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1、主講人：賽哲生物 曾宏彬水凝膠三維細胞培養(yǎng)廣州賽哲生物科技有限公司 服務熱線：400-888-4242 什么是三維細胞培養(yǎng) 如何實現(xiàn)三維細胞培養(yǎng) 水凝膠三維細胞培養(yǎng) 更多問題2 3 41 廣州賽哲生物科技有限公司 服務熱線：400-888-4242 什么是三維細胞培養(yǎng) 建立體外三維培養(yǎng)模型將有助于跨越二維細胞培養(yǎng)與動物實驗之間的鴻溝。通過模仿體內環(huán)境的特性，并利用傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)研究工 具，三維細胞模型提供了獨特的視角來觀察干細胞的行為、組織器官和腫瘤的發(fā)展過程。這些研究模型有利于加速癌癥生物學和組織工程領域的轉化研究。Kenneth M. Yamada, and Edna Cukierman.
2、 Modeling Tissue Morphogenesis and Cancer in 3D. Jcell. 130, 601-610. 1 1 什么是三維細胞培養(yǎng)3D 2DVS 2 如何實現(xiàn)三維細胞培養(yǎng) 水凝膠 固體支架 磁力懸浮 2 如何實現(xiàn)三維細胞培養(yǎng)固體支架三維培養(yǎng)： 組織工程支架作為組織工程的平臺，不僅提供了細胞生長的框架，使之形成特定的組織或器官形狀；而且作為細胞外基質成分之一，是細胞間信號傳導和相互作用的媒介，同時也是細胞生長所必需的生物活性劑。 目前用于組織工程支架的人工合成可降解聚合物主要包括脂肪族聚酯、聚偶磷氮、聚酸酐等。其中研究最多的是脂肪族聚酯，特別是聚乳酸（PLA）
3、、聚乙醇酸（PGA）及其共聚物等。 2 如何實現(xiàn)三維細胞培養(yǎng)磁力懸浮三維培養(yǎng)： 美國萊斯大學和德克薩斯大學M.D. Anderson癌癥中心的研究人員開發(fā)出一種生物裝配器（bioassembler）。這個系統(tǒng)使用磁力讓細胞懸浮，并促使細胞生長成三維的形狀。尤其適于培養(yǎng)肝臟和心臟這種細胞密度比較大的實體器官。 文章發(fā)表在2013年3月14日的Nature Nanotechnology上 2 如何實現(xiàn)三維細胞培養(yǎng) 將細胞培植在一定的細胞外基質中 , 細胞外基質（extracellularmatrix, ECM）蛋白充當生長支架。 水凝膠三維培養(yǎng)： 3 水凝膠三維細胞培養(yǎng) MatrigelColla
4、gen I Agarose 3 水凝膠三維細胞培養(yǎng) 從富含胞外基質蛋白的EHS小鼠腫瘤中分離出BD Matrigel 基底膜基質，其主要成分由層粘連蛋白，型膠原，巢蛋白，硫酸肝素糖蛋白等組成，還包含生長因子和基質金屬蛋白酶等。Matrigel 在室溫條件下，聚合形成具有生物學活性的三維基質，模擬體內細胞基底膜的結構、組成、物理特性和功能，有利于體外細胞的培養(yǎng)和分化，以及對細胞形態(tài)、生化功能、遷移、侵染和基因表達的研究。 可促進上皮細胞、肝細胞、Sertoli細胞、黑色素瘤細胞、血管內皮細胞、甲狀腺細胞及毛囊細胞等的貼壁與分化。同時，Matrigel還能影響乳腺上皮細胞的蛋白表達，支持外周神經的
