嘌呤核苷酸從頭合成的特點是：嘌呤核苷酸是在磷酸核糖分子基礎上逐步合成的，不是首先單獨合成嘌呤堿然后再與磷酸核糖結(jié)合的。反應過程中的關(guān)鍵酶包括PRPP酰胺轉(zhuǎn)移酶、PRPP合成酶。PRPP酰胺轉(zhuǎn)移酶是一類變構(gòu)酶，其單體形式有活性，二聚體形式無活性。IM

24、P、AMP及GMP使活性形式轉(zhuǎn)變成無活性形式，而PRPP則相反。從頭合成的調(diào)節(jié)機制是反饋調(diào)節(jié)，主要發(fā)生在以下幾個部位：嘌呤核苷酸合成起始階段的PRPP合成酶和PRPP酰胺轉(zhuǎn)移酶活性可被合成產(chǎn)物IMP、AMP及GMP等抑制；在形成AMP和GMP過程中，過量的AMP控制AMP的生成，不影響GMP的合成，過量的GMP控制GMP的生成，不影響AMP的合成；IMP轉(zhuǎn)變成AMP時需要GTP，而IMP轉(zhuǎn)變成GMP時需要ATP。 2．嘌呤核苷酸的補救合成 反應中的主要酶包括腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（APRT），次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）。嘌呤核苷酸補救合成的生理意義：節(jié)省從頭合成時能量和

25、一些氨基酸的消耗；體內(nèi)某些組織器官，例如腦、骨髓等由于缺乏從頭合成嘌呤核苷酸的酶體系，而只能進行嘌呤核苷酸的補救合成。 3．嘌呤核苷酸的相互轉(zhuǎn)變 IMP可以轉(zhuǎn)變成AMP和GMP，AMP和GMP也可轉(zhuǎn)變成IMP。AMP和GMP之間可相互轉(zhuǎn)變。 4．脫氧核苷酸的生成 體內(nèi)的脫氧核苷酸是通過各自相應的核糖核苷酸在二磷酸水平上還原而成的。核糖核苷酸還原酶催化此反應。 5．嘌呤核苷酸的抗代謝物 ①嘌呤類似物：6-巰基嘌呤（6MP）、6-巰基鳥嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤等。6MP應用較多，其結(jié)構(gòu)與次黃嘌呤相似，可在體內(nèi)經(jīng)磷酸核糖化而生成6MP核苷酸，并以這種形式抑制IMP轉(zhuǎn)變?yōu)锳MP及

26、GMP的反應。 ②氨基酸類似物：氮雜絲氨酸和6-重氮-5-氧正亮氨酸等。結(jié)構(gòu)與谷氨酰胺相似，可干擾谷氨酰胺在嘌呤核苷酸合成中的作用，從而抑制嘌呤核苷酸的合成。 ③葉酸類似物：氨喋呤及甲氨喋呤（MTX）都是葉酸的類似物，能競爭抑制二氫葉酸還原酶，使葉酸不能還原成二氫葉酸及四氫葉酸，從而抑制了嘌呤核苷酸的合成。 （二）嘌呤核苷酸的分解代謝 分解代謝反應基本過程是核苷酸在核苷酸酶的作用下水解成核苷，進而在酶作用下成自由的堿基及1-磷酸核糖。嘌呤堿最終分解成尿酸，隨尿排出體外。黃嘌呤氧化酶是分解代謝中重要的酶。嘌呤核苷酸分解代謝主要在肝、小腸及腎中進行。嘌呤代謝異常：尿酸過多引起痛風癥，患者血

27、中尿酸含量升高，尿酸鹽晶體可沉積于關(guān)節(jié)、軟組織、軟骨及腎等處，導致關(guān)節(jié)炎、尿路結(jié)石及腎疾病。臨床上常用別嘌呤醇治療痛風癥。 基本概念 1．從頭合成途徑（de novo synthesis）：體內(nèi)嘌呤核苷酸的合成代謝中，利用磷酸核糖、氨基酸、一碳單位及CO2等簡單物質(zhì)為原料，經(jīng)過一系列酶促反應，合成嘌呤核苷酸稱為從頭合成途徑。 2．補救合成途徑（salvage pathway）：利用體內(nèi)游離的嘌呤或嘌呤核苷，經(jīng)過簡單的反應過程，合成嘌呤核苷酸，稱為補救合成途徑。 3．自毀容貌癥：又稱（Lesch-Nyhan綜合癥），是由于某些基因缺乏而導致HGPRT完全缺失的患兒，表現(xiàn)為自毀容貌癥。

28、基本要求 掌握嘌呤核苷酸從頭合成的原料，部位，關(guān)鍵酶，關(guān)鍵調(diào)節(jié)，及抗代謝物的主要種類和作用機制。掌握嘌呤核苷酸分解代謝參加的關(guān)鍵酶，主要終產(chǎn)物。熟悉嘌呤核苷酸從頭合成的步驟及調(diào)節(jié)。熟悉嘌呤核苷酸補救合成的幾種反應及參與的酶。 三．嘧啶核苷酸代謝 要點 （一）嘧啶核苷酸的合成代謝 1．嘧啶核苷酸的從頭合成 肝是體內(nèi)從頭合成嘧啶核苷酸的主要器官。嘧啶核苷酸從頭合成的原料是天冬氨酸、谷氨酰胺、CO2等。反應過程中的關(guān)鍵酶在不同生物體內(nèi)有所不同，在細菌中，天冬氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶是嘧啶核苷酸從頭合成的主要調(diào)節(jié)酶；而在哺乳動物細胞中，嘧啶核苷酸合成的調(diào)節(jié)酶主要是氨基甲酰磷酸合成酶II。

