利用生物合成原理尋找微生物新藥

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1、 根 據(jù) 微 生 物 藥 物 的 生 物 合 成 原 理發(fā) 現(xiàn) 微 生 物 新 藥 的 方 法 和 途 徑n 通 過 非 基 因 定 向 改 變 、 基 因 定 向 改 變 ， 以及 組 合 生 物 催 化 的 技 術(shù) ， 或 是 改 變 原 有 微生 物 藥 物 的 生 物 合 成 途 徑 ， 或 是 對 原 有 的微 生 物 藥 物 （ 或 先 導(dǎo) 化 合 物 和 中 間 體 ） 進(jìn)行 生 物 催 化 ， 以 發(fā) 現(xiàn) 微 生 物 新 藥 . 產(chǎn) 生 菌 前 體 物 質(zhì)(1) 誘 變 處 理 化 學(xué)修 飾天 然 產(chǎn) 物衍 生 物天 然 產(chǎn) 物天 然 中 間 物 天 然 產(chǎn) 物衍 生 物 阻

2、斷 或 非阻 斷 菌 株定向與雜交生物轉(zhuǎn)化與 組合生物轉(zhuǎn)化 微 生 物 或酶 轉(zhuǎn) 化 天 然 產(chǎn) 物類 似 物 雜 合 工程 菌突變生物合成組合生物合成(2) 基 因 操 作 天 然 產(chǎn) 物類 似 物 (1) (2)天 然 產(chǎn) 物類 似 物定向與雜交生物合成化學(xué)修飾 微 生 物 藥 物 生 物 合 成與 微 生 物 新 藥 發(fā) 現(xiàn) 的 基 本 途 徑 n 通 過 非 基 因 定 向 改 變 的 方 法 包 括 ： 定 向 生物 合 成 、 雜 交 生 物 合 成 、 突 變 生 物 合 成 ，以 及 生 物 轉(zhuǎn) 化 與 組 合 生 物 轉(zhuǎn) 化 ；n 基 因 定 向 改 變 ， 即 為 組 合

3、生 物 合 成 。 一 、 非 遺 傳 操 作 的 定 向 生 物 合 成與 微 生 物 新 藥 的 發(fā) 現(xiàn)n 已 有 的 研 究 表 明 ， 在 抗 生 素 等 次 級 代 謝 產(chǎn) 物 生物 合 成 中 酶 底 物 的 特 異 性 足 以 使 結(jié) 構(gòu) 相 關(guān) 的代 謝 產(chǎn) 物 在 其 發(fā) 酵 液 中 積 累 ；n 但 由 于 生 物 合 成 酶 的 底 物 專 一 性 較 低 （ 寬 泛性 ） ， 其 野 生 型 菌 株 或 阻 斷 突 變 株 的 發(fā) 酵 過 程中 添 加 一 些 已 知 結(jié) 構(gòu) 類 似 物 作 為 前 體 物 質(zhì) ， 可以 產(chǎn) 生 含 有 與 這 種 已 知 結(jié) 構(gòu) 類

4、似 的 新 衍 生 物 ；n 這 種 獲 得 新 次 級 代 謝 產(chǎn) 物 的 途 徑 ， 可 以 被 稱 之為 非 遺 傳 操 作 的 定 向 生 物 合 成 (directed biosynthesis)。 前 體 （ precursor）n 即 在 微 生 物 培 養(yǎng) 過 程 中 ， 外 源 添 加 的 某 一化 學(xué) 物 質(zhì) ， 通 過 微 生 物 的 代 謝 ， 能 夠 將 其整 體 地 或 部 分 地 整 合 到 某 一 特 定 的 次 級 代謝 產(chǎn) 物 的 分 子 中 去 的 化 合 物 ， 如 苯 乙 酸 或苯 乙 酰 胺 及 苯 氧 乙 酸 等 ） 。 非 遺 傳 操 作 的 定

5、 向 生 物 合 成n 這 種 在 發(fā) 酵 過 程 中 通 過 添 加 某 種 特 定 的 前 體 物 質(zhì) ，使 微 生 物 的 生 物 合 成 朝 著 將 這 些 前 體 物 質(zhì) 摻 入 到產(chǎn) 物 分 子 的 某 一 特 定 部 位 而 產(chǎn) 生 過 量 的 含 有 這 種前 體 的 產(chǎn) 物 的 方 法 ， 即 為 非 遺 傳 操 作 的 定 向 生 物合 成 。n 其 基 本 原 理 是 由 于 參 與 這 些 反 應(yīng) 的 生 物 合 成 酶 的底 物 專 一 性 較 差 ， 而 能 使 外 源 添 加 的 某 些 前 體 物質(zhì) 競 爭 性 地 摻 入 到 特 定 產(chǎn) 物 的 分 子 中 去

6、 。 定 向 生 物 合 成 與 微 生 物 新 藥 的 發(fā) 現(xiàn)n 次 級 代 謝 產(chǎn) 物 合 成 酶 的 特 點 ：是 一 個 由 一 系 列 酶 參 與 催 化 的 多 酶 體 系 。參 與 催 化 反 應(yīng) 的 酶 的 底 物 專 一 性 比 初 級 代謝 合 成 酶 要 差 。 應(yīng) 用 實 例n 應(yīng) 用 非 遺 傳 操 作 定 向 生 物 合 成 的 方 法 能 夠制 備 獲 得 許 多 新 的 抗 生 素 ， 其 中 目 前 已 進(jìn)行 工 業(yè) 化 生 產(chǎn) 的 有 ：n 青 霉 素 G和 V；n 培 羅 霉 素 ；n 四 環(huán) 素 和 金 霉 素 等 。 青霉素定向生物合成序 號 側(cè) 鏈