5、新生和牛輸卵管上皮細胞的分化。高濃度的Matrigel適用于研究體內血管生成和腫瘤細胞遷移及腫瘤模型的建立等。 3 水凝膠三維細胞培養(yǎng) I型膠原在大部分組織中都有分布，尤其在骨組織、肌腱以及真皮組織中含量極其豐富。I型膠原一般是分離自大鼠尾中，也常被稱為鼠尾膠。Agarose 在酸性條件下成液態(tài)，一般保存于醋酸溶液中。使用時，需用PBS稀釋成合適的濃度（大于1 mg/ml），并用氫氧化鈉調節(jié)PH值至7.2-7.4，可聚合形成具有生物學活性的三維基質。 一般用于軟骨細胞、骨細胞的三維培養(yǎng)，血管形成試驗等。 3 水凝膠三維細胞培養(yǎng) 美國布朗大學的生物工程師 Jeffrey Morgan 利用瓊脂糖
6、開發(fā)出一種細胞三維培養(yǎng)皿。Collagen I 將融化的瓊脂糖制成微型培養(yǎng)板（micro-moulds），等瓊脂糖凝固 之后，再將這種瓊脂糖材料放置到普通的培養(yǎng)板里。再在培養(yǎng)板里加入細胞和培養(yǎng)基，由于重力的作用，細胞會沉積到瓊脂糖培養(yǎng)板里，彼此聚集在一起，形成球形的多細胞團塊。 3 水凝膠三維細胞培養(yǎng) 試劑盒組分 BD Matrigel PBS緩沖液 細胞回收液 賽哲生物水凝膠三維細胞培養(yǎng)系列試劑盒（#SZCE13001#SZCE13010）乳腺癌系列、胃癌系列、宮頸癌系列、肝癌系列、肺癌系列分別用于膠上培養(yǎng)、膠內培養(yǎng) 3 水凝膠三維細胞培養(yǎng)膠內培養(yǎng) 膠上培養(yǎng) 鋪膠 接種細胞 培養(yǎng) 收集細胞O
7、r觀察與檢測 3 水凝膠三維細胞培養(yǎng)鋪膠膠上培養(yǎng)：薄膠（ 3050 L/cm2），形成約0.5 mm厚度的凝膠膠內培養(yǎng)：薄膠（可選）+厚膠（100200 L/cm2），形成大于1 mm厚度的厚膠操作步驟：l 鋪膠前的準備： Matrigel 置于冰上融解； 使用到的所有器材（吸頭、小管、培養(yǎng)板）須冰預冷。l 鋪膠：薄膠：用冰預冷的吸頭吸取60100L 液態(tài)的Matrigel，均勻涂抹孔板底部，使其厚度均勻，避免產生氣泡；在37放置30分鐘，即可成膠。 3 水凝膠三維細胞培養(yǎng)接種和培養(yǎng)膠上培養(yǎng)：制備細胞懸液，以合適的密度接種于薄膠上，即可進行培養(yǎng)；膠內培養(yǎng)：制備細胞懸液，調整至合適的細胞密度，取
8、 100200 L 與Matrigel 等比例混合均勻，接種于孔板中，在37放置30分鐘，成膠后，在膠面上輕輕加入完全培養(yǎng)基即可進行培養(yǎng)。TIPS：l 一般用于腫瘤微球形成、侵襲等觀察，接種密度應控制在2000 -3000 cells /孔；l 觀察血管形成接種密度需達到105 cells /孔。 3 水凝膠三維細胞培養(yǎng)細胞處理l 藥物刺激： 膠上層培養(yǎng)液中加入刺激藥物l 細胞轉染： 膠上培養(yǎng)： 使用sagene 3D-HG（#SC1201） 三維培養(yǎng)專用轉染試劑 使用慢病毒or 腺病毒感染 膠內培養(yǎng)： 使用慢病毒or 腺病毒感染 3 水凝膠三維細胞培養(yǎng)細胞的回收細胞回收液（cell reco