29、主要合成過程：形成的第一個嘧啶核苷酸是乳氫酸核苷酸（OMP），進而形成尿嘧啶核苷酸（UMP），UMP在一系列酶的作用下生成CTP。dTMP由dUMP經(jīng)甲基化生成的。嘧啶核苷酸從頭合成的特點是先合成嘧啶環(huán)，再磷酸核糖化生成核苷酸。 2．嘧啶核苷酸的補救合成 主要酶是嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，能利用尿嘧啶、胸腺嘧啶及乳氫酸作為底物，對胞嘧啶不起作用。 3．嘧啶核苷酸的抗代謝物 ①嘧啶類似物：主要有5-氟尿嘧啶（5-FU），在體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)镕dUMP或FUTP后發(fā)揮作用。 ②氨基酸類似物：同嘌呤抗代謝物。 ③葉酸類似物：同嘌呤抗代謝物。 ④阿糖胞苷：抑制CDP還原成dCDP。 （二）嘧啶核

30、苷酸的分解代謝 嘧啶核苷酸在酶作用下生成磷酸、核糖及自由堿基，產(chǎn)生的嘧啶堿進一步分解。胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，尿嘧啶最終生成NH3、CO2及β-丙氨酸。胸腺嘧啶降解成β-氨基異丁酸。 基本要求 掌握嘧啶從頭合成的原料，主要酶，抗代謝物。掌握嘧啶分解代謝的最終產(chǎn)物。了解嘧啶從頭合成反應過程，了解嘧啶補救合成過程。 第十一章 DNA的生物合成（復制）（5學時） 基本要求： 1. 掌握與DNA復制、DNA損傷與修復、逆轉(zhuǎn)錄過程有關(guān)的基本概念。包括：半保留復制，半不連續(xù)復制，復制叉，復制子，岡崎片段，領(lǐng)頭鏈，隨從鏈，端粒，端粒酶等。 2. 掌握復制的過程，以及復制過程

31、中涉及到的各種酶、蛋白因子；并掌握原核生物與真核生物復制的相同點與不同點。 3. 掌握逆轉(zhuǎn)錄過程，熟悉逆轉(zhuǎn)錄酶的應用。 4. 了解引起地中海貧血和鐮形紅細胞貧血的分子機制。 重點：DNA分子在生物體內(nèi)的合成有三種方式：（1）DNA指導的DNA合成，也稱復制，是細胞內(nèi)DNA最主要的合成方式。遺傳信息儲存在DNA分子中，細胞增殖時，DNA通過復制使遺傳信息從親代傳遞到子代。（2）修復合成，即DNA受到損傷（突變）后進行修復，需要進行局部的DNA的合成，用以保證遺傳信息的穩(wěn)定遺傳。（3）RNA指導的DNA合成，即反轉(zhuǎn)錄合成，是RNA病毒的復制形式，以RNA為模板，由逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成DNA。

32、真核生物的DNA合成過程與原核生物基本相似，但機理尚不十分清楚，以原核生物為例介紹其復制過程。 難點：DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)是復制的結(jié)構(gòu)基礎。DNA復制的實質(zhì)為酶催化的脫氧核糖核苷酸的聚合反應。復制開始時，親代雙鏈DNA分子解開，分別作為模板，在DNA依賴的DNA聚合酶催化下，按照堿基配對的原則，將四種脫氧核苷酸連接成DNA大分子，合成產(chǎn)物的堿基序列與模板DNA的堿基序列是互補的，子代DNA雙鏈分子中，一條來自親代的模板鏈，另一條為新合成的鏈，故稱半保留復制，是生物體最主要的DNA合成方式；合成過程中，自5’→3’連續(xù)合成一條領(lǐng)頭鏈，不連續(xù)地合成一些片斷，而后連成一條隨從鏈，所以DNA合成是半不

33、連續(xù)合成。反應過程復雜，首先螺旋松弛，雙鏈打開，形成復制叉，然后復制的引發(fā)，包括合成引物，形成引發(fā)體，最后是DNA鏈的延長與終止。每一階段需要有許多酶和蛋白因子參與，包括拓撲異構(gòu)酶，用于理順解鏈過程中造成的鏈的盤繞、打結(jié)等現(xiàn)象；解螺旋酶在蛋白因子的輔助下結(jié)合于復制起始點，并打開雙鏈，由單鏈結(jié)合蛋白穩(wěn)定解開的兩股單鏈；引物酶及其它輔助蛋白因子在打開的雙鏈上催化合成引物，由引物提供3’-OH，與原料dNTP的5’-P形成磷酸二酯鍵，然后DNA聚合酶催化這一聚合反應的進行，而DNA連接酶將復制中的不連續(xù)片段連接成完整的鏈。真核生物的復制與原核生物相比，為多個起始點、5種DNA聚合酶以及有端粒復制等特