7、R 學(xué) 名 俗 名1 對 羥 基 芐 青 霉 素 青 霉 素 X2 芐 青 霉 素 青 霉 素 G 3 戊 烯 2青 霉 素 青 霉 素 F4 戊 青 霉 素 青 霉 素 二 氫 F5 庚 青 霉 素 青 霉 素 K6 丙 烯 巰 甲 基 青 霉 素 青 霉 素 O7 苯 氧 甲 基 青 霉 素 青 霉 素 V8 4 氨 基 4 羧 基丁 基 青 霉 素 青 霉 素 NNCH S CCH CH3CH3HCCNHOCR COOHO NCH S CCH CH3CH3HCCH2NO COOH青霉素和6APA分子結(jié)構(gòu)及各種天然青霉素的結(jié)構(gòu)與名稱青霉素分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)6APA的化學(xué)結(jié)構(gòu)各種天然青霉素具有的

8、側(cè)鏈和名稱HO CH 2CH 2H3C CH2 CH CH CH2H3C (CH 2)3 CH 2H 3C (CH 2)5 CH 2H2C CH CH 2 S CH 2CH 3O CH (CH 2)2 CH 2NH 2HOOC 培 羅 霉 素 定 向 生 物 合 成. 培 羅 霉 素 定 向 生 物 合 成可 結(jié) 合 進(jìn) 入 BLM的 末 端 胺 基 部 分 的 非 天 然 胺 基 化 合 物. H 2N CH2 CH2 NH2H2N CH2 CH NH2CH 3H2N (CH2)3 NH CH3H2N (CH2)3 N(CH3)2 H2N (CH2)3 N(CH3)2X-H2N (CH2)3

9、 NH (CH2)3 N(CH3)2H 2N (CH2)3 N (CH2)3 NH2CH3H2N (CH2)3 NH CHCH 3 (CH2)2 NH2H2N (CH2)3 NH (CH2)3 OHH2N (CH2)3 NH (CH2)3 OCH3 H2N (CH2)3 NH 2N (CH 2)3 N H2N (CH2)3 N OH2N (CH2)2 N NH H2N (CH2)3 NH CH2*H2N (CH2)3 NH CH CH3H2N CH2 CH2 NH2H 2N (CH2)3 NH* PEP的末端胺基 四 環(huán) 類 抗 生 素 的 定 向 生 物 合 成 R5 R6 R76去甲基四環(huán)

10、素H H H (1)7氯6去甲基四環(huán)素H H Cl (2)四環(huán)素H CH3 H (3)5羥基四環(huán)素（土霉素）OH CH3 H (4)7氯四環(huán)素（金霉素）H CH3 Cl (5)OHR7 O OH NH2OO OHHO N(CH3)2HR6 HR5HH789 10 1166a10a 55a11a 44a12a1 2312微 生 物 發(fā) 酵 產(chǎn) 生 的 一 些 四 環(huán) 素 類 抗 生 素 四 環(huán) 類 抗 生 素 的 定 向 生 物 合 成 在 生 產(chǎn) 金 霉 素 時 需 添 加 氯 化 物 作 為 前 體 ，而 當(dāng) 生 產(chǎn) 四 環(huán) 素 時 ， 則 必 須 要 在 發(fā) 酵 培 養(yǎng)基 中 添 加 氯

11、離 子 抑 制 劑 ， 如 溴 化 物 或 M-促進(jìn) 劑 等 ， 從 而 抑 制 金 霉 素 的 合 成 而 得 到 四環(huán) 素 產(chǎn) 物 。 另 外 ， 用 金 色 鏈 霉 菌 在 發(fā) 酵 的 金 霉 素 過 程中 添 加 適 量 的 甲 基 化 反 應(yīng) 抑 制 劑 如 磺 胺 嘧啶 鈉 ， 能 夠 獲 得 去 甲 基 金 霉 素 。 非 基 因 改 變 定 向 生 物 合 成 的 研 究 進(jìn) 展 盡 管 近 年 來 基 因 改 變 的 定 向 生 物 合 成 發(fā) 展很 快 ， 但 利 用 非 遺 傳 操 作 定 向 生 物 合 成 原理 尋 找 新 的 生 理 活 性 物 質(zhì) 的 研 究 還

12、在 不 少實 驗 室 繼 續(xù) 進(jìn) 行 ， 特 別 是 對 一 些 肽 類 如 環(huán)孢 菌 素 A、 aureobasidins及 糖 肽 類 如 替 考拉 寧 產(chǎn) 生 菌 的 定 向 生 物 合 成 研 究 取 得 了 很大 的 進(jìn) 展 。 二 、 添 加 外 源 酶 抑 制 劑 的 雜 交 生 物 合 成與 微 生 物 新 藥 的 發(fā) 現(xiàn)n 雜 交 生 物 合 成 （ hybrid biosynthesis） 似 乎 可 以理 解 為 是 一 種 “ 強 化 ” 的 非 遺 傳 定 向 生 物 合 成 ， 如在 苦 霉 素 產(chǎn) 生 菌 發(fā) 酵 過 程 中 添 加 聚 乙 酰 途 徑 中 -酮

