參與DNA復(fù)制的酶類及DNA復(fù)制的調(diào)控(論文資料).ppt

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1、第三章 參與DNA復(fù)制的酶類及DNA復(fù)制的調(diào)控 第一節(jié) 參與DNA復(fù)制的酶類 DNA復(fù)制過程非常復(fù)雜，至少有20多種酶與蛋白質(zhì)參與。 一、DNA聚合酶(DNA polymerase)(一)作用機理 DNA聚合酶催化4種脫氧核苷酸合成DNA，即催化前一個脫氧核苷酸3OH與后一個脫氧核苷酸5P之間形成3,5-磷酸二酯鍵的反應(yīng)，從而延長DNA鏈，鏈延伸方向為53，添加脫氧核苷酸的種類按堿基互補原則由模板DNA決定。 DNA聚合酶需要互補于DNA模板上的一小段RNA作引物，由引物提供DNA合成時需要的第一個3OH。因此DNA聚合酶需要的條件包括4種dNTP底物、Mg2、模板DNA和引物（圖3-1

2、）。,圖3-1 DNA聚合酶的催化作用,DNA聚合酶與3OH端周圍的單鏈DNA模板結(jié)合， 若進入的脫氧核苷酸的堿基與模板配對，該底物則結(jié)合到酶的三磷酸結(jié)合部位上。 在聚合酶催化下，引物鏈的3OH對底物的5P進行親核攻擊，釋出焦磷酸根，形成磷酸二酯鍵，新生鏈由此延長一個核苷酸，酶沿著模板鏈向前移動一個核苷酸距離。 如此重復(fù)，直至酶到達模板終點。在體內(nèi)釋放的焦磷酸被焦磷酸酶水解，使反應(yīng)平衡趨向DNA合成.,2005年12月Science報道了DNA聚合酶高保真機理的新發(fā)現(xiàn)。高保真聚合酶除具有廣為人知的校正功能外,最近實驗進一步表明, 由不能及時校正或難于糾正的錯配堿基引發(fā)“關(guān)閉” DNA聚合

3、反應(yīng)的效應(yīng), 同樣保證了DNA聚合反應(yīng)終產(chǎn)物純度。 高保真聚合酶這一“關(guān)閉” DNA聚合反應(yīng)的能力, 促成其與耐外切酶消化3末端敏感區(qū)堿基特異性引物共同構(gòu)成一個SNP敏感性納米級復(fù)合分子“開/關(guān)”，高保真聚合酶分子中相距三納米聚合中心和3端敏感區(qū) 5端敏感區(qū)外切酶酶解中心則既合作又獨立地起到了復(fù)合分子開關(guān)中“開”和“關(guān)”的效能:對配對的引物，則直接在該酶聚合中心進行聚合反應(yīng)，即“開”的效應(yīng)；,而對于3 末端敏感區(qū)錯配的引物，則從該酶聚合中心轉(zhuǎn)移至3末端敏感區(qū) 5 末端敏感區(qū)外切酶酶解中心，由于引物修飾了3 末端敏感區(qū)耐外切酶的特點，繼而出現(xiàn)了一種長時間無酶解產(chǎn)物的酶解過程，最后因酶聚合中心空轉(zhuǎn)

4、而“關(guān)”閉DNA聚合反應(yīng)，即“關(guān)”的效應(yīng)。 這一新的復(fù)合分子“開/關(guān)”在很大程度上滿足了后基因時代對SNP分析的要求。該SNP分子開關(guān)的應(yīng)用, 使基因診斷提高到單堿基水平。同時, 利用該方法通過SNP對基因組掃描, 在單基因遺傳病病因研究及法醫(yī)學鑒定上具有很強的理論和實用價值。,2006年7月Nature報道新發(fā)現(xiàn)突變相關(guān)的DNA聚合酶(Pol)可能導致DNA復(fù)制保真度下降而參與突變形成。除人細胞中已知的5種Pol，Pol、、、、，Pol、的復(fù)制保真度很低?？赡茉谶z傳不穩(wěn)定形成中有作用。近兩年來，據(jù)原核和低等真核細胞復(fù)制后修復(fù)(PRR)途徑的研究成果，在人細胞中克隆了5個新的Pol:Pol

5、 、、、和Rev1編碼蛋白。 大腸桿菌SOS反應(yīng)中的非定標性突變的發(fā)生與dinB基因有關(guān)。DinB蛋白有Pol活性(Pol )，無35校讀功能。高表達時可導致非定標性突變明顯升高達上千倍。無損傷模板摻入錯誤率達10-310-4；大腸桿菌跨損傷DNA合成依賴于UmuD2C復(fù)合體，其中介導的途徑通常是易誤性的，它的突變引起誘發(fā)突變頻率的抑制。,UmuD2C復(fù)合體也具有Pol活性(稱為Pol V)。它在損傷或未損傷DNA模板皆表現(xiàn)為高度易誤性，能有效跨越DNA上無堿基部位(abasic site)并優(yōu)先插入一個腺嘌呤。 釀酒酵母PRR途徑有三個獨立旁路(一個易誤，兩個無誤)。基因REV1、REV3和

6、REV7與易誤性旁路有關(guān)。其中Rev3和Rev7蛋白構(gòu)成Pol，Rev1蛋白為有DNA模板指導的dCMP轉(zhuǎn)移酶活性，因此也是一種Pol。 在芽生酵母中的兩條無誤PRR途徑依賴RAD5和RAD30基因。RAD30基因與大腸桿菌的DinB和UmuC和釀酒酵母中的Rev1基因同源。它可在DNA合成時在嘧啶二聚體的對面正確摻入兩個腺嘌呤。它是一個保真度很低的Pol，其摻入差錯率高達10-2到10-3。,這些與突變形成密切相關(guān)的Pol在人細胞中都找到了相應(yīng)的同源物基因，與酵母中的REV3同源的hREV3編碼的Pol以及與Rev1同源的基因；與大腸桿菌中的DinB和酵母RAD30同源的hDinB基因編碼P

7、ol；與大腸桿菌UmuC和酵母RAD30同源的hRAD30基因編碼Pol、另一與酵母RAD30同源的hRAD30B編碼的Pol。已證明著色性干皮病變型(XPV)系Po1的突變所致。 這些新發(fā)現(xiàn)的Pol，可能與誘發(fā)的細胞遺傳不穩(wěn)定的形成有關(guān)。我們證明用反義核酸技術(shù)阻斷Pol表達的細胞系MNNG誘發(fā)的非定標性突變的頻率減低。,(二)原核生物DNA聚合酶 在大腸桿菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了三類DNA聚合酶，根據(jù)發(fā)現(xiàn)時間順序分別命名為DNA聚合酶、、。 1.DNA聚合酶I 大腸桿菌DNA聚合酶I是第一個被鑒定的DNA聚合酶，它由polA基因座編碼，是一個103kD的單鏈多肽。每個大腸桿菌細胞中約有400個分子

8、DNA聚合酶I。 當?shù)孜锖湍０宕嬖跁r，聚合酶I可使脫氧核糖核苷酸依次加到具有3-OH末端的多核苷酸鏈上。它的催化需要引物鏈（DNA或RNA鏈）的存在。在37條件下，每分子DNA聚合酶I每分鐘中催化約1000個核苷酸的聚合。,DNA聚合酶I是一個多功能酶，它可以催化以下的反應(yīng)： （1）DNA鏈沿53方向延長（DNA聚合酶活性）。 （2）從3端水解DNA鏈（35核酸外切酶活性）。 （3）從5端水解DNA鏈（53核酸外切酶活性）。 （4）具有很強的校對功能（ 35核酸外切酶活性）。 （5）有切口平移功能（53核酸外切酶活性）。 用蛋白水解酶將DNA聚合酶I作有限水解，可得到分子量68kD和36k