34、點。 一、DNA的復制 基本要求： 1. 掌握復制叉、半不連續(xù)復制、岡崎片段、領(lǐng)頭鏈、隨從鏈等基本概念。 2. 掌握拓撲異構(gòu)酶、解螺旋酶、單鏈結(jié)合蛋白、引物酶、DNA聚合酶、DNA連接酶的特點及生物學作用。 3. 熟悉DNA的合成過程。 4. 了解半保留復制的實驗依據(jù)。 基本概念： 1. 中心法則：遺傳信息從DNA通過轉(zhuǎn)錄流向RNA，RNA通過翻譯指導合成蛋白質(zhì)，這種遺傳信息的傳遞規(guī)律稱之。少數(shù)RNA也是遺傳信息的貯存者，RNA能逆轉(zhuǎn)錄為DNA，是對中心法則的補充。 2. 復制（replication）：即DNA的生物合成，以DNA為模板指導合成相同的DNA分子，使遺傳信息從

35、親代傳遞到子代的過程。RNA病毒的遺傳信息儲存于RNA分子中，可進行RNA復制并反轉(zhuǎn)錄合成DNA。 3. 半保留復制（semiconservative replication）：DNA復制時，親代DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，分別以解開的兩股單鏈為模板，以dNTP(dATP、 dGTP 、dTTP 、dCTP)為原料，按照堿基互補的原則，合成與模板鏈互補的新鏈，從而形成兩個子代DNA雙鏈，其結(jié)構(gòu)與親代DNA雙鏈完全一致。因子代DNA雙鏈中的一股單鏈源自親代，另一股單鏈為合成的新鏈，形成的雙鏈與親代雙鏈的堿基序列完全一致，故稱為半保留復制。 4. 復制叉（replication fork）：原核生物

36、DNA的復制從單一起點開始，雙螺旋結(jié)構(gòu)被打開，分開的兩股單鏈分別作為新DNA合成的模板，DNA合成從起點開始向兩個方向進行，與單一起點相連的局部結(jié)構(gòu)形狀呈“Y”型，稱復制叉結(jié)構(gòu)。 5. 半不連續(xù)復制：復制過程中，催化DNA 合成的DNA聚合酶只能催化核苷酸從5’→3’方向合成，以3’→ 5’鏈為模板時，新生的DNA以5’→3’方向連續(xù)合成；而以5’→3’為模板只能合成若干反向互補的岡崎片段，這些片段再相連成完整的新鏈，故稱半不連續(xù)復制。 6. 岡崎片段（Okazaki fragments）：DNA雙鏈是反向平行的，復制時，親代雙鏈DNA在復制叉處打開，由于新鏈的合成具有方向性，即從5’→3

37、’，以5’→3’DNA鏈為模板合成反向互補的新鏈時，只能合成小片段DNA，這些片段根據(jù)發(fā)現(xiàn)者命名為岡崎片斷。 7. 領(lǐng)頭鏈、隨從鏈：DNA雙鏈是反向的，復制時，兩股鏈均作為模板，但新鏈的合成只能是5’→3’。因此，順著解鏈方向合成的子鏈，復制是連續(xù)進行的，這股鏈稱為領(lǐng)頭鏈，另一股新鏈的復制方向與解鏈方向相反，復制是不連續(xù)進行的，這條不連續(xù)合成的鏈稱為隨從鏈。 8. 引發(fā)體：是由DnaA蛋白、DnaB蛋白（解螺旋酶）、DnaC蛋白、引物酶和DNA的起始復制區(qū)域共同形成的一個復合結(jié)構(gòu)。DnaA蛋白辨認復制起始點，DnaB蛋白有解螺旋作用，DnaC蛋白使DnaB蛋白組裝到復制起始點，引物酶合成引

38、物。 （一）、原核生物DNA的復制 1．與復制有關(guān)的酶及蛋白質(zhì)： （1）拓撲異構(gòu)酶：通過切斷并連接DNA雙鏈中的一股或雙股，改變DNA分子拓撲構(gòu)象，避免DNA分子打結(jié)、纏繞、連環(huán)，在復制的全程中都起作用。其種類有：拓撲異構(gòu)酶I和拓撲異構(gòu)酶II，拓撲異構(gòu)酶I能切斷DNA雙鏈中一股并再連接斷端，反應不需ATP供能；拓撲異構(gòu)酶II能使DNA雙鏈同時發(fā)生斷裂和再連接，需ATP供能，并使DNA分子進入負超螺旋。 （2） 解螺旋酶： DNA進行復制時，需親代DNA的雙鏈分別作模板來指導子代DNA分子的合成，解螺旋酶可以將DNA雙鏈解開成為單鏈。大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的解螺旋酶為DnaB。 （3） 單鏈

39、結(jié)合蛋白（SSB）：在復制中模板需處于單鏈狀態(tài)，SSB可以模板的單鏈狀態(tài)并保護模板不受核酸酶的降解。隨著DNA雙鏈的不斷解開，SSB能不斷的與之結(jié)合、解離。 （4） 引物酶： 是一種RNA聚合酶，在復制的起始點處以DNA為模板，催化合成一小段互補的RNA。DNA聚合酶不能催化兩個游離的dNTP聚合反應，若沒有引物就不能起始DNA合成。引物酶能直接在單鏈DNA模板上催化游離的NTP合成一小段RNA，并由這一小段RNA引物提供3’-OH， 經(jīng)DNA聚合酶催化鏈的延伸。 （5） DNA聚合酶：是依賴DNA的DNA聚合酶，簡稱為DNA pol，以DNA為模板，dNTP為原料，催化脫氧核苷酸加