13、酯 酰 基 合 成 酶 抑 制 劑 線 蘭 菌 素 (cerulenin)，使 其 失 去 合 成 苦 霉 素 大 環(huán) 內(nèi) 酯 苷 元 (picronolide)的 能 力 而 只 能 合 成 糖 基 。 同 時 在 發(fā) 酵 過 程 中 添 加 泰樂 菌 素 大 環(huán) 內(nèi) 酯 苷 元 (protylonolide)， 使 其 與 苦霉 素 生 產(chǎn) 菌 產(chǎn) 生 的 糖 基 結(jié) 合 ， 得 到 一 種 被 稱 之 為M4365G1的 雜 合 抗 生 素 (hybrid antibiotic)。 雜 交 生 物 合 成 與 微 生 物 新 藥 的 發(fā) 現(xiàn) OHO MeNHO MeMe 葡萄糖1CH3C

14、OOH6CH3CH2COOH MeMe O O OHMeOHMe MeO Me 2CH3COOH5CH3CH2COHCH3CH2CH2COOHS.fradia KA427 NO.261ProtylonolidePicronolide O MeOMeHO MeOHMe MeDesosamine O MeNHO MeMeO MeOMeHO MeMe Me O O MeNHO MeMeMeMe O O OHMeOMeMeOMePicromycin DDesosaminyl Protylonolide（M4365G1） 在淺藍(lán)菌素存在下，用苦味霉素產(chǎn)生菌（S.sp.AM4900） 與protylono

15、lide 雜交生物合成M4365G 雜 交 生 物 合 成 產(chǎn) 物 工 業(yè) 化 的 可 能 性 盡 管 通 過 雜 交 生 物 合 成 能 夠 得 到 一 些新 的 抗 生 素 ， 但 由 于 所 添 加 的 淺 藍(lán) 菌素 本 身 就 是 一 種 昂 貴 的 抗 生 素 ， 再 則所 添 加 的 苷 元 的 結(jié) 構(gòu) 受 到 限 制 ， 所 以這 種 方 法 似 乎 沒 有 很 大 的 實 際 意 義 。 三 、 非 定 向 誘 變 的 突 變 生 物 合 成與 微 生 物 新 藥 的 發(fā) 現(xiàn)n 突 變 生 物 合 成 （ mutational biosynthesis） ：n 突 變 生 物

16、合 成 是 指 野 生 型 產(chǎn) 生 菌 經(jīng) 化 學(xué) 或 物 理 等因 素 誘 變 處 理 后 ， 喪 失 合 成 原 來 次 級 代 謝 產(chǎn) 物 的能 力 而 成 為 阻 斷 突 變 株 ， 然 后 在 發(fā) 酵 培 養(yǎng) 阻 斷 突變 株 時 添 加 某 種 外 源 物 質(zhì) ， 參 與 生 物 合 成 以 獲 得新 的 次 級 代 謝 產(chǎn) 物 的 過 程 。n 另 外 ， 突 變 生 物 合 成 也 包 括 由 于 突 變 而 引 起 產(chǎn) 生新 的 次 級 代 謝 產(chǎn) 物 。 突 變 生 物 合 成 原 理阻 斷 突 變 株 的 類 型營 養(yǎng) 缺 陷 型 突 變 株 ： 由 于 編 碼 菌 體

17、生 長 之 必 須 的 酶 的 基 因 發(fā) 生 了 突變 ， 而 使 菌 體 不 能 生 長 ， 導(dǎo) 致 不 能 合 成 次 級 代謝 產(chǎn) 物 。 因 此 ， 這 類 突 變 株 也 可 以 稱 為 初 級 代謝 阻 斷 突 變 株 。獨 需 型 突 變 株 ： 這 種 突 變 株 的 生 長 和 初 級 代 謝 正 常 ， 但 由 于 編碼 次 級 代 謝 產(chǎn) 物 合 成 的 某 一 基 因 發(fā) 生 突 變 ， 而使 喪 失 了 合 成 次 級 代 謝 產(chǎn) 物 的 能 力 。 這 是 突 變生 物 合 成 所 需 要 的 突 變 株 。雙 重 阻 斷 突 變 株 ： 即 突 變 既 發(fā) 生

18、在 編 碼 初 級 代 謝 酶 的 基 因 上 ， 也發(fā) 生 在 編 碼 次 級 代 謝 酶 的 基 因 上 。 突 變 生 物 合 成 與 微 生 物 新 藥 發(fā) 現(xiàn).野生型產(chǎn)生菌獨需型突變株A B正常途徑某抗生素阻斷變株A阻斷變株B A B+ B A+A B A BA，B為某一抗生素分子結(jié)構(gòu)的兩個部分A B為發(fā)酵液培養(yǎng)時阻斷變株的代謝產(chǎn)物BA為發(fā)酵培養(yǎng)時添加的的結(jié)構(gòu)類似物 A B A B即為新的雜合抗生素利 用 獨 需 型 突 變 株 合 成 產(chǎn) 生 新 抗 生 素 的 基 本 原 理A B 突 變 生 物 合 成 的基 本 流 程.出發(fā)菌株的選擇誘變處理阻斷突變株篩選瓊脂塊法選擇有生理活