9、very solution）：不含酶，能夠解聚matrigel 1-2ml細胞回收液，輕輕刮起含有細胞的凝膠（禁止吹吸），轉入 2ml離心管中，置于冰上融解約30min，每隔5-10min來回顛倒一次，待觀察到細胞團可順利沉至管底部，4 ，3000rpm離心5min，收集細胞。 優(yōu)點：細胞可保持在膠內的形態(tài)，不含酶，對細胞傷害小。 缺點：凝膠去除不徹底，有可能影響到后續(xù)檢測。 3 水凝膠三維細胞培養(yǎng)細胞的回收酶消化：l 胰酶（0.25%） 1-2ml 酶液，置于37 消化15-30min，待觀察到細胞團逐漸散開，3000rpm離心5min，收集細胞。 優(yōu)點：凝膠去除較徹底 缺點：對細胞傷害較大
10、，繼續(xù)培養(yǎng)效果差 l 分散酶（dispase） 1-2ml 酶液，置于37 消化2 hours，待觀察到細胞團逐漸散開，3000rpm離心5min，收集細胞。 優(yōu)點：凝膠去除較徹底，對細胞傷害小，可繼續(xù)培養(yǎng) 缺點：耗時長、價格高 3 水凝膠三維細胞培養(yǎng)觀察與檢測形態(tài)觀察 ： 乳腺上皮細胞MCF-10A細胞形成的乳腺腺泡結構前列腺癌細胞PC3的侵襲性觀察 3 水凝膠三維細胞培養(yǎng)觀察與檢測實時熒光定量PCR檢測 mRNA、miRNA抽提RNA：不需要除去凝膠，可直接加入trizol or bioopure，抽提RNA； 樣品編號 260/280 Conc. (ng/ul)1 2.07 20682
11、2.04 1802.23 2.11 1660.84 2.06 1267.41 2 3 4 1：不去膠 2：不去膠 3：去膠 4：去膠 Amplification plot of Actin 3 水凝膠三維細胞培養(yǎng)觀察與檢測 不去膠 去膠 GAPDHWestern blot檢測蛋白 若檢測大分子蛋白，一定要除去凝膠，回收細胞后提取蛋白 細胞回收液或酶消化均可 3 水凝膠三維細胞培養(yǎng)觀察與檢測細胞增殖檢測（MTT法） 不需要除去凝膠，可直接加入MTT孵育 一定要設不含細胞，只含有凝膠的空白對照孔 3 水凝膠三維細胞培養(yǎng)觀察與檢測免疫熒光觀察蛋白定位 膠上培養(yǎng)：可直接固定、孵育抗體等操作 膠內培養(yǎng)：
12、需回收細胞 采用細胞回收液回收細胞，維持細胞團結構，重新接種于圓形蓋玻片上，使細胞貼附于玻片上，再進行固定、抗體孵育等步驟TIPS： l 抗體孵育或染色后，洗滌次數需增加，時間最好延長至15minl 若需進行激光共聚焦觀察，可直接在厚度為0.13-0.17mm圓形蓋玻片上鋪膠接種細胞 3 水凝膠三維細胞培養(yǎng)觀察與檢測免疫熒光觀察蛋白定位不去膠 去膠 DAPI -tublin overlay 3 水凝膠三維細胞培養(yǎng)觀察與檢測免疫熒光觀察蛋白定位S1 cell T4-2 cell CAR E-Cadherin Confocal Fluorescence Microscopy 3 水凝膠三維細胞培養(yǎng) 試劑盒組分 Salmon fibringen Salmon thromin PBS緩沖液 酶消化液賽哲乳腺癌腫瘤干細胞篩選試劑盒專利產品 采用Salmon fibringen在 Salmon thromin的作用下，形成血纖蛋白凝膠。通過調節(jié)纖維蛋白原的濃度使形成的水凝膠的硬度在80100pa范圍內，使乳腺癌干細胞能夠在基質中增殖，并維持其自我更新的特性，從而篩選獲得腫瘤干細胞微球。 3 水凝膠三維細胞培養(yǎng) CD24 AC CD44CD24GAPDH 篩選后 篩選前 CD44 B D 3 水凝膠三維細胞培養(yǎng)案例分析 內容內容 Any Question ?4 更多問題
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