9、D的兩個片段。,較大的斷裂產(chǎn)物（68kD）叫Klenow片段，在體外它可催化DNA的合成反應(yīng)，Klenow片段有DNA聚合酶活性和35核酸外切酶活性，兩種活性分別處于片段的不同區(qū)域。 C端的2/3片段具有聚合酶活性，N端的13片段有核酸外切酶活性，在蛋白質(zhì)中，兩個活性位點的距離為3nm，表明堿基的加入和去除功能在空間上是分開的。 小片段（35kD）有53核酸外切酶活性，可以切除少量的核苷酸，一次最多切除10 個鹼基。,該酶在切除由紫外線照射而形成嘧啶二聚體中起重要作用，在DNA的半不連續(xù)合成中，岡崎片段5-端RNA引物的切除可能也依賴于該外切酶，小亞基的外切酶活性和大亞基的聚合校對功能協(xié)同作

10、用，使DNA聚合酶I在體外具有從切口處起始復(fù)制的獨特能力，而其他DNA聚合酶不具備這種能力。 在雙鏈DNA的磷酸二酯鍵斷裂處，DNA聚合酶I可延伸3末端，合成新的DNA片段后，DNA聚合酶I可置換雙螺旋中已有的同源鏈。,置換出的同源鏈被53核酸外切酶降解。除部分片段被新合成的材料取代且缺口位置沿雙螺旋移動外，DNA性質(zhì)沒有任何改變。 該反應(yīng)在實踐中很有意義，體外的切口移位是在DNA分子上引入放射性標記核苷酸的重要技術(shù)，在體內(nèi)，53聚合酶合成活性和35核酸外切酶活性主要用來填充DNA雙鏈中短的單鏈區(qū)域，復(fù)制過程中或從DNA中切除受損的鹼基后會產(chǎn)生這些單鏈區(qū)域。,2.DNA聚合酶II DNA聚合

11、酶II是一條分子量為120KD的多肽鏈。該酶活性很低，只有DNA聚合酶I的5。它也以4種脫氧核苷酸為底物，按53方向合成DNA。DNA聚合酶II具有35核酸外切酶活性，但無53外切酶活性。它在DNA修復(fù)中起一定作用。 3.DNA聚合酶III 盡管細菌中存在大量的DNA聚合酶I，但它并不是復(fù)制的主要酶。在polA的突變型中，復(fù)制仍可繼續(xù)進行。 目前，DNA聚合酶III（PolIII）被認為是真正負責大腸桿菌細胞內(nèi)DNA合成的復(fù)制酶。 DNA聚合酶III是多個亞基組成的蛋白質(zhì)，細胞中含量很少，在每個細胞中只有1020個拷貝的全酶。 PolIII全酶由、、、、、、、、、10種不同的亞基組

12、成，至少含3種重要的酶活性。,核心聚合酶（core polymerase）由、、三種亞基組成，其中亞基分子量為130kD，由dnaE編碼，具有53的聚合活性，每秒可以合成8個核苷酸。 亞基具有35核酸外切酶的校對功能，由dnaQ編碼合成。在體內(nèi)亞基基本功能是保證復(fù)制的忠實性，這可由dnaQ突變體的表型所證實，在細菌株中突變發(fā)生的概率增加了1000倍。亞基常與亞基形成一個緊密的1：l復(fù)合物，協(xié)同發(fā)揮功能。 細胞中大約有40分子核心酶，其中只有一半被組裝到全酶中,核心酶活性較低，以大約每秒20個核苷酸的速度合成DNA。,二聚體：亞基是以二聚體的形式存在，在復(fù)制過程中二聚體環(huán)繞著DNA，并能在D

13、NA上自由滑動，構(gòu)成一個滑動鉗。 滑動鉗可把全酶束縛在DNA模板上，從而保證高度的進行性，當pol結(jié)合鉗時，全酶的進行性可從每次聚合10個核苷酸提高到每次聚合50000個核苷酸，聚合反應(yīng)速度從每秒20個核苷酸上升到每秒750個核苷酸，因此鉗的存在對大腸桿菌染色體高效復(fù)制是十分重要的，亞基可以很容易從全酶中脫離。 與核心酶相比，在細胞中亞基含量很豐富，大約每個細胞中含300個二聚體。,復(fù)合物：復(fù)合物（complex）是滑動鉗的載體,可幫助滑動鉗結(jié)合到DNA上。復(fù)合物含有5個不同亞基，形成一種化學計量為21111的結(jié)構(gòu)。和亞基是由不同基因編碼產(chǎn)生的不同蛋白質(zhì)。復(fù)合物有依賴DNA的ATP酶活性。

14、 二聚體自己并不能組裝到DNA上 ，它是通過復(fù)合物與ATP協(xié)同作用催化ATP的水解而組裝到DNA上。 DNA聚合酶、、均具有53聚合酶活性和35核酸外切酶活性，因此在合成DNA時，能識別和切除不配對的引物末端，起著嚴格校對作用，以保證復(fù)制的真實性。,DNA聚合酶的特別之處在于它具有53外切酶活性。這種活性只作用于雙鏈DNA，從5-端切除寡核苷酸。由于它能跳過幾個核苷酸起作用，因此能切除由紫外線照射形成的胸腺嘧啶二聚體，參與DNA損傷的修復(fù)。 DNA聚合酶能催化切口平移和鏈置換反應(yīng),雙鏈DNA的一條鏈發(fā)生斷裂，出現(xiàn)切口，DNA聚合酶與切口結(jié)合，其53外切酶活性與聚合作用同時發(fā)生。即它一邊催

15、化3-OH與三磷酸核苷酸產(chǎn)生聚合反應(yīng)，一邊在5端逐一水解核苷酸，切口就沿著DNA鏈從53方向移動。這種移動稱為切口平移（nick translation）（圖3-2）。,圖3-2 DNA聚合酶I的切口平移,如果選擇合適的實驗條件，使聚合作用發(fā)生在單鏈切口處而不同時出現(xiàn)53外切酶活性，這種延伸中的鏈就置換了親鏈，即所謂鏈置換反應(yīng)，這被認為是遺傳重組機制中的一個重復(fù)步驟。 在迄今所知的大腸桿菌聚合酶中，唯有DNA pol能獨立地進行鏈置換反應(yīng)。其它鏈置換反應(yīng)中，需要輔助蛋白，并裂解ATP為解螺旋提供能量。,利用切口平移反應(yīng)，可獲得標記的DNA探針。 將DNA聚合酶、帶有切口的雙鏈DNA分子以及放

16、射性標記的三磷酸脫氧核糖核苷一起反應(yīng)，可合成帶有放射性標記的DNA探針，而同時降解未被標記的DNA。 DNA聚合酶在DNA損傷時表達增加，還參與SOS修復(fù)反應(yīng)，能以損傷的DNA鏈為模板合成新生鏈。這種特性易于造成DNA的永久突變。 表3-1總結(jié)了原核生物三種DNA聚合酶的特性和功能。,表3-1 原核生物DNA聚合酶性質(zhì)比較,(三)真核生物DNA聚合酶 真核生物中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)五種DNA聚合酶，分別命名為....等。 它們的基本性質(zhì)與原核生物DNA聚合酶相似，其活性依賴于帶有3OH的引物、DNA模板和4種dNTP。表3-2列出了真核生物DNA聚合酶的基本特性和功能。,,,,,,表3-2 真核生

17、物DNA聚合酶性質(zhì)總結(jié),二、真核生物DNA聚合酶附屬蛋白 利用SV40體外復(fù)制系統(tǒng)，已相繼鑒定出一些真核生物DNA聚合酶附屬蛋白。主要有增殖細胞核抗原（PCNA），復(fù)制因子C（RFC）、識別引物的PRP1和PRP2蛋白以及聚合酶相關(guān)因子（AAF）等。 1.PCNA是DNApol的附屬蛋白 能極大地促進DNApol的合成活性。其分子量為36103。已在人、大鼠、小鼠、果蠅、酵母等生物中克隆了PCNA的基因。它們的氨基酸序列有較高同原性，結(jié)構(gòu)也相當保守。 PCNA可能是通過與RFC和ATP自由結(jié)合到引物末端，或通過ATP非依賴方式滑動到引物末端而增強DNApol的催化效率。最近有研究表明，P