19、力的突變株無生理活力的突變株搖瓶復(fù)篩有生理活力的突變株無生理活力的突變株區(qū)段合成產(chǎn)物，連接酶等生化特性的研究有區(qū)段合成產(chǎn)物、無連接酶等活性的突變株有區(qū)段產(chǎn)物A有連接酶等活性的突變株有區(qū)段產(chǎn)物B有連接酶等活性的突變株發(fā)酵培養(yǎng)添加結(jié)構(gòu)類似物A或B 樣品收集TLC、H PLC檢測及制備結(jié)構(gòu)檢測 突 變 生 物 合 成 產(chǎn) 生 的 新 抗 生 素.菌種抗生素特殊營養(yǎng)增補物新抗生素伊尼奧小單孢菌西梭霉素DOS鏈霉胺等突變霉素1等絳紅小單孢菌慶大霉素DOS鏈霉胺等2羥基GM等紅霉素鏈霉菌紅霉素Erythronolide 8，8 deoxyoleanolie未鑒別弗氏鏈霉菌新霉素DOS鏈霉胍等雜交霉素A，B

20、加利利鏈霉菌阿克拉霉素阿克拉酮紫紅霉酮等11羥基阿克拉霉素A灰色鏈霉菌鏈霉素紫紅霉酮等2脫氧鏈霉胍streptomutin A卡那霉素鏈霉菌卡那霉素DOS 1N甲基DOS等1N甲基GM等 雪白鏈霉菌新生霉素氨基香豆氨基香豆素同系物未鑒明核糖苷鏈霉菌核糖霉素DOS 1N甲基DOS等1N甲基RSMC等普拉特鏈霉菌普拉特霉素Platenolide Narbonolide 5Omycaminosyl narbonolide龜裂鏈霉菌巴龍霉素DOS鏈霉胍雜交霉素C巴龍鏈霉菌尼可霉素尿嘧啶嘧啶尼可霉素Z等唐德鏈霉菌 紅霉素生物合成途徑.丙酰CoA丙酰SACP甲基丙二酰CoA甲基丙二酰SACP丙酰丙酰SAC

21、P聚酮體途徑6脫氧紅霉內(nèi)脂B紅霉內(nèi)脂BTDPL碳霉糖 葡萄糖TDPD葡萄糖3O碳霉糖基紅霉內(nèi)脂TDP脫氧氨基己糖 紅霉素D紅霉素C紅霉素A紅霉素E紅霉素B縮合酶 突 變 株 產(chǎn) 生 的新 蒽 環(huán) 類 抗 生 素. O O OR R1OH OH R2 NH2OHH3C 1234 5 6 7 89101112 123456 4 O CH OCH 2CHOHCH 3 CH CH 3CH 2OH R R1 R2道 若 霉 素 （ 原 株 產(chǎn) 生 ） OCH3 COCH3 OH亞 德 里 亞 霉 素 （ 變 株 產(chǎn) 生 ） OCH3 COCH2OH OH13 雙 氫 道 若 霉 素 （ 變 株 產(chǎn) 生

22、） OCH3 CHOHCH3 OH13 雙 氫 洋 紅 霉 素 OH COCH3 OH11 去 氧 道 若 霉 素 （ 變 株 產(chǎn) 生 ） OCH3 COCH2OH H11 去 氧 亞 德 里 亞 霉 素 （ 變 株 產(chǎn) 生 ） OCH3 CH2CH3 HBaumycinA*（ 原 株 產(chǎn) 生 ） OCH 3 CH2COCH3 OHFeudomycin A（ 變 株 產(chǎn) 生 ） OCH3 CH2CH3 OHFeudomycin B OCH3 CH2COCH3 OH 突 變 株 產(chǎn) 生 的 一 些 新 的 次 級 代 謝 產(chǎn) 物.原 菌 種 原 抗 生 素 突 變 株 產(chǎn) 生 的 新 抗 生 素

23、普 拉 特 鏈 霉 菌 普 拉 特 霉 素 demycarosyl 普 拉 特 霉 素9 dehydromycarosyle 普 拉 特 霉 素波 賽 鏈 霉 菌紫 產(chǎn) 色 鏈 霉 菌 柔 紅 霉 素燼 灰 紅 菌 素 阿 霉 素燼 灰 紅 菌 素 X波 賽 鏈 霉 菌 baumycin oxaunomycin棘 孢 小 單 孢 菌 慶 大 霉 素 小 諾 霉 素生 金 鏈 霉 菌 四 環(huán) 素 去 甲 基 四 環(huán) 素 生 金 鏈 霉 菌 金 霉 素 去 甲 基 金 霉 素龜 裂 鏈 霉 菌 土 霉 素 去 甲 基 土 霉 素吸 水 鏈 霉 菌 carriomycin carromycinA 我

24、 國 應(yīng) 用 突 變 生 物 合 成 原 理 找 到 的 小 諾 霉 素. O O O OHOHOH3CHN OH HO H2N NH2 H2N CH R2R1 2H2SO4 慶大霉素和小諾霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)抗生素R1 R2分子式硫酸慶大霉素C1 CH3 NHCH3 C21H43N5O72H2SO4硫酸慶大霉素C1a H NH2 C19H39N5O72H2SO4硫酸慶大霉素C2 CH3 NH2 C20H41N5O72H2SO4小諾霉素H NHCH3 C20H41N5O72H2SO4 四 、 原 生 質(zhì) 體 融 合 與 微 生 物 新 藥 的 發(fā) 現(xiàn)n 微 生 物 原 生 質(zhì) 體 融 合 ， 即 是