40、到引物或DNA鏈的3’-OH末端，合成互補的DNA新鏈，即5’→3’聚合活性。原核生物的DNA聚合酶有DNA polI、DNA pol II和DNA pol III，DNA pol III是復制延長中真正起催化作用的，除具有5’→3’聚合活性，還有3’→ 5’ 核酸外切酶活性和堿基選擇功能，能夠識別錯配的堿基并切除，起即時校讀的作用；DNA pol I具有5’→3’聚合活性、3’→ 5’和5’→3’核酸外切酶活性，5’→3’核酸外切酶活性可用于切除引物以及突變片段，起切除、修復作用。另外，klenow片斷是DNA pol I體外經(jīng)蛋白酶水解后產(chǎn)生的大片段，具有DNA 聚合酶和3’→ 5’外切酶

41、活性，是分子生物學的常用工具酶。DNA pol II 在無DNA pol I和DNA pol III時起作用，也具有5’→3’和3’→ 5’ 核酸外切酶活性。 （6） DNA連接酶：DNA連接酶用于連接雙鏈中的單鏈缺口，使相鄰兩個DNA片段的3’-OH末端和5’-P末端形成3’,5’磷酸二酯鍵。DNA連接酶在DNA復制、修復、重組、剪接中用于縫合缺口，是基因工程的重要工具酶。 2．DNA的合成過程：可將復制過程分為起始、延長和終止三個階段。 復制起始： （1） 辨認起始點，合成引發(fā)體：在E.coli，復制起始點稱為oriC，具有特定結(jié)構(gòu)能夠被DnaA蛋白辨認結(jié)合，DnaB蛋白具有解螺旋

42、作用，DnaC蛋白使DnaB蛋白結(jié)合于起始點，DNA雙鏈局部被打開，引物酶及其他蛋白加入，形成引發(fā)體。 （2） 形成單鏈：DNA進行復制時，首先在拓撲異構(gòu)酶作用下，使分子的超螺旋構(gòu)象變化，然后在解鏈酶的作用下，解開雙鏈，才能開始進行DNA的合成。解螺旋酶在蛋白因子的輔助下打開DNA雙鏈，單鏈結(jié)合蛋白SSB結(jié)合于處于單鏈狀態(tài)模板鏈上；拓撲異構(gòu)酶使DNA分子避免打結(jié)、纏繞等，在復制全過程中起作用。 （3） 合成引物：引發(fā)體中的引物酶催化合成RNA引物，由引物提供3’-OH基，使復制開始進行。領(lǐng)頭連和隨從鏈均由引物酶合成引物，隨從鏈在復制中需多次合成引物。 復制延長： （1） 復制方向：原核

43、生物如E.coli，只有一個起始點oriC，兩個復制叉同時向兩個方向進行復制，稱為雙向復制。 （2） 鏈的延長：按照與模板鏈堿基配對的原則，在DNA聚合酶III的作用下，逐個加入脫氧核糖核酸，使鏈延長。由于DNA雙鏈走向相反，DNA聚合酶只能催化核苷酸從5’→3’方向合成，領(lǐng)頭鏈的復制方向與解鏈方向一致，可以連續(xù)復制，而另一股模板鏈沿5’→3’方向解開，隨從鏈的復制方向與解鏈方向相反，復制只能在模板鏈解開一定長度后進行，因此隨從鏈的合成是不連續(xù)的，形成的是若干個岡崎片段。DNA聚合酶I的即時校讀，DNA聚合酶III的堿基選擇功能，使復制具有保真性。 復制終止： 原核生物如E.coli，他

44、的兩個復制叉的匯合點就是復制的終點。由RNA酶切去領(lǐng)頭鏈和隨從鏈中的引物，引物留下的空隙由DNA聚合酶I催化，四種脫氧核糖三磷酸為原料自5’→3’方向延長填補。最后，DNA連接酶由ATP供能，將兩個不連續(xù)片段相鄰的5’-P和3’-OH連接起來，成為連續(xù)的子鏈，復制完成。 （二）、真核生物的復制： 真核細胞的一生可以定義為一個細胞周期，細胞增殖時， DNA通過復制使其含量成倍增加，隨后細胞分裂，成為兩個子代細胞，DNA將親代的特征傳遞到子代。細胞周期包括G1期、S期、G2期和M期， DNA的復制只發(fā)生在S期。與原核生物相比，真核生物的復制具有以下特點： 1. 多復制子：真核生物的DNA復制

45、也是半保留復制。染色體線性分子的復制有多個起始點，每個起始點由兩個反向運動的復制叉組成，進行雙向復制。由一個起始點控制的DNA復制稱為一個復制子。 2. 5種DNA聚合酶：與原核生物不同，真核細胞含有5種DNA聚合酶：α、β、γ、δ和ε。除了γ外，所有DNA聚合酶存在于核內(nèi)。DNA聚合酶α和δ在復制延長中起催化作用，DNA聚合酶α延長隨從鏈，DNA聚合酶δ延長領(lǐng)頭鏈。DNA聚合酶β和ε在復制過程中起校讀、修復和填補缺口的作用。DNA聚合酶γ在線粒體中，用于線粒體DNA的復制。 3. 端粒復制：真核生物染色體線性分子的復制，領(lǐng)頭鏈可連續(xù)完整復制，而隨從鏈3’端引物除去后的空隙無法填補，會造成