18、CNA在DNA的切除修復(fù)中起一定作用。,2.RFC是一個多亞基復(fù)合物 因細胞類型的不同，RFC亞基數(shù)也從3個到7個不等。140103的大亞基識別DNA模板引物，40103小亞基結(jié)合ATP,RFC在體外能增強DNApol和的活性。RFC結(jié)合到引物末端并通過DNA刺激的ATPase活性與PCNA結(jié)合形成一個引物識別復(fù)合物。此復(fù)合物對DNApol的親和力高而與DNApol的親和力低。 3.PRP1和PRP2是兩個引物識別蛋白 分子量分別為36103和43103，它們降低引物末端的Km，使DNApol與模板引物末端的親和力增加2030倍，從而促進DNApol的活性。 4.AAF是模板親和蛋白 A

19、AF由兩個亞基組成，分子量分別為132103和44103。它是一種模板親和蛋白，有促進DNApol引發(fā)酶利用未經(jīng)引發(fā)的模板，作為一種DNApol引發(fā)酶的活化因子，AAF輔助它們在后隨鏈上的催化活性。,三、DNA引物酶 E-coli的引物酶由DnaG基因編碼，合成的引物是pppAC（N）7-10。真核生物引物酶是由48X103和58X103二個亞基組成的異源二聚體，與DNApol形成緊密復(fù)合物，合成的引物為pppA（N）10，其特點是緩慢起始，快速聚合及在DNApol起始合成前準確終止。 四、DNA連接酶 DNA連接酶催化岡崎片段間磷酸二酯鍵的形成,不同于聚合酶的催化反應(yīng)。當DNA雙鏈中

20、的一條單鏈是完整的，DNA連接酶能催化另一條鏈的相鄰5P與3OH之間形成3,5-磷酸二酯鍵，且偶聯(lián)NAD（原核生物）或ATP（真核生物）的水解（圖 3-3）。,圖3-3 連接酶連接模板鏈上相鄰兩個片段的切口,DNA連接酶除了可以閉合雙鏈DNA中的單鏈切口，還可閉合RNADNA雜交體雙鏈中的單鏈切口，但不能閉合雙鏈RNA中的單鏈切口。在有過量ATP存在時，T4噬菌體連接酶可連接平頭雙鏈DNA，但大腸桿菌連接酶不能催化這種連接反應(yīng)。 原核生物大多只有一種形式連接酶，真核生物則有多種形式連接酶。不同形式連接酶的催化特性，對底物及ATP親和力以及對細胞增殖的作用均有所不同。 DNA連接酶的催化性質(zhì)，

21、決定了該酶在DNA復(fù)制中的重要地位，它的作用還涉及到DNA修復(fù)和重組以及DNA重組技術(shù)。,五、與DNA解旋和解鏈有關(guān)的酶 在雙鏈DNA復(fù)制過程中，由于復(fù)制叉的移動速度快（原核生物為1000bp/s,真核生物為100bp/s），DNA雙螺旋不斷解開，在復(fù)制叉前方的DNA雙鏈會出現(xiàn)過度的正超螺旋甚至打結(jié)現(xiàn)象，阻礙DNA的繼續(xù)復(fù)制，生物體依靠一系列DNA解旋解鏈酶，不斷消除產(chǎn)生的正超螺旋，保證復(fù)制的進行。 (一)DNA螺旋酶（DNA helicase） 也稱DNA解旋蛋白（DNA unwinding protein）。它的作用是催化雙螺旋DNA的解旋和解鏈。該過程需水解ATP提供能量（打開

22、一個AT對約需5KJ.mol-1，打開一個GC對約需21KJ.mol-1）。,從大腸桿菌分離得到數(shù)種DNA螺旋酶，分別稱為螺旋酶、、和rep蛋白等,后三者與大腸桿菌DNA復(fù)制有關(guān)。 在復(fù)制過程中，螺旋酶、沿著后隨鏈模板，從53方向移動，促使復(fù)制叉向前延伸，而rep蛋白是沿著前導鏈模板，以35方向向前移動，促進雙鏈不斷解開。 在真核生物中也發(fā)現(xiàn)多種螺旋酶，如從小牛胸腺中分離到8種螺旋酶，但有關(guān)其作用機制及其在DNA復(fù)制中所起的確切作用仍不清楚。 現(xiàn)在正試圖克隆和表達螺旋酶的基因，分析它的結(jié)構(gòu)并研究其是否細胞存活所必需，研究其是否受細胞周期調(diào)控以及在復(fù)制叉模型中的作用。,(二)拓撲異構(gòu)酶（T

23、opo merase） 在原核和真核生物中都發(fā)現(xiàn)二類拓撲異構(gòu)酶（和）。原核生物中與復(fù)制有關(guān)的主要是Topo，又稱DNA回旋酶（DNA gyrase），原核生物Topo可能與轉(zhuǎn)錄有關(guān)。 DNA回旋酶的作用是在水解ATP的同時使松馳態(tài)環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)變?yōu)樨摮菪鼶NA。這種作用很復(fù)雜，涉及三個步驟： （1）DNA回旋酶首先與DNA結(jié)合，并使環(huán)狀DNA扭曲而形成一“右手結(jié)”結(jié)構(gòu)。這個作用是形成一個穩(wěn)定的正超螺旋（以“”表示），同時又引入一個負超螺旋（以“”表示）。,（2）然后DNA回旋酶在右手結(jié)的背后打斷雙鏈DNA，并穿到另一條鏈前面，這樣就將右手性正超螺旋變?yōu)樽笫中载摮菪?（3）最后斷點再連

24、接起來。這個過程需ATP水解供能；引入的負超螺旋能使打開堿基對所需的能量降低約4.1KJ.mol-1,利于DNA解鏈復(fù)制（圖3-4） 。,圖3-4 拓撲異構(gòu)酶的催化作用,真核生物中Topo和均與復(fù)制有關(guān)。Topo不需消耗ATP，其酪氨酸殘基能與DNA 3P基團形成共價結(jié)合的中間產(chǎn)物，它能使負或正超螺旋變?yōu)樗神Y態(tài)。 Topo需要ATP供能，它不僅參與DNA復(fù)制，還促進兩個子代分子分離。 真核生物Topo無論在細胞增殖期還是在靜止期，都維持在較高水平，與細胞生長速率無關(guān)。而Topo水平在細胞增殖期比在細胞靜止期高100倍以上。,令人感興趣的是Topo在腫瘤細胞水平很高，與其增殖潛能相平行。

25、有人從中得到啟發(fā)，正在研究Topo的抑制劑，觀察它在腫瘤治療中的效果。 Topo與Topo的另一不同之處在于它獨特地沿著染色體分布，與染色體結(jié)構(gòu)、壓縮及核基質(zhì)組成有關(guān)。,(三)單鏈結(jié)合蛋白(Single-strand Binding protein,SSB） SSB對單鏈DNA的親和力極高，但幾乎沒有序列特異性。它們的基本特征是結(jié)合單鏈DNA，刺激DNA聚合酶的活化并與其他復(fù)制蛋白作用形成復(fù)合物等。 SSB常組成同亞基多聚體，它與DNA的結(jié)合呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)。 最早研究得較為清楚的是E-coli SSB蛋白以及T4噬菌體基因32產(chǎn)物。,在哺乳動物細胞中分離的單鏈結(jié)合蛋白，命名為復(fù)制因子A（RFA

26、）。 RFA由分子量分別為70KD、32-34KD和11-14KD的三個不同亞基組成。其中76KD的大亞基具有單鏈DNA結(jié)合活性，還能促進DNApol和的聚合作用，32KD的亞基可被CDK2激酶磷酸化，與細胞周期有關(guān)。 RFA不僅在DNA復(fù)制時，起始解鏈中起作用，還促進DNA鏈的延長。圖3-5總結(jié)了與DNA復(fù)制有關(guān)的酶在大腸桿菌復(fù)制叉中的作用。,圖3-5 各種因子在DNA復(fù)制中的作用,第二節(jié) DNA復(fù)制的調(diào)控 DNA復(fù)制是細胞增殖的一個關(guān)鍵事件，因此，DNA復(fù)制與細胞分裂是互相協(xié)調(diào)、互相調(diào)控的。 “細胞分裂周期” 也稱“細胞周期” ，是指一個細胞經(jīng)生長、分裂而增殖成兩個細胞所經(jīng)歷的全過程