25、 指 將 雙 新 株 的 微 生 物細(xì) 胞 分 別 通 過 酶 解 脫 壁 ， 使 之 形 成 原 生 質(zhì) 體 ， 然后 在 高 滲 溶 液 的 條 件 下 混 合 ， 并 加 入 物 理 的 （ 如電 融 合 ） 或 化 學(xué) 的 (如 聚 乙 二 醇 )或 生 物 的 （ 如 仙臺 病 毒 ） 助 融 條 件 ， 使 雙 親 株 的 原 生 質(zhì) 發(fā) 生 相 互凝 集 ， 通 過 細(xì) 胞 質(zhì) 融 合 ， 核 融 合 ， 爾 后 發(fā) 生 基 因組 間 的 交 換 ， 重 組 ， 進(jìn) 而 可 以 在 適 宜 的 條 件 下 再生 出 微 生 物 細(xì) 胞 壁 ， 獲 得 重 組 子 的 過 程 。

26、n 利 用 微 生 物 原 生 質(zhì) 融 合 尋 找 新 抗 生 素 的 基 本 原 理是 來 源 于 兩 種 已 知 產(chǎn) 生 不 同 抗 生 素 的 產(chǎn) 生 菌 的 融合 子 ， 有 可 能 將 它 們 的 部 分 生 物 合 成 基 因 整 合 在一 起 而 產(chǎn) 生 新 的 雜 合 抗 生 素 ； 另 一 個 原 理 是 由 于抗 生 素 產(chǎn) 生 菌 中 存 在 著 沉 默 基 因 ， 當(dāng) 這 些 沉 默 基因 受 到 外 源 物 質(zhì) 刺 激 后 ， 有 可 能 被 激 活 而 產(chǎn) 生 結(jié)構(gòu) 與 親 株 完 全 不 同 的 新 的 抗 生 素 。 n 應(yīng) 用 這 種 方 法 獲 得 的 第

27、一 個 新 抗 生 素 是 吲 哚 佐 霉素 （ indloizomycin） ： 其 親 株 為 鏈 霉 素 產(chǎn) 生 菌 灰色 霉 菌 和 天 神 霉 素 （ istamycin） 產(chǎn) 生 菌 天 神 鏈 霉菌 S. tenjimariensis。 組 合 生 物 合 成 組 合 生 物 合 成 的 潛 能 potentialn 重 組 、 組 合 、 互 補 、 替 換n R=可 利 用 的 基 因 n=基 因 的 等 位 形 式n 化 合 物 數(shù) Rnn R=4, n=4n Compounds=44=256 組 合 生 物 合 成 的 原 理 生 物 合 成 酶 基 因 的 結(jié) 構(gòu) 和

28、組 成 生 物 合 成 酶 基 因 的 特 異 性 及 底 物 寬 容 性 生 物 合 成 酶 基 因 之 間 的 相 互 作 用 生 物 合 成 途 徑 的 研 究 基 礎(chǔ) 一 、 具 有 聚 酮 體 生 物 合 成 途 徑 的微 生 物 藥 物 產(chǎn) 生 菌 的 組 合 生 物 合 成 一 些 具 有 聚 酮 體 生 物 合 成 （ polyketide synthases， PKSs） 途 徑 的 “ 天 然 產(chǎn) 物 ” ， 如紅 霉 素 、 阿 維 菌 素 、 泰 樂 菌 素 、 柔 紅 霉 素 、 阿克 拉 霉 素 、 西 羅 莫 司 和 利 福 霉 素 等 可 采 用 組 合生 物

29、合 成 。 具 PKS途 徑 的 抗 生 素藥 物 類 別 化 合 物 大 環(huán) 內(nèi) 酯 類 抗 生 素 紅 霉 素 、 螺 旋 霉 素 、 麥 迪 霉 素四 環(huán) 類 抗 生 素 四 環(huán) 素 、 金 霉 素 、 土 霉 素抗 腫 瘤 抗 生 素 柔 紅 霉 素 ， 阿 克 拉 霉 素 、enediynes 抗 寄 生 蟲 藥 avermectin， nemadectin 免 疫 抑 制 劑 FK506, rapamycin 抗 真 菌 藥 兩 性 霉 素 ， 制 霉 菌 素心 血 管 藥 物 lovastatin,， compactin獸 藥 莫 能 星 （ monensin） ， 泰 樂 菌

30、素 (tylosin)， 鹽 霉 素 1、 紅 霉 素 產(chǎn) 生 菌 的 組 合 生 物 合 成 通 過 操 作 PKS的 模 塊 中 單 個 基 因 的 組 合 生 物合 成 ； 在 非 天 然 產(chǎn) 物 產(chǎn) 生 菌 中 過 量 表 達(dá) 組 合 生 物合 成 產(chǎn) 物 ； 通 過 操 作 PKS模 塊 之 間 連 接 的 組 合 生 物 合成 ； 通 過 操 作 脫 氧 糖 途 徑 基 因 的 組 合 生 物 合 成 。 紅 霉 素 產(chǎn) 生 菌 的 組 合 生 物 合 成 的 可 能 性n 參 與 紅 霉 素 生 物 合 成 的 PKSs， 或 6 脫 氧 紅 霉 內(nèi) 酯合 成 酶 （ 6-deo

31、xyerythronolide B synthase，DEBS） 有 6個 模 塊 組 成 ， 每 個 模 塊 負(fù) 責(zé) 合 成 聚 酮 體中 的 一 部 分 。n 由 于 各 模 塊 之 間 的 協(xié) 調(diào) 性 ， 以 及 每 個 模 塊 延 伸 單位 的 選 擇 、 功 能 和 立 體 化 學(xué) 性 質(zhì) 的 催 化 結(jié) 構(gòu) 域 ，因 此 ， 就 有 可 能 通 過 對 PKSs結(jié) 構(gòu) 域 或 模 塊 的 操 作獲 得 具 有 新 穎 結(jié) 構(gòu) 的 化 合 物 。n 由 于 具 有 聚 酮 體 結(jié) 構(gòu) 的 化 合 物 其 結(jié) 構(gòu) 非 常 復(fù) 雜 和具 有 眾 多 的 立 體 異 構(gòu) 體 ， 因 而 ，