46、縮短了的子代的雙鏈，解決的途徑是用端粒酶來復制染色體的末端（端粒）。端粒是染色體末端具有特定重復序列和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，由酶和含重復序列的RNA分子組成，它以自身的RNA分子為模板從隨從鏈的3’端合成端粒的重復序列，使隨從鏈延長，以防止隨從鏈在每次復制時被縮短。 二、DNA的修復合成 受環(huán)境理化因素或生物學因素的影響，DNA序列會發(fā)生改變，包括堿基的變化、鏈的斷裂、交聯(lián)等，通過一定的修復機制對損傷DNA進行校正，保證遺傳信息的穩(wěn)定。 基本要求： 1． 掌握DNA突變的概念及突變類型。 2． 掌握損傷DNA的修復機制。 3． 了解突變的意義及引起突變的因素。

47、4． 了解引起地中海貧血和鐮形紅細胞貧血的分子機制。 基本概念： 1． 突變：是指DNA分子中堿基序列的改變，從而影響其表達產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與功能。 2． 框移突變：基因編碼區(qū)域插入或缺失堿基，DNA分子三聯(lián)體密碼的閱讀方式改變，使轉(zhuǎn)錄翻譯出的氨基酸排列順序發(fā)生改變，稱為框移突變。3個或3n個堿基插入或缺失，不一定引起框移突變。 3． 切除修復：是最重要的修復方式，由UvrA、UvrB、UvrC、DNA-pol I、dNTP、連接酶參與。首先UvrA、UvrB辨認損傷部位并與之結(jié)合，UvrC切除損傷的DNA，DNA-pol I以dNTP為原料，填補切除空隙，最后由連接酶連接缺口，完成修復。

48、 （一） 突變類型： 1． 點突變：又稱錯配。DNA分子中一個堿基的變異，包括轉(zhuǎn)換和顛換。 2． 缺失：DNA分子中一個核苷酸或一段核苷酸的消失。 3． 插入：一個核苷酸或一段核苷酸插入到DNA分子中。 4． 重排：DNA鏈內(nèi)部重組，使其中一段方向反置或大片段的鏈在DNA分子內(nèi)遷移。 （二）修復方式： 1． 直接修復：又稱光修復，由光修復酶修復因紫外照射引起的嘧啶二聚體，使其還原。 2． 切除修復：見上。 3． 重組修復：當損傷的DNA尚未進行修復就已經(jīng)進行復制，復制出的子代DNA會出現(xiàn)缺口，此時所產(chǎn)生的子代DNA就需進行重組修復。重組蛋白RecA具有核酸酶活性，將健康母鏈中與

49、缺口對應的一股DNA片段重組到子鏈缺口處，而健康母鏈出現(xiàn)的缺口，可按健康的模板由DNA聚合酶催化填補，然后由連接酶連接，最后將健康鏈完全復原。 4． SOS修復：是DNA損傷到難以繼續(xù)復制時，細胞采取的一種應急性修復方式。DNA損傷嚴重，誘導出一系列的復雜反應，產(chǎn)生SOS修復酶系，包括重組蛋白、調(diào)控蛋白以及復制、修復的酶系統(tǒng)等。 三、DNA的反轉(zhuǎn)錄合成 反轉(zhuǎn)錄又稱逆轉(zhuǎn)錄，指遺傳信息從RNA流向DNA。是RNA指導下的DNA合成過程，即以RNA為模板，四種dNTP為原料，合成與RNA互補的DNA單鏈，催化這一過程的酶稱反轉(zhuǎn)錄酶，RNA病毒中都含有此酶。 1． 反轉(zhuǎn)錄酶：屬RNA指導的

50、DNA聚合酶，具有三種酶活性，即RNA指導的DNA聚合酶，RNA酶，DNA指導的DNA聚合酶。在分子生物學技術(shù)中，作為重要的工具酶被廣泛用于建立基因文庫、獲得目的基因等工作。 2． 合成過程；RNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的催化下，合成與RNA互補的DNA單鏈，形成雜化雙鏈，反轉(zhuǎn)錄酶將其中RNA鏈水解，在以互補的DNA鏈為模板，合成雙鏈DNA。 3． 反轉(zhuǎn)錄方向：5’→3’。 第十二章 RNA的生物合成（轉(zhuǎn)錄）（4學時） 本章重點： 轉(zhuǎn)錄的反應體系，原核生物RNA聚合酶和真核生物中的RNA聚合酶的特點，RNA的轉(zhuǎn)錄過程大體可分為起始、延長、終止三個階段。真核RNA的轉(zhuǎn)錄后加工，包括各種R

51、NA前體的加工過程。 本章難點： 轉(zhuǎn)錄模板的不對稱性極其命名，原核生物及真核生物的轉(zhuǎn)錄起始，真核生物的轉(zhuǎn)錄終止，mRNA前體的剪接機制（套索的形成及剪接），第Ⅰ、Ⅱ類和第Ⅳ類內(nèi)含子的剪接過程，四膜蟲rRNA前體的加工，核酶的作用機理。 一．模板和酶 要點： 1．模板 RNA的轉(zhuǎn)錄合成需要DNA做模板，DNA雙鏈中只有一股鏈起模板作用，指導RNA合成的一股DNA鏈稱為模板鏈（template strand），與之相對的另一股鏈為編碼鏈（coding strand），不對稱轉(zhuǎn)錄有兩方面含義:一是DNA鏈上只有部分的區(qū)段作為轉(zhuǎn)錄模板(有意義鏈或模板鏈),二是模板鏈并非自始至終位于同一股