27、，通?？煞譃槿舾呻A段，即G1期、S期、G2期和M期。 細胞在G1期完成必要的生長和物質(zhì)準備，在S期完成其遺傳物質(zhì)染色體DNA的復(fù)制，在G2期進行必要的檢查及修復(fù)以保證DNA復(fù)制的準確性，然后在M期完成遺傳物質(zhì)到子細胞中的均等分配，并使細胞一分為二。,原核細胞DNA復(fù)制完成后即發(fā)生細胞分裂，而真核細胞中DNA復(fù)制只發(fā)生在細胞周期中特定時期，細胞周期合成期-S期。 通常在一個細胞周期中，DNA必須也只能復(fù)制一次?？茖W家發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)有一個調(diào)控機構(gòu)，使細胞周期能有條不紊地依次進行。細胞周期各期的轉(zhuǎn)變均受某些基因產(chǎn)物的調(diào)節(jié)，其中有細胞周期蛋白家族（Cyclins）、細胞周期依賴性蛋白激酶家族（Cycl

28、in Dependent protein Kinases,CDKs）和其它一些蛋白質(zhì)。,細胞能否分裂最主要決定因素是其能否進入S期，即是否進行DNA復(fù)制。 細胞周期調(diào)控主要發(fā)生在從G1S和從G2M這二個關(guān)鍵點上，調(diào)節(jié)這二個關(guān)鍵點的事件都涉及Cyclin和CDK的作用。通過蛋白激酶對多種蛋白質(zhì)特殊調(diào)節(jié)位點的磷酸化而激活或抑制它們的活性，以適應(yīng)其功能需要。 細胞周期調(diào)控有關(guān)的蛋白激酶都是由調(diào)節(jié)亞基和催化亞基組成的異源二聚體。調(diào)節(jié)亞基稱為細胞周期蛋白（Cyclin）,其濃度隨細胞周期而變化；催化亞基又稱細胞周期蛋白依賴激酶（CDKs）。同一CDK可與不同的周期蛋白相連接以決定不同的蛋白質(zhì)被磷酸化。,

29、哺乳動物中，調(diào)控DNA合成起始的周期蛋白和CDK通常為周期蛋白E或A及與之相關(guān)聯(lián)的CDK2，而調(diào)節(jié)有絲分裂起始的常是周期蛋白A和B及與之相關(guān)聯(lián)的激酶CDK2。 爪蛙卵提取物實驗發(fā)現(xiàn)，DNA起始復(fù)制必須有CDK2和周期蛋白E或A的存在。 在鼠成纖維細胞中，周期蛋白E的過度表達導致細胞很快從G1期進入S期。 以上證實CDK2及周期蛋白E在調(diào)控DNA復(fù)制起始中的作用。,酵母細胞中發(fā)現(xiàn)一類S期啟動蛋白（S-phase promoting factor，SPF），它由細胞周期蛋白依賴激酶CDK28和周期蛋白G1組成。 CDK28蛋白由CDK28基因編碼，在溫度敏感突變株中，CDK28失活，細胞不

30、能進入S期，DNA不能合成。編碼G1蛋白的基因有三個：cln1、cln2、cln3。 利用基因敲除技術(shù)（gene knockout）缺失三個cln基因中的任一個，細胞仍能存活，而同時缺失三個cln基因，細胞只能停留在G1期，不能起始DNA合成。,最近發(fā)現(xiàn)有更多的周期蛋白和CDK參與細胞周期中DNA復(fù)制的調(diào)控。 如周期蛋白D及與之相關(guān)的CDk4在G1期結(jié)束時達到高峰，而在S期開始時即下降，提示它們在G1S期轉(zhuǎn)換中起作用（表3-3）。,表3-3 酵母細胞及哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的CDk和周期蛋白,2001年度諾貝爾生理學醫(yī)學獎獲得者美英科學家，因為發(fā)現(xiàn)了細胞周期關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子細胞周期依賴性蛋白激酶（CD

31、K）和周期蛋白（cyclin）。,,,,,,,2001年諾貝爾生理學醫(yī)學獎得主（依次為利蘭哈特韋爾提莫西.亨特保羅.納斯）,細胞周期的準確調(diào)控對生物的生存、繁殖、發(fā)育和遺傳均是十分重要的。簡單生物調(diào)控細胞周期主要是為適應(yīng)自然環(huán)境，以便根據(jù)環(huán)境狀況調(diào)節(jié)繁殖速度，以保證物種繁衍。復(fù)雜生物細胞則需面對來自自然環(huán)境和其他細胞、組織的信號，并作出正確的應(yīng)答，以保證組織、器官和個體的形成、生長以及創(chuàng)傷愈合等過程能正常進行，因而需要更為精細的細胞周期調(diào)控機制。 早期研究集中在細胞周期的特性上，主要發(fā)現(xiàn)了細胞周期有序性，并發(fā)現(xiàn)在G1晚期內(nèi)有一個關(guān)鍵的限制點，也稱R點:通過R點的細胞將不可逆地進入S期直至完成細

32、胞分裂，否則則可因環(huán)境或內(nèi)部的不利變化而繼續(xù)留在G1期。,為認識細胞周期調(diào)控分子機制，科學家研究了各種實驗材料，包括微生物、軟體動物、昆蟲、兩棲動物和哺乳類動物等。 哈特韋爾博士在1970年以單細胞生物面包酵母（也稱芽殖酵母）為材料，利用遺傳學方法，先后發(fā)現(xiàn)上百個突變后導致細胞周期異常的基因。其中一個被稱作CDC28基因，對細胞周期啟動，即細胞能否通過R點（在酵母中被稱為啟動點）很關(guān)鍵，因此也被稱作啟動基因。,納斯博士則以裂殖酵母為實驗材料，發(fā)現(xiàn)了功能及編碼蛋白均與CDC28非常相似的CDC2基因，并從高等生物中也克隆到了類似基因，從而說明細胞周期調(diào)節(jié)機制在進化過程中是保守的:從酵母到人，其細

33、胞周期進行都由CDC2基因控制。 后來這類基因被統(tǒng)稱作CDK基因，為周期蛋白依賴性蛋白激酶的英文縮寫。有趣的是，盡管酵母細胞中只有一個CDK基因，高等生物中卻有多個，體現(xiàn)了進化程度不同的物種對調(diào)控系統(tǒng)復(fù)雜性和精確性的不同需求。,亨特從海膽中發(fā)現(xiàn)了CDK的“伴侶”--周期蛋白。這類蛋白因其含量在細胞周期中呈周期性變化而被發(fā)現(xiàn)并得名。周期蛋白與CDK蛋白形成復(fù)合物，使CDK發(fā)揮激酶活性。有活性的激酶把磷酸基聯(lián)到特定蛋白質(zhì)上，使后者性質(zhì)發(fā)生變化，從而又影響其下游蛋白，如此實現(xiàn)調(diào)節(jié)功能。 酵母細胞只有一個CDK基因，但有若干種周期蛋白基因。不同周期蛋白在不同時期被合成出來，然后又被適時 地降解。這樣，

34、CDK激酶活性就像引擎中汽缸一樣被依次點燃，從而驅(qū)動細胞周期周而復(fù)始地“轉(zhuǎn)動”，細胞不斷增殖。 高等生物含有多個CDK，每種CDK可與不同周期蛋白結(jié)合，反之亦然。如此復(fù)雜的搭配可能會增加在同種細胞內(nèi)的調(diào)節(jié)精度，也可能用于在不同組織的細胞中實現(xiàn)不同的調(diào)節(jié)，而有的CDK復(fù)合物則參與調(diào)節(jié)其他生命活動，如神經(jīng)細胞分化等。除周期蛋白外，CDK活性還受到磷酸化、去磷酸化、CDK抑制蛋白等的調(diào)節(jié)。細胞周期調(diào)控的復(fù)雜性，由此可見一斑。,細胞周期與多種人類疾病相關(guān)，其中最重要的莫過于與腫瘤和癌癥的關(guān)系。腫瘤和癌癥的主要原因是細胞周期失調(diào)后導致的細胞無限制增殖。 從分子水平看，由于基因突變致使細胞周期促進因子（或