32、 難 以 用 常 規(guī) 的 化學(xué) 方 法 來 獲 得 。 紅霉素的生物合成途徑 PKS中 的 每 一 個 模 塊 的 組 成n 酮 基 合 成 酶 （ ketosynthase， KS）n 酰 基 轉(zhuǎn) 移 酶 （ acyl transferase， AT）n 酰 基 載 體 蛋 白 （ acyl carrier protein， ACPn -酮 基 修 飾 酶 ： 包 括 酮 基 還 原 酶（ ketoreductase， KR） 、 脫 氫 酶（ dehydrogenase， DH） 和 烯 酰 還 原 酶（ enoylreductase， ER）n DEBS含 有 編 碼 三 個 獨 立 的

33、 多 肽 亞 單 位 的 6個 模 塊n 大 多 數(shù) 典 型 的 聚 酮 體 合 成 途 徑 的 產(chǎn) 物 包 括 對 PKS產(chǎn)物 的 修 飾 ， 如 將 脫 氧 糖 或 氨 基 糖 進(jìn) 行 糖 苷 化 以 及通 過 細(xì) 胞 色 素 P450進(jìn) 行 氧 化 。 圖 中 所 示 的 LD為 裝載 域 （ loading domains） ， TE為 硫 酯 酶（ esterases） 。 1） 通 過 操 作 PKS的 模 塊 中 單 個 基 因 的 組 合 生 物 合 成 一 是 用 利 福 霉素 PKS模 塊 2中的 DH/ER/KR結(jié)構(gòu) 域 取 代 紅 霉素 PKS模 塊 2中的 KR；二

34、是 將 模 塊 5中的 KR缺 失 ；三 是 用 利 福 霉素 模 塊 2中 的 丙二 酰 特 異 性AT取 代 模 塊 6中的 甲 基 丙 二 酰 特 異 性 的AT） ， 將 得 到一 個 發(fā) 生 三 重突 變 的 PKS產(chǎn) 物 。 2） 在 非 天 然 產(chǎn) 物 產(chǎn) 生 菌 中 過 量表 達(dá) 組 合 生 物 合 成 產(chǎn) 物 n 將 E.coli 開 發(fā) 成 能 夠 表 達(dá) PKS產(chǎn) 物 需 要 解決 的 問 題 主 要 有 三 個 方 面 ：n 一 是 能 夠 功 能 性 表 達(dá) 巨 大 的 蛋 白（ 330kDa） ；n 二 是 PKS亞 單 位 的 ACP結(jié) 構(gòu) 域 的 翻 譯 后 磷

35、 酸泛 酰 巰 基 乙 胺 酰 化 ；n 三 是 聚 酮 體 途 徑 中 的 前 體 物 質(zhì) ， 特 別 是（ 2S） 甲 基 丙 二 酰 CoA在 E.coli中 不 存在 。 Pfeifer等 的 工 作 包 括 ：n 運 用 來 源 于 枯 草 芽 孢 桿 菌 非 核 糖 體 多 肽 合 成 酶（ NRPS） 基 因 簇 的 磷 酸 泛 酰 巰 基 乙 胺 酰 轉(zhuǎn) 移 酶（ phosphopantetheinyl transferase） 基 因 sfp，以 對 PKS亞 單 位 的 ACP結(jié) 構(gòu) 域 的 翻 譯 后 磷 酸 泛 酰 巰基 乙 胺 酰 化 ；n 過 量 表 達(dá) E.col

36、i中 的 丙 酰 CoA合 成 酶 基 因 prpE，擾 亂 丙 酰 CoA代 謝 途 徑 ， 以 及 過 量 表 達(dá) 來 自S.coelicolar的 丙 酰 CoA羧 化 酶 基 因 pcc， 使 丙酰 CoA轉(zhuǎn) 化 為 （ 2S） 甲 基 丙 二 酰 CoA 3） 通 過 操 作 PKS模 塊 之 間 連 接 的 組 合 生 物 合 成 n 通 過 對 DEBS模 塊 在 E.coli和 體 外 的 表 達(dá) 研 究 ， 發(fā)現(xiàn) 在 PKS裝 配 過 程 中 那 些 短 的 模 塊 內(nèi) 和 多 肽 內(nèi) 的“ 連 接 件 ” 是 至 關(guān) 重 要 的 成 分 。 研 究 發(fā) 現(xiàn) 在 相 繼非 共

37、 價 連 接 的 模 塊 中 ， 其 氨 基 和 羧 基 末 端 存 在 有多 肽 內(nèi) 連 接 件 ， 這 種 連 接 件 與 單 個 多 肽 內(nèi) 的 模 塊之 間 的 連 接 件 不 同 。n 因 此 ， 使 用 一 種 合 適 的 連 接 件 就 有 可 能 允 許 雜 合的 模 塊 之 間 進(jìn) 行 功 能 性 連 接 。 a： 已 經(jīng) 鑒 定 了 不 同 的模 塊 內(nèi) 和 多 肽 內(nèi) 的 連 接件 ， 并 由 此 指 導(dǎo) 合 成 模塊 之 間 的 聚 酮 體 中 間 體 ，這 里 需 要 合 適 的 氨 基 和羧 基 末 端 連 接 配 對 ， 以產(chǎn) 生 功 能 性 連 接 模 塊 ；b