52、DNA單鏈上。 2．RNA聚合酶 轉(zhuǎn)錄需要RNA聚合酶。原核生物的RNA聚合酶由多個亞基組成:α2ββ'稱為核心酶,轉(zhuǎn)錄延長只需核心酶即可。α2ββ'σ稱為全酶,轉(zhuǎn)錄起始前需要σ亞基辨認起始點,所以全酶是轉(zhuǎn)錄起始必需的。真核生物RNA聚合酶有RNA-polⅠ、Ⅱ、Ⅲ三種,分別轉(zhuǎn)錄45s-rRNA; mRNA(其前體是hnRNA);以及5s-rRNA、snRNA和tRNA。 3.模板與酶的辨認結(jié)合 轉(zhuǎn)錄模板上有被RNA聚合酶辨認和結(jié)合的位點。在轉(zhuǎn)錄起始之前被RNA聚合酶結(jié)合的DNA部位稱為啟動子。典型的原核生物啟動子序列是-35區(qū)的TTGACA序列和-10區(qū)的Pribnow盒即TATAA

53、T序列。真核生物的轉(zhuǎn)錄上游調(diào)控序列統(tǒng)稱為順式作用元件,主要有TATA盒、、CG盒、上游活化序列(酵母細胞)、增強子等等。和順式作用元件結(jié)合的蛋白質(zhì)都有調(diào)控轉(zhuǎn)錄的作用,統(tǒng)稱為反式作用因子。反式作用因子已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種,能夠歸類的稱為轉(zhuǎn)錄因子(TF),相應于RNA-polⅠ、Ⅱ、Ⅲ的是TFⅠ、TFⅡ、TFⅢ。TFⅡ又有A、B、C、D、E、F多種及其亞類。 基本概念： 1.不對稱轉(zhuǎn)錄:兩重含義,一是指雙鏈DNA只有一股單鏈用作轉(zhuǎn)錄模板(模板鏈);二是對不同基因同一單鏈上某些區(qū)段作為模板鏈而另一些區(qū)段作為編碼鏈，即模板鏈并非永遠在同一單鏈上。 2. 編碼鏈:DNA雙鏈上不用作轉(zhuǎn)錄模板的那一段單鏈,因

54、其堿基序列除由T代替U而外,其他與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA序列相同而得名。 3．σ（sigma）因子:原核生物RNA聚合酶全酶的成份,功能是辨認轉(zhuǎn)錄起始區(qū),這種σ因子稱σ70,此外還有分子量不同,功能不同的其他σ因子。 基本要求： 掌握轉(zhuǎn)錄與復制的區(qū)別，轉(zhuǎn)錄的不對稱性，原核生物的RNA聚合酶的組成及各亞基的功能，真核生物RNA聚合酶的分類、性質(zhì)及功能，原核生物啟動子的結(jié)構(gòu)特點，了解真核生物RNA聚合酶的組成，研究轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的方法。 二．轉(zhuǎn)錄過程 1．轉(zhuǎn)錄起始：轉(zhuǎn)錄的起始就是生成由RNA聚合酶,模板和轉(zhuǎn)錄5'端首位核苷酸組成的起始復合物。原核生物RNA5'端是嘌呤核苷酸(A、G),而且保留三磷酸

55、核苷的結(jié)構(gòu),所以其起始復合物是:pppG-DNA-RNA聚合酶。 真核生物起始,生成起始前復合物(PIC)。例如RNA-pol-Ⅱ轉(zhuǎn)錄,是由各種TFⅡ相互辨認結(jié)合,再與RNA聚合酶結(jié)合,并通過TF結(jié)合到TATA盒上. 2. 轉(zhuǎn)錄延長: 轉(zhuǎn)錄的延長是以首位核苷酸的3'-OH為基礎逐個加人NTP即形成磷酸二醋鍵,使RNA逐步從5'向3'端生長的過程。在原核生物,因為沒有細胞膜的分隔,轉(zhuǎn)錄未完成即已開始翻譯,而且在同一DNA模板上同時進行多個轉(zhuǎn)錄過程。電鏡下看到的羽毛狀圖形和羽毛上的小黑點(多聚核糖體),是轉(zhuǎn)錄和翻譯高效率的直觀表現(xiàn)。 3．轉(zhuǎn)錄終止：轉(zhuǎn)錄的終止在原核生物分為依賴Rho因子與非

56、依賴Rho因子兩類。Rho因子有ATP酶和解螺旋酶兩種活性,因此能結(jié)合轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3'末端區(qū)并使轉(zhuǎn)錄停頓及產(chǎn)物RNA脫離DNA模板。非依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止,其RNA產(chǎn)物3'-端往往形成莖環(huán)結(jié)構(gòu),其后又有一串寡聚U。莖環(huán)結(jié)構(gòu)可使因子聚合酶變構(gòu)而不再前移,寡聚U則有利于RNA不再依附DNA模板鏈而脫出。因此無論哪一種轉(zhuǎn)錄終止都有RNA聚合酶停頓和RNA產(chǎn)物脫出這兩個必要過程。真核生物轉(zhuǎn)錄終止是和加尾(mRNA的聚腺昔酸poly A)修飾同步進行的。 RNA上的加尾修飾點結(jié)構(gòu)特征是有AAAUAA序列。 基本概念： 1．轉(zhuǎn)錄起始前復合物 (pre-initiation complex,PIC):