35、稱“癌蛋白）不恰當?shù)幕罨?，和或抑制因子（即“抑癌蛋白”）失活，造成細胞周期調(diào)節(jié)失控。其中，破壞R點正常控制、由癌蛋白使細胞同期調(diào)控系統(tǒng)總得到“增殖”指令，導致腫瘤細胞大量增殖。所以，阻止癌細胞分裂即可達到抑制其惡性生長甚至將其殺滅的目的。實際上多數(shù)腫瘤化療藥物均是細胞周期抑制劑，但缺點是它們“良莠不分”，也抑制正常細胞。 對細胞周期分子機制的研究，不僅使我們能深刻認識這一重要生命活動的本質(zhì)，還可能通過針對性的設(shè)計和篩選，開發(fā)出更專一、更有效的治療藥物及治療方法。深入的研究也將使相關(guān)疾病病因的基因診斷和針對性基因治療成為可能。,一、復(fù)制起始位點的選擇 真核細胞基因組DNA有多個復(fù)制起始位點，是

36、否每次復(fù)制時都起用所有起始位點，要視細胞分裂的快慢、細胞周期的長短，特別是S期的長短。 在動物發(fā)育過程中，細胞周期中的S期可以短至幾分鐘，或長至幾個小時。在胚胎期，細胞分裂很快，S期很短，基因組復(fù)制在幾分鐘內(nèi)完成，起用復(fù)制起始位點很多。 在成熟組織中，細胞分裂較慢，S期較長，基因組復(fù)制在幾個小時內(nèi)完成，起用復(fù)制起始位點較少。在蟾蜍和果蠅的發(fā)育過程中，在中囊胚期轉(zhuǎn)變之前，DNA復(fù)制起始位點沒有特異性；在中囊胚期轉(zhuǎn)變之后，DNA復(fù)制有選擇地在某些DNA復(fù)制起始位點起始。,有研究表明，真核細胞Pre-RC在許多復(fù)制起始位點上組裝，但是有Pre-RC組裝的復(fù)制起始位點并不一定起始DNA復(fù)制。 也就

37、是說，有Pre-RC組裝的復(fù)制起始位點數(shù)目比實際上發(fā)揮起始DNA復(fù)制作用的復(fù)制起始位點數(shù)目大。這些現(xiàn)象表明真核生物體內(nèi)存在調(diào)控復(fù)制起始位點的機制。 復(fù)制起始位點的調(diào)控主要表現(xiàn)在兩個方面： 1.調(diào)控啟動DNA復(fù)制起點的多少。 2.調(diào)控在哪些復(fù)制起點上起始DNA的復(fù)制。,所謂DNA復(fù)制起點有兩個概念，即遺傳性（或結(jié)構(gòu)性）和功能性。遺傳性起點是一種DNA順式作用元件，可使環(huán)形DNA自主復(fù)制。功能性起點是染色體上確實起始DNA復(fù)制的位點。 在原核生物基因組中，只有一個DNA順式作用元件與復(fù)制起始蛋白相互作用，成為復(fù)制的功能性起點。 真核生物基因組比原核生物基因組大得多，具有很多遺傳性起點，但并不

38、是每個遺傳性復(fù)制起點都作為功能性起點起始DNA復(fù)制。在真核生物中，有多種因素參與決定遺傳性復(fù)制起點起始DNA復(fù)制。,酵母復(fù)制起點叫自主復(fù)制序列（ARS）。有些可在體外使環(huán)狀DNA復(fù)制的ARS，在酵母染色體中并不起始DNA復(fù)制。如在酵母3號染色體中有14個ARS元件，但具有起始復(fù)制功能的只有6個，其它ARS都不能起始DNA復(fù)制。功能性復(fù)制起點在染色體內(nèi)的位置改變，可使本身不能起始DNA復(fù)制。 科學家發(fā)現(xiàn)，將裂殖酵母3號染色體中Ura4基因的強復(fù)制起點缺失后，其附近的弱復(fù)制起點可成為強復(fù)制起點。這些實驗結(jié)果說明ARS元件所處的環(huán)境可控制它們的狀態(tài)。,到目前為止，高等真核生物中還未確定是否存在遺傳

39、性DNA復(fù)制起點序列特征，但功能性復(fù)制起點的確存在。目前對高等真核生物中功能性復(fù)制起點的性質(zhì)了解也不多。為了解多細胞生物復(fù)制起點的特征。人們開始重視研究細胞核或染色體結(jié)構(gòu)對復(fù)制起始的調(diào)控。 近來，人們發(fā)現(xiàn)將G1期完整的CHO細胞核和蟾蜍卵細胞提取物共同孵育后，起始DNA復(fù)制的復(fù)制起點不是隨機的，與正常培養(yǎng)的CHO細胞一樣。當損壞的細胞核或裸DNA代替G1期完整的細胞核后，起始DNA復(fù)制的復(fù)制起點是隨機的。說明在真核生物中細胞核和染色體結(jié)構(gòu)可以調(diào)節(jié)DNA復(fù)制的起始。 細胞核和染色體結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)DNA復(fù)制的機制，將成為研究的熱點。,二、DNA在一個細胞周期中只復(fù)制一次的調(diào)控 真核基因組中有很多復(fù)制

40、子，每個復(fù)制子的復(fù)制起點在一個細胞周期中僅被激活一次。這種調(diào)控機制的關(guān)鍵問題是機體是如何識別哪些復(fù)制起始位點在一個細胞周期中已起始復(fù)制過DNA，有哪些蛋白組分參與？ 1.復(fù)制的允許機制 蟾蜍卵細胞復(fù)制系統(tǒng)是了解這些蛋白組分的很好系統(tǒng)，該系統(tǒng)中的DNA只發(fā)生一次復(fù)制。 蟾蜍卵細胞包含DNA復(fù)制所需要的所有蛋白質(zhì)組分，在受精后的幾個小時里，它們可以進行11次分裂，而沒有新基因的表達。 將外源性細胞核注射到蟾蜍卵細胞內(nèi)后，外源性細胞核內(nèi)DNA只發(fā)生一次DNA復(fù)制，圖3-6概括了該系統(tǒng)的特征。,圖 3-6 蟾蜍卵細胞復(fù)制系統(tǒng)證明,如果卵細胞內(nèi)的蛋白合成被阻斷，而且外源性細胞核膜完整，DNA不能再次

41、復(fù)制；如果卵細胞象正常細胞一樣分裂，蛋白質(zhì)合成正常進行，外源性細胞核膜被降解，DNA可以再次復(fù)制。 這提示細胞核內(nèi)存在一種或多種DNA復(fù)制必需的蛋白質(zhì)，它們在一個細胞周期中一次復(fù)制后被用完或被降解。這種（些）蛋白質(zhì)在細胞漿里還有很多，但它們不能進入細胞核，只有當細胞核膜降解時才能進入細胞核，這些蛋白質(zhì)被稱為“允許因子”（licensing factor）。 這種機制可以防止復(fù)制在一個細胞周期里再次發(fā)生，圖7-7簡單解釋了“允許因子”防止復(fù)制再次發(fā)生的機制。,,圖3-7“允許因子”防止復(fù)制再次發(fā)生的機制,在復(fù)制前，細胞核內(nèi)存在有活性的“允許因子”，基因組復(fù)制一次后可以使允許因子全部失活或降解

42、，細胞質(zhì)中的“允許因子”不能進入細胞核。允許因子只有在細胞分裂期（核膜降解時），才能進入細胞核。細胞核內(nèi)再出現(xiàn)允許因子后，才能進行基因組復(fù)制。 啤酒酵母中的MCM2,3,5復(fù)合物是一種允許因子，該復(fù)合物是復(fù)制必需的，且只有在分裂期才能進入細胞核。 動物細胞在整個細胞周期中都有MCM2,3,5復(fù)合物，它可以與基因組DNA發(fā)生周期性結(jié)合，提示動物細胞中的MCM2,3,5可能是允許因子的一種。 研究表明，將MCM2,3,5突變后，確實能夠阻止復(fù)制起始；而將“允許因子”抑制物突變后，可導致產(chǎn)生過量的DNA。,2.蛋白激酶的調(diào)控 兩種蛋白激酶，CDK（cyclin dependent kina