38、： 在 構(gòu) 建 功 能 性 互 補體 時 ， 可 以 使 用 編 碼 來源 于 不 同 微 生 物 多 個 模塊 的 全 亞 基 ；如 圖 所 示 ： 來 源 于 苦 霉素 （ picromycin） 的PKS（ PikAI和 PikAII） ，與 來 源 于 竹 桃 霉 素（ oleandomycin） 的 PKS（ OleA3） 相 結(jié) 合 。 4） 通 過 操 作 脫 氧 糖 途 徑 基 因 的 組 合 生 物 合 成n 對 已 經(jīng) 發(fā) 現(xiàn) 的 由 自 然 界 中 植 物 、 真 菌 和 細(xì) 菌 產(chǎn) 生的 很 多 具 有 生 理 活 性 的 糖 苷 類 化 合 物 的 分 析 發(fā) 現(xiàn) ，

39、連 接 在 苷 元 上 的 糖 基 的 結(jié) 構(gòu) 大 多 為 6-脫 氧 己 糖（ 6-deoxyhexoses, 6DOHs） 。n 據(jù) 統(tǒng) 計 ， 這 些 具 有 生 理 活 性 的 糖 苷 類 化 合 物 的 結(jié)構(gòu) 上 含 有 70多 種 不 同 的 6-脫 氧 己 糖 。 6-脫氧己糖的種類具有生理活性的化合物產(chǎn)生菌*D-Desosamine紅霉素竹桃霉素苦霉素巨大霉素Sacc.erythraeaS.antibioticusS.VenezuelaeM.megalomiceaD-Olivose光輝霉素烏達(dá)霉素Landomycin S.argillaceusS.fradiaeS.cyanog

40、enusD-Oliose光輝霉素S.argillaceusD-Mycarose光輝霉素S.argillaceusD-Mycaminose泰樂星S.fradiaeD-Mycinose泰樂星S.fradiae D-Mycosamine制霉菌素S.nourseiL-Dihydrostreptose鏈霉素S.griseusL-Oleandrose竹桃霉素阿弗米丁S.antibioticusS.avermitillisL-Mycarose紅霉素巨大霉素泰樂星Sacc.erythraeaM.megalomiceaS.fradiaeL-Noviose新生霉素S.spheroidesL-Rhodinose烏達(dá)

41、霉素LandomycinGranaticin S.fradiaeS.cyanogenusS.violaceoruberL-Daunosamine柔紅霉素S.peucetius L-Nogalose Nogalamycin S.nogalaterL-Megosamine*巨大霉素M.megalomiceaL-Rhodosamine阿克拉霉素S.galilaeusL-Epivancosamine Chloroeremomycin A.orientalis2-Deoxy-L-fucose阿克拉霉素S.galilaeus O O O O O O O O O O D-DeoxyhexosesCH 3 N

42、(CH 3)2 OH OH OH oh OH OH OH OH OH OH CH 3CH 3OH CH 3 OH OMe OMe CH 3N(CH 3)2OH OH CH 3N(CH 3)2OH CH 3CH 3OHOH OH CH 3OMe OH CH 3OH OH CH 3OH NH 2 OH NH 2 OH CH 3 OH D-Forosamine D-Oliose D-Mycinose D-Mycaminose D-Desosamine D-Mycarose D-Chalcose D-Olivose D-Perosamine D-Mycosamine O O O O O O O O C

43、H 3 OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OMe CH 3OH CH 3OH NH 2 OH N(CH 3)2 CH 3 CH 3OHOH CH 3 CH 3OMeOH CH 3 CH 3CH 3OH OH OH CH 3OHOH OHCH 3OH OH OH NH 2 CH 3CH 3OH L-Deoxyhexoses L-Oleandrose L-Rhodinose L-Daunosamine L-Rnodosamine L-Mycarose L-Clacinose L-Nogaiose L-Oliose L-Noviose L-Epivancosamine

44、 由 放 線 菌 產(chǎn) 生 的 具 有 不 同 生 理 活 性的 糖 苷 化 合 物 的 結(jié) 構(gòu) 特 性n 具 有 單 糖 殘 基 的 化 合 物 ： 烏 達(dá) 霉 素 A、 柔 紅 霉 素 、urdamycin A和 rebeccamycin；n 具 有 雙 糖 殘 基 的 化 合 物 ： 光 輝 霉 素（ mithramycin） ；n 具 有 三 糖 殘 基 的 化 合 物 ： 烏 達(dá) 霉 素 A（ urdamycin A）和 光 輝 霉 素 （ 前 者 同 時 具 有 單 糖 和 三 糖 殘 基 ， 后 者同 時 具 有 雙 糖 和 三 糖 殘 基 ） ；n 以 O-糖 苷 鍵 連 接 的

45、 化 合 物 ： 紅 霉 素 A、 光 輝 霉 素 、柔 紅 霉 素 和 烏 達(dá) 霉 素 A； n 以 C-糖 苷 鍵 連 接 的 化 合 物 ： 烏 達(dá) 霉 素 A；n 以 N-糖 苷 鍵 連 接 的 化 合 物 ： rebeccamycin。 O OH CH3OOH OOCH 3 OH OOH 3C NH2HO Doxorubicin O O O O O O O O O O CH3OHOHOCH3HO OOHOH H3CHOH3CHOHO H3C H 3CHOOHH3CHOH3C OH CH3 Mithramycin OHOH3CCH 3O O O O CH3H3CHO H3C OHCH3