57、是真核生物轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶一同結(jié)合于轉(zhuǎn)錄起始前的DNA區(qū)域而成的復合物。 2．加尾修飾點：真核生物mRNA轉(zhuǎn)錄不是在mRNA的位置上終止，而是在數(shù)百個核苷酸之后，研究發(fā)現(xiàn)在編碼鏈讀碼框架的3'端之后，常有一組共同序列AATAAA，再下游還有相當多GC的序列，這些序列稱為加尾修飾點,轉(zhuǎn)錄越過修飾點后，mRNA在修飾點處被切斷，隨即加入polyA。 3．Rho因子：是原核生物轉(zhuǎn)錄終止因子,有ATP酶和解螺旋酶活性。轉(zhuǎn)錄終止也可不依賴Rho因子。 基本要求： 掌握原核生物的轉(zhuǎn)錄起始復合物的形成過程，真核生物轉(zhuǎn)錄起始及起始前復合物(PIC)的生成，RNA聚合酶Ⅱ催化的轉(zhuǎn)錄起始過程中各種

58、TFⅡ的作用，轉(zhuǎn)錄延伸過程中的化學反應，原核生物的轉(zhuǎn)錄終止的兩種形式，真核生物的轉(zhuǎn)錄終止的修飾點。了解原核生物RNA聚合酶的各種亞基與真核生物的各種轉(zhuǎn)錄因子之間的關(guān)系即拼版理論，原核生物轉(zhuǎn)錄空泡的形成及轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的釋放過程。 三．真核RNA的轉(zhuǎn)錄后加工 1． mRNA轉(zhuǎn)錄后加工 真核生物轉(zhuǎn)錄生成的RNA,多需經(jīng)加工后才具備活性,這一過程稱為轉(zhuǎn)錄后修飾,mRNA轉(zhuǎn)錄后修飾包括首、尾修飾和剪接。加尾修飾是和轉(zhuǎn)錄終止同步的,5'端修飾主要是指生成帽子結(jié)構(gòu),即把5'-pppG轉(zhuǎn)變?yōu)?'-pmGpppG。其過程需磷酸解、磷酸化和堿基的甲基化。mRNA由hRNA加工而成。真核生物基因由內(nèi)含子隔斷編碼序

59、列的外顯子,是斷裂基因。內(nèi)含子一般也出現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄初級產(chǎn)物hRNA。切除內(nèi)含子,把外顯子連結(jié)在一起,就是剪接加工。在電鏡下看到加工過程,內(nèi)含子往往被彎曲成套索狀,因此稱為套索RNA?，F(xiàn)在知道剪接加工中,需要由多種Sn-RNA與蛋白質(zhì)共同組成的并接體。并接體和hnRNA上的內(nèi)含子邊界序列辨認結(jié)合。剪接過程先由含鳥苷酸的酶提供3'-OH對其中內(nèi)含子5'-端的磷酸二酯鍵作親電子攻擊使其斷裂。斷裂的外顯子3'-OH對內(nèi)含子3'-端的磷酸二酯鍵作親電子攻擊,使剛斷出的外顯子完全置換了內(nèi)含子,兩個外顯子就相連起來,因此這個過程稱二次轉(zhuǎn)酯反應。 2．tRNA轉(zhuǎn)錄后加工 tRNA的轉(zhuǎn)錄后修飾,除了剪接加工外,

60、還包括tRNA鏈上稀有堿基的形成,以及加上3'端的CCA序列。 3．rRNA的轉(zhuǎn)錄后加工 rRNA加工多采用自我剪接的形式。自我剪接的RNA本身形成一種特別的二級結(jié)構(gòu),稱為錘頭結(jié)構(gòu)。錘頭結(jié)構(gòu)是指復合的莖環(huán)組成形態(tài),但其中某些序列上必需是特定的堿基所占據(jù)。這種RNA結(jié)構(gòu),不需要任何蛋白質(zhì),就可以水解RNA鏈上某一特定位點的磷酸二酯鍵。也就是說,這是一種起催化作用的RNA,現(xiàn)稱為核酶。核酶的發(fā)現(xiàn),對酶學、分子生物學,進化生物學都是重要的理論更新,而且,醫(yī)學上已開始利用人工設計的核酶,去消滅一些作為病原體的RNA病毒或消除一些不利于生命活動的細胞內(nèi)RNA。 基本概念： 1. 剪接修飾:

61、RNA轉(zhuǎn)錄初級產(chǎn)物含有非編碼組分,通過剪接除去非編碼組分,把編碼組份連接起來。剪接修飾最常見的是靠并接體協(xié)助的二次轉(zhuǎn)酯反應,此外還可有自我剪接及需酶的剪接等剪接方式。 2. 外顯子:定義為斷裂基因上及其轉(zhuǎn)錄初級產(chǎn)物上可表達的序列。或轉(zhuǎn)錄初級產(chǎn)物上通過拼接作用而保留于成熟的RNA中的核苷酸序列或基因中與成熟RNA相對應的DNA序列． 3. 內(nèi)含子:早期定義為核酸上的非編碼序列。隨著內(nèi)含子功能的被拓寬,建議用"轉(zhuǎn)錄初級產(chǎn)物上通過拼接作用而被去除的RNA序列或基因中與這種RNA序列相對應的DNA序列"較全面。 4. 并接體：由snRNA和蛋白質(zhì)組成的核糖核酸蛋白(核蛋白)復合物。其功能是