43、ses） 和Cdc7-Dbf4激酶，是真核生物DNA復(fù)制起始絕對必需的。這兩種激酶在起始反應(yīng)的不同階段發(fā)揮作用，并有不同的底物。 近來用有爪蟾蜍和芽殖酵母研究表明，還有蛋白激酶A和蛋白磷酸酶2A等也參與復(fù)制的起始。 在真核生物細胞每個細胞周期中，基因組復(fù)制且僅復(fù)制一次，這是在精確調(diào)控機制下完成。 該機制使細胞有兩種狀態(tài)：一種是多種參與DNA復(fù)制的蛋白組裝成復(fù)制起始復(fù)合物，但不啟動復(fù)制起始；二是CDK激活復(fù)制起始復(fù)合物，使細胞進入復(fù)制起始狀態(tài)。,CDK在細胞從G1期向S期過渡期間，具有很高活性。該活性不僅可以啟動復(fù)制起始，還可以防止同一細胞周期中已復(fù)制基因組DNA再次發(fā)生復(fù)制。 這都是C

44、DK對參與DNA復(fù)制起始的蛋白進行磷酸化的結(jié)果。這種由CDK驅(qū)動的“復(fù)制開關(guān)”為基因組DNA在同一細胞周期復(fù)制且僅復(fù)制一次提供了一種完美的機制。,首先證明CDK能夠防止DNA復(fù)制在同一細胞周期再次發(fā)生的證據(jù)來自對裂殖酵母遺傳學的實驗研究。 基因敲除Cdc13（一種M期細胞周期性蛋白）的基因后，細胞可以連續(xù)發(fā)生多次DNA復(fù)制，但不能進行細胞分裂。 在裂殖酵母中表達CDK的抑制物，可以獲得同樣的結(jié)果。M期細胞周期性蛋白缺陷型的果蠅，在同一細胞周期中，也能夠發(fā)生多次DNA的復(fù)制。這些實驗結(jié)果都提示，CDK可以抑制DNA復(fù)制在G2和M期的發(fā)生。,在啤酒酵母中，CDK可通過抑制復(fù)制起始復(fù)合物的組裝抑

45、制 復(fù)制重復(fù)發(fā)生。 在G2/M期抑制CDK活性，發(fā)現(xiàn)DNaseI足跡具有DNA復(fù)制起始前狀態(tài)的特征。相反，如果在G1期表達B型細胞周期性蛋白Clb2，DNA復(fù)制起始被抑制，DNaseI足跡不具有DNA復(fù)制起始前狀態(tài)。 染色體交聯(lián)試驗發(fā)現(xiàn)，G2/M期高CDK活性可阻止MCMp與DNA復(fù)制起始位點相互作用。與這些實驗結(jié)果一致，蟾蜍Cdk2-cyclinE可以抑制Mcm3與染色體復(fù)制起始位點相結(jié)合。 這些實驗結(jié)果說明CDK可抑制復(fù)制起始復(fù)合物在復(fù)制起始位點上組裝。,為了認識CDK防止復(fù)制重復(fù)發(fā)生機制，尋找CDK關(guān)鍵底物很 有必要。CDK可抑制MCMp蛋白組裝，這提示CDK參與MCMp組裝的蛋白

46、，包括ORC、Cdc6/Cdc18以及MCMp本身都可能是CDK的潛在底物。到目前為止，有直接證據(jù)表明Cdc6和Cdc18是CDK底物。 Cdc6/Cdc18在復(fù)制起始復(fù)合物組裝過程中起重要作用。它們可與復(fù)制起始位點相互作用，并且是MCMp結(jié)合到復(fù)制起始位點必需的。 在裂殖酵母中高水平表達Cdc18可引起DNA復(fù)制的重復(fù)發(fā)生。CDK對Cdc6/Cdc18磷酸化后，可負調(diào)節(jié)它們的功能，防止在同一細胞周期中復(fù)制的再次發(fā)生。,這種作用首先在裂殖酵母實驗中發(fā)現(xiàn)。Cdc18N末端含有CDK的磷酸化位點，將它們?nèi)笔蛔兒螅砂l(fā)現(xiàn)： 1.在體內(nèi)Cdc18突變體比野生型Cdc18穩(wěn)定得多 在裂殖酵母體內(nèi)

47、，Cdc18很不穩(wěn)定，細胞進入S期后，被很快降解。CDK磷酸化位點缺失突變后，Cdc18半衰期可從大約5min延長至60min。 后來研究發(fā)現(xiàn)，CDK將Cdc18磷酸化后，可使其在蛋白酶體中被遍在蛋白化作用，并降解。 2.細胞基因組復(fù)制可以多次發(fā)生 這與高表達Cdc18的實驗結(jié)果一致；在碑酒酵母中，用Cdc6進行實驗，可取得同樣結(jié)果。 由此可見，CDK對Cdc6/Cdc18的磷酸化可防止細胞染色體復(fù)制重復(fù)發(fā)生。,在人體中，CDK對Cdc6磷酸化也可抑制Cdc6的功能， 但機制與酵母中不同。在人體細胞，整個細胞周期中Cdc6都存在，但Cdc6在細胞內(nèi)的分布隨著細胞周期發(fā)生變化。 Cdc6

48、在G1期，位于細胞核內(nèi)，在S期開始后，它通過Crm1依賴的機制轉(zhuǎn)運到細胞漿中。該過程和Cdc6磷酸化有關(guān)，因為缺失N端磷酸化位點的突變體在整個細胞周期中都在細胞核中。 在體外，Cdc6可以被Cdk2-cyclinA和Cdk2-cyclinE磷酸化，但在體內(nèi)Cdc6可能更偏向于結(jié)合cyclinA。因為在人細胞核糖體表達cyclinA可以引起Cdc6快速從細胞核進入細胞漿。 CDK依賴的Cdc6重新分布是防止人基因組復(fù)制重復(fù)發(fā)生的機制之一。,CDK磷酸化MCMp，防止復(fù)制重復(fù)起始。CDK磷酸化Cdc6/ Cdc18對防止復(fù)制重復(fù)起始很重要，但不是唯一機制。CDK使MCMp磷酸化后，可抑制MCMp

49、再組裝到復(fù)制起點。 研究在MCMp缺失磷酸化位點后，細胞是否出現(xiàn)基因組重復(fù)復(fù)制的現(xiàn)象具有重要意義。,三、DNA復(fù)制的檢查機制 檢查點機制（checkpoint mechanism）也是調(diào)控DNA復(fù)制的重要機制之一。當基因組損傷或DNA合成受阻，干擾基因組正常復(fù)制過程時，檢查點機制被激活。 起初，檢查點是用來描述細胞監(jiān)控的機制，這種機制可以延遲細胞分裂過程，直至DNA復(fù)制完成或損傷DNA被修復(fù)，從而協(xié)調(diào)細胞周期與DNA復(fù)制的正常完成。,隨著對檢查點機制的深入了解，發(fā)現(xiàn)檢查點機制在 基因組受損時，不僅僅是引起細胞周期的延遲。 比如，在啤酒酵母中，檢查點機制可引起許多基因轉(zhuǎn)錄，基因產(chǎn)物在DN

50、A損傷修復(fù)過程中發(fā)揮作用。 因此可給檢查點一個比較廣泛的定義：檢查點機制可以識別DNA損傷或DNA復(fù)制的阻斷，通過復(fù)雜的多種信號轉(zhuǎn)導途徑維持基因組的完整性。,2000年7月 Cell 報道，發(fā)現(xiàn)G1期的檢查點是一個復(fù)雜過程。正在分裂的細胞存在多個檢查點，用來不讓受損DNA進行復(fù)制及確保受損的染色體不發(fā)生凝集。G1期細胞 對DNA損傷有兩步反應(yīng)，首先是G1期快速停止,此過程不需p53; 然后是依賴于p53對細胞周期停止的維持。 原來一直認為當細胞受損傷時，首先是p53被ATM激酶磷酸化，再促進多個基因轉(zhuǎn)錄激活，如p21cip1, p21抑制cyclin E/CDK2復(fù)合物，進行G1期的抑制，但