62、結(jié)合內(nèi)含子兩端的邊界序列,協(xié)助RNA的剪接加工。 5. 核酶（ribozyme）:具有催化功能(酶的作用)的RNA分子。核酶能起作用的結(jié)構(gòu),至少含有3個莖(RNA分子內(nèi)配對形成的局部雙鏈),1至3個環(huán)(RNA分子局部雙鏈鼓出的單鏈)和至少有13個一致性的堿基位點。 基本要求： 掌握真核生物mRNA轉(zhuǎn)錄后5ˊ-端加帽；3ˊ-端加尾及mRNA鏈進行剪接修飾，tRNA及rRNA的轉(zhuǎn)錄后加工過程，了解內(nèi)含子的其他剪接方式及功能，核酶的應用。 第十三章 蛋白質(zhì)的生物合成（4學時） 本章重點: 蛋白質(zhì)合成的反應體系、三種RNA在翻譯中的作用、蛋白質(zhì)合成過程可分為起始、延長、終止三個階段。

63、原核生物翻譯起始與真核生物的區(qū)別。肽鏈合成后的加工修飾。蛋白質(zhì)生物合成的干擾和抑制。 本章難點：遺傳密碼的特性、翻譯起始復合物的形成、肽鏈延長階段的三個步驟、 蛋白質(zhì)的靶向輸送。 一.參與蛋白質(zhì)生物合成的物質(zhì) 要點: 參與翻譯過程的物質(zhì)： 需要20種氨基酸作為原料、三種RNA、蛋白質(zhì)因子（起始因子IF、延長因子EF及釋放因子RF）、酶和ATP、GTP等， 共同協(xié)調(diào)完成蛋白質(zhì)合成。 1.mRNA是翻譯的直接模板 mRNA每3個堿基組成三聯(lián)體密碼子,決定一個氨基酸的信息。有64個密碼子， 其中mRNA 5'端的AUG稱為起始密碼。UAG、UAA、UGA為肽鏈合成的終止信號， 其余61個

64、密碼子代表20種氨基酸。密碼閱讀方向是從5’到3’，決定翻譯的方向性。 遺傳密碼有以下生物特性： (1) 遺傳密碼的連續(xù)性，即從AUG開始，各密碼子連續(xù)閱讀而無間斷，若有堿基插入或缺失，會造成框移突變； (2) 簡并性，大部分氨基酸有多個密碼子，以2～4個居多，可有6個。這種由多種密碼編碼一種氨基酸的現(xiàn)象稱為簡并性。決定同一種氨基酸密碼子的頭兩個堿基是相同的,第三位堿基不同,第三位堿基發(fā)生點突變時仍可翻譯出正常的氨基酸； (3) 擺動性，mRNA密碼子的前兩位堿基和tRNA的反密碼嚴格配對。而密碼第三位堿基與反密碼第一位堿基不嚴格遵守配對規(guī)則，稱為密碼配對的擺動性。見表1-1. 表1

65、-1 密碼子、反密碼子配對的擺動現(xiàn)象 tRNA反密碼子第一個堿基 I U C A G mRNA密碼子第三個堿基 U,C,A A,G G U U,C (4)通用性，生物體的遺傳密碼相同，稱密碼的普遍性。但線粒體密碼子有例外。如AUA與AUG均代表Met和起始密碼子；UGA為Trp密碼子而不是終止密碼子等。 2.核蛋白體是肽鏈合成的場所 核蛋白體由大、小亞基構(gòu)成，每個亞基含不同的蛋白質(zhì)和rRNA。大亞基有轉(zhuǎn)肽酶活性，有容納tRNA的二個部位: A位，即氨基酰位,P位，即肽酰位。 3.tRNA和氨基酰-tRNA tRNA的作用是攜帶并轉(zhuǎn)運特異

66、氨基酸。tRNA分子上3'端的CCA序列是結(jié)合氨基酸的部位，反密碼環(huán)可特異識別mRNA的密碼序列。 (1)氨基酰-tRNA合成酶。 氨基酰-tRNA合成酶可高度特異識別氨基酸及tRNA底物，保證各氨基酸與相應數(shù)種tRNA準確結(jié)合。氨基酸-tRNA合成酶催化的反應分為兩步： 氨基酸＋ATP-E───→氨基酸-AMP-E＋PPi 氨基酰-AMP-E＋tRNA ───→氨基酰-tRNA+AMP + E 此反應使氨基酸羧基活化，并使活化氨基酸轉(zhuǎn)移到tRNA 3'端CCA-OH,形成氨基酸的活性形式,氨基酰-tRNA。 (2)氨基酰-tRNA的表示方法 原核細胞tRNA攜帶的甲硫氨酸可被甲?；QtRNAifmet，fMet- tRNAifmet專一識別起始密碼AUG，第一個進入核蛋白體循環(huán)。 甲酰轉(zhuǎn)移酶 N10-甲酰四氫葉酸＋Met－tRNAifmet─────→四氫葉酸＋fMet- tRNAifmet 基本要求: 1. 熟悉遺傳密碼的生物特性。 2. 掌握氨基酰-tRNA合成酶的催化活性及特異性. 3. 掌握三種RNA在蛋白質(zhì)合成中的功能。 基本概念: 1