51、此過程通常要8個小時才能發(fā)生，而離子射線誘導的G1期停止幾乎是立即完成的。 為了解開這個謎團，Agami,R等人構(gòu)建了一個p53失活的細胞系，進行離子輻射刺激后，發(fā)現(xiàn)cyclinD1下調(diào)，這種下調(diào)是由cyclinD1本身的RXXL引起。在受到刺激后，cyclinD1被APC降解，釋放出p21, p21即對cyclinE/CDK2復(fù)合物產(chǎn)生抑制，完成了早期快速抑制過程，而p53介導的p21上升看來是起后期維持作用。這個問題得到解決，但在檢測DNA損傷的反應(yīng)中，可能還有許多不為人知的事。,,下面主要對兩方面的檢查點機制進行探討： 1.DNA合成抑制所激活的檢查點機制。 2.細胞S期輻射或化學物質(zhì)所

52、致DNA損傷激活的檢查點機制。 人們對檢查點機制的了解主要是來自酵母的遺傳學和生物化學試驗。隨著研究逐步深入，人們發(fā)現(xiàn)許多參與檢查點機制的蛋白在高等真核生物中是保守的。 在哺乳動物體內(nèi)，如果檢查機制不發(fā)揮作用，基因組會變得不穩(wěn)定，而且增加癌的易感性。 先介紹兩種酵母系統(tǒng)檢查點機制的功能，然后再簡單介紹一下哺乳動物細胞中的相關(guān)內(nèi)容。,1.DNA合成被抑制所激活的檢查點機制 羥基脲存在條件下，細胞進入S期后，在大多數(shù)復(fù)制起始位點上都可發(fā)生DNA復(fù)制起始，但由于核苷酸前體缺乏，復(fù)制叉在模板鏈停止移動。這種情況可激活S期的檢查點機制。 檢查點機制激活后，可對細胞產(chǎn)生多種效應(yīng)：a.延遲分裂期染

53、色體的分離；b.穩(wěn)定復(fù)制出不完整的染色體，以保證核苷酸前體不缺乏時，能夠使染色體復(fù)制正常完成；c.引起多種基因（例如核糖核苷酸還原酶基因）的表達，基因產(chǎn)物有助于恢復(fù)復(fù)制叉正常運動。,在裂殖酵母體內(nèi)，rad1、rad3、rad9、rad17、rad26和hus1等6種基因的編碼產(chǎn)物可能參與上述多種效應(yīng)的產(chǎn)生。 在這6種基因中，不管哪種基因突變后，細胞對羥基脲高度敏感，DNA復(fù)制沒完成就進入細胞分裂期。 在這些Rad蛋白中，SpRad3/ScMec1是PI3k激酶超家族的成員，該家族中還有DNA-PK(DNA-dependent protein kinase)、ATM(ataxia telang

54、ectasia mutated:共濟失調(diào)毛細血管擴張誘導)蛋白和ATR（ataxia telangectasia-and Rad3-related）蛋白等。,在這個蛋白激酶家族中，人們對DNA-PK了解得最清楚。DNA-PK是一種三亞基的絲/蘇氨酸蛋白酶，是雙鏈DNA斷裂修復(fù)所必需。將DNA-PK與DNA斷裂處結(jié)合后，DNA-PK激酶的活性可明顯提高。 以此類推，SpRad3/ScMec1可能在酵母中直接參與停止復(fù)制叉的運動和DNA損傷的識別。 在哺乳動物中，ATM和ATR參與對DNA損傷的反應(yīng)，但它們的酶學性質(zhì)還不是很清楚。,缺失DNA聚合酶的裂殖酵母細胞，在羥基脲存在條件下, 發(fā)生細胞分

55、裂，但染色體DNA復(fù)制不完整。 Cut5基因突變的細胞，也呈現(xiàn)同樣表型,Cut5基因的編碼產(chǎn)物參與DNA復(fù)制，但具體功能不清楚。 遺傳實驗發(fā)現(xiàn)4個編碼產(chǎn)物參與復(fù)制的基因POL2、DPB11、ORC1、RFC5，是檢查點機制所必需。,POL2基因編碼的DNA聚合酶，它可結(jié)合在復(fù)制叉處，監(jiān)視復(fù)制是否中斷。DNA聚合酶有兩個結(jié)構(gòu)域，具有不同的功能；其N端具有聚合酶和核酸外切酶活性，該結(jié)構(gòu)域不是酵母生存所必需的。 研究發(fā)現(xiàn)，其C端是細胞生存所必需的。C端結(jié)構(gòu)域突變不僅降低DNA復(fù)制效率，而且使檢查點機制的功能不能正常發(fā)揮。 在此情況下，羥基脲抑制DNA復(fù)制,引起核糖核苷酸還原酶基因不能表達以及細

56、胞周期的延遲。將DPB11、ORC1和RFC5基因突變后，啤酒酵母也呈現(xiàn)出同樣的表型。 這三個基因的編碼產(chǎn)物都是啤酒酵母DNA復(fù)制需要的。前兩者編碼產(chǎn)物的功能還不清楚，RFC的基因編碼產(chǎn)物是鎖狀輸入器復(fù)合體的亞基之一。,裂殖酵母Cds1（SpCds1）和啤酒酵母中的同源物Rad53都是絲/蘇氨酸激酶，可將某些參與檢查點機制的蛋白特異磷酸化。 在體內(nèi)有羥基脲的情況下，SpCds1和Rad53可被磷酸化和激活，這種激活需要SpRad53和和啤酒酵母Mec1（ScMec1）以及其它參與檢查點機制的蛋白。 雖然遺傳學和生物化學實驗結(jié)果支持SpRad3/ScMec1在體內(nèi)通過磷酸化作用直接激活SpC

57、ds1/ScRad53，但還有待于進一步確證。,為了更清楚地在分子水平了解S期檢查點機制，需要尋找SpCds1/ScRad53激酶的關(guān)鍵底物。 近幾年來人們已在這方面取得了較大的進展，在裂殖酵母中，檢查點機制通過調(diào)節(jié)SpCdc2-cyclinB的磷酸化來阻止細胞的分裂。 SpWee1和SpMik1兩種激酶將SpCdc2的15位酪氨酸磷酸化后，可恢復(fù)SpCdc2-cyclinB的活性。,Cds1可能可對這些Cdc2調(diào)節(jié)物的活性進行調(diào)節(jié)。 在體外，SpCds1確實可以將SpWee1和SpCdc25磷酸化。將SpCds1對SpCdc25的磷酸化位點突變后，可以引起S期檢查點機制不能完全發(fā)揮作用。

58、這提示在體內(nèi)SpCdc25可能是SpCds1主要底物之一。 目前，SpCds1與SpCdc25相互作用的精確機制還不清楚。有研究表明，在體外，SpCds1對SpCdc25磷酸化后，可以直接抑制SpCdc25磷酸酶活性。也有研究表明，磷酸化的SpCdc25具有SpRad24的結(jié)合位點。在結(jié)合SpRad24后，SpCdc25可以被從細胞核中清除。 有趣的是，在裂殖酵母中，同一SpCdc25磷酸化位點也可以被蛋白激酶SpChk1磷酸化。在缺乏SpCds1的細胞中SpChk1可以被激活，并阻止細胞進入細胞分裂。在正常細胞中，SpChk1的激酶活性在檢查點機制中起的作用很小。,SpCds1除了可以延長

59、細胞周期的進行，在使細胞再從S期進行正常細胞分裂的過程中也是必需。 在正常細胞中，羥基脲的作用是可逆的，在去除羥基脲后，細胞可以恢復(fù)正常細胞分裂活動。羥基脲使缺失SpCds1和ScRad53的酵母細胞都失去生存能力。這可能和這些細胞不能完成DNA復(fù)制有關(guān)。 SpDfp1是Hsk1蛋白激酶的調(diào)節(jié)亞基。在HU處理的條件下，SpDfp1以SpCds1依賴的方式被磷酸化。而Hsk1-Dfp1是裂殖酵母DNA復(fù)制起始所必需的。,該實驗結(jié)果表明，Hsk1在依賴Cds1的檢查點機制中也發(fā)揮了一定作用。 在裂殖酵母中使細胞能夠從S期阻斷中有效恢復(fù)正常的另一個基因是rqh+,它編碼一種與E.coli 的Re

60、cQ相似的解旋酶。 在DNA復(fù)制過程中，與DNA被UV射線損傷時，rqh1對細胞的存活起重要作用。目前，rqh+發(fā)揮作用的機制還不清楚。,2.S期DNA損傷激活的檢查點機制 用放射線或DNA烷化劑對S期酵母細胞進行處理后，DNA復(fù)制變慢,這并不是由于DNA損傷影響復(fù)制叉移動那么簡單。因為將參與檢查點機制的基因突變后，DNA復(fù)制可以恢復(fù)正常。 因此，DNA損傷延長細胞周期S期是一個主動的過程，使細胞更好地耐受或修復(fù)DNA的損傷。,裂殖酵母S期DNA損傷激活的檢查點機制關(guān)鍵步驟之一，也是SpCds1蛋白激酶的激活。 參與的基因包括rad1、rad3、rad9、rad17、rad26和hus1

61、。 S期DNA損傷可以特異地激活SpCds1，發(fā)生在細胞周期其它檢查點的DNA損傷，則激活SpChk1蛋白激酶。激活的SpCds1可以抑制SpChk1蛋白激酶。 在啤酒酵母，S期DNA損傷激活Rad53蛋白激酶依賴于POL2、DPB11、ORC1和RFC5基因。,S期DNA損傷激活的檢查點機制可以通過抑制復(fù)制起始 或（和）復(fù)制延伸，使DNA復(fù)制變慢。DNA聚合酶/引物酶參與DNA復(fù)制延伸，并且可能參與S期DNA損傷所激活的檢查機制。 已有報道，將啤酒酵母引物酶基因PR11突變后，發(fā)現(xiàn)酵母表現(xiàn)出對DNA損傷物質(zhì)的高度敏感性，并不能延遲細胞S期的進行。那么引物酶是ScRad53的上游分子還是下

62、游分子？ 將PR11突變后，發(fā)現(xiàn)并不影響從DNA損傷到ScRad53磷酸化的信號轉(zhuǎn)導途徑。這提示引物酶在ScRad53的下游發(fā)揮作用。,DNA引物酶被ScRad53途徑修飾后，可使其在損傷DNA5端合成引物的能力降低，這是檢查點機制可以引起復(fù)制暫停的可能之一。有許多證據(jù)可以證明S期DNA損傷所激活的檢查點機制可使許多復(fù)制起點上的DNA復(fù)制起始。 用二維凝膠電泳對啤酒酵母的復(fù)制中間產(chǎn)物進行分析后，發(fā)現(xiàn)S期DNA損傷可以選擇性抑制晚期復(fù)制起點的激活，且依賴于ScRad53。 有趣的是將正常細胞（不接觸DNA損傷物質(zhì)）的ScRad53突變后，發(fā)現(xiàn)一些晚期復(fù)制起始位點上的復(fù)制起始可以被提前。,這提

63、示檢查點機制可能與正常細胞周期中復(fù)制的起始有關(guān)。比如，由于核苷酸的消耗，早期復(fù)制起始位點上的復(fù)制起始可能激活檢查點機制，并抑制晚期復(fù)制起始位點上DNA復(fù)制的起始。近來研究表明，檢查點機制激活的ScRad53可以抑制Cdc45組裝到晚期復(fù)制起始位點上。 Cdc7激酶也參與S期晚期復(fù)制起始復(fù)合物的激活，可能也是S期檢查點機制的作用點。因為Cdc7在裂殖酵母中的同源物Hsk1及其調(diào)節(jié)亞基Dfp1在體內(nèi)的磷酸化是依賴SpCds1。 在體外，純化的SpCds1可以直接磷酸化Dfp1。遺傳學實驗和雙雜交試驗也表明，在啤酒酵母中可以相互作用。,3.哺乳動物細胞中的檢查點機制 哺乳動物細胞與酵母一樣，在

64、DNA損傷時，可以激活檢查點機制，并抑制DNA的復(fù)制。在人體內(nèi)，已發(fā)現(xiàn)了許多酵母檢查點蛋白的結(jié)構(gòu)同源物。 這提示檢查點途徑是比較保守的。 哺乳動物細胞有幾種PI3k樣蛋白激酶與SpRad3/ScMec1同源，比如ATM、ATR、DNA-PK等。,2007年8月生物化學雜志報道科學家發(fā)現(xiàn)干細胞蛋白質(zhì)調(diào)控新機制。干細胞中的Oct4蛋白質(zhì)起著調(diào)控作用，決定干細胞是繼續(xù)分化成其他特殊細胞，還是保持干細胞的多功能性。通過化學途徑可以改變Oct4蛋白質(zhì)，從而決定干細胞的命運。德國和美國科學家共同發(fā)現(xiàn)了一個Oct4蛋白新的調(diào)控機制，一種特殊的蛋白質(zhì)可以和干細胞標記結(jié)合，從而延長蛋白質(zhì)的生命和增強讀取基因

65、信息的功能。 他們認為干細胞的多功能程度是有限的，它既可以發(fā)展成不同組織的細胞，也可以發(fā)展成腫瘤細胞，其發(fā)展方向在很大程度上受Oct4蛋白質(zhì)影響。在研究中發(fā)現(xiàn)，Oct4能與基因中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，通過這種方式使干細胞保持其多能性，并使干細胞僅向一個方向發(fā)展?？茖W家稱，Oct4可有不同的作用機制，在和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合期間，一些小分子的結(jié)合會導致蛋白質(zhì)的化學變化。研究表明，所謂的SUMO蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子有很強的結(jié)合傾向，并以此改變其功能。,他們的實驗顯示，SUMO-1(4種SUMO蛋白的一種)可結(jié)合到Oct4蛋白上，從而延長了Oct4的生命。他們把SUMO1和Oct4蛋白注入活性干細胞中，用顯微鏡觀察

66、熒光抗體來檢測，發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白質(zhì)分子互相結(jié)合在一起。研究人員分析了SUMO-1蛋白質(zhì)結(jié)合點的位置，有目的地使Oct4可能的結(jié)合點失效，人為地使118號賴氨酸作為結(jié)合點。由于這個點在DNA結(jié)合點附近，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SUMO-1和Oct4的結(jié)合體能更加有效地結(jié)合到DNA上。 研究人員還發(fā)現(xiàn)，Oct4和SUMO-1蛋白質(zhì)的結(jié)合體可以更好地操縱轉(zhuǎn)錄啟動因子，SUMO-1不僅改善Oct4蛋白質(zhì)功能，并且延長Oct4的壽命。在兩種蛋白質(zhì)注入活細胞16小時后，結(jié)合蛋白質(zhì)形態(tài)比未結(jié)合形態(tài)多4倍。換言之，通過結(jié)合到Oct4上，SUMO-1調(diào)控干細胞內(nèi)Oct4的含量，并由此決定干細胞是向正常方向還是向腫瘤方向分化，這個發(fā)現(xiàn)很可能對腫瘤治療有所幫助，特別是對于高Oct4蛋白質(zhì)濃度造成的腫瘤。,第三節(jié) 基因突變和DNA損傷修復(fù) 遺傳和變異都是生物界普遍存在的自然現(xiàn)象。遺傳和變異的基礎(chǔ)都是DNA的堿基排列序列, 遺傳是DNA的堿基排列順序忠實地傳給下一代, 變異是DNA的堿基序列發(fā)生改變,且可以遺傳。 DNA損傷是某些因素作用下, DNA的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變, 阻礙DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄, DNA的這種變化稱DN