46、 CH3 OHO N(CH 3)2CH3 O OMeCH3OHCH3Erythromycin A HN N NH O O Cl ClO OH OHOMeHO Rebeccamycin O OOH CH3OH OHO O OHCH3O OCH3HOOOH3C OOH3CHOHO Urdamycin A 由放線菌產(chǎn)生的具有不同生理活性的糖苷化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu) a） 通 過 將 竹 桃 霉 素 產(chǎn) 生 菌 S.antibioticus中 齊 墩 果 糖 基 轉(zhuǎn) 移 酶 基 因 在 不 同 的S.erythraea中 的 表 達(dá) ， 得 到 了 3 O 鼠 李 糖 基 紅 霉 素 和 6 dEB衍 生

47、物 ， 以 及一 個 desosaminylated tylactone；b） 改 造 來 源 于 刺 孢 霉 素 （ calicheamicin） 產(chǎn) 生 菌 的 基 因 ， 可 以 得 到 一 個 新 的 脫氧 氨 基 糖 ， 并 將 其 附 著 在 S.lividans產(chǎn) 生 的 苷 元 上 ； c） 在 S.lividans產(chǎn) 生 菌 中 構(gòu) 建 desosamine的 途 徑 ， 然 后 導(dǎo)入 通 過 遺 傳 操 作 的 DEBS， 可 以 得 到 具 有 新 穎 結(jié) 構(gòu) 的desosaminylated大 環(huán) 內(nèi) 酯 類 文 庫 。 (a)S. erythraea BV88 (er

48、yBV-) (+oieGll) Sugars OleGilOCH3 OHOHCH3 OH 3CO CH3OHH3C CH3H3C GTF OH3CCH3O O O O CH3CH 3OHH3C CH3 H3C OHO N(CH3)2CH3 OOH OH CH3OH 3-O-rhamnosyl-6-deoxyerythromycin B 將竹桃霉素產(chǎn)生菌抗生鏈霉菌中編碼竹桃霉素oleandrose糖基轉(zhuǎn)移酶的基因oleGII，（該酶負(fù)責(zé)將相應(yīng)的糖基轉(zhuǎn)移到8，8a-脫氧竹桃內(nèi)酯（8，8a-deoxyoleandolide）的4位羥基上），整合到紅霉素產(chǎn)生菌eryBV缺失突變株中，eryBV基因編碼

49、的糖基轉(zhuǎn)移酶負(fù)責(zé)將L-mycarose糖基轉(zhuǎn)移到6-脫氧紅霉內(nèi)酯（6-deoxyerythronolide）甙元的相同位置，并進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果得到了將天然糖基L- rhamnose轉(zhuǎn)移到6-脫氧紅霉內(nèi)酯4位的新紅霉素衍生物，其具有抗菌活性， 將泰樂菌素產(chǎn)生菌弗氏鏈霉菌中編碼mycaminose糖基轉(zhuǎn)移酶基因tylM2整合到紅霉素產(chǎn)生菌三缺失突變株SG T2，（分別缺失聚酮體合成酶基因、mycarose和desosamine糖基轉(zhuǎn)移酶基因，但仍然具有合成L-mycarose和D-desosamine的能力），并使之表達(dá)，同時在培養(yǎng)過程中外源加入16-元環(huán)的泰樂酮（tylactone），結(jié)果得到一種

50、新的泰樂星衍生物5-O-desosaminyl-tylactone，如圖）所示。說明泰樂菌素產(chǎn)生菌中的轉(zhuǎn)移酶TylM2能夠識別和轉(zhuǎn)移不同的氨基糖。這兩個例子同時也表明抗生素糖基 轉(zhuǎn)移酶具有較寬的底物專一性。 (b) S. erythraea SGT2 (eryA-,eryBV-,eryClll-) (+tylM2) tryM2GTFSugars O OHOHO O CH3CH2 H3CCH 3 H3C H3C OH3CO OHO O CH3CH3H3C H3CCH 3 OHO N(CH3)2CH3 5-O-desosaminyl-tylactone 5） 通 過 表 達(dá) 雜 合 基 因 方 法

51、的 組 合 生 物 合 成 第 一 個 例 子 是 應(yīng) 用 有 些 大 環(huán) 內(nèi) 酯 類 抗 生 素 3位 或 糖基 4 位 的 羥 基 酰 化 酶 基 因 ， 使 某 些 大 環(huán) 內(nèi) 酯 類抗 生 素 在 相 應(yīng) 的 位 置 酰 化 ：1） 異 戊 酰 螺 旋 霉 素 （ 來 自 碳 霉 素 的 4” 異 戊 酰 輔 酶A轉(zhuǎn) 移 酶 的 carE基 因 ） ；2） 丙 酰 螺 旋 霉 素 （ 來 自 麥 迪 霉 素 的 4” 丙 酰 化 酶 的mpt基 因 ） ；3） 乙 酰 泰 樂 菌 素 等 （ 來 自 碳 霉 素 的 3 O 乙 酰 轉(zhuǎn) 移酶 的 acyA基 因 ） 。 引入外源酶基因產(chǎn)

52、生雜合抗生素丙酰螺旋霉素基因工程菌構(gòu)建圖 必 特 螺 旋 霉 素 的 結(jié) 構(gòu) OO OO CHOCH 3 CH3H3CO OR1 O OHO CH3N CH3CH3 O OR 2CH3CH3OH ONH3CH3C H3C 12345 6789101112 1314 1516 17 1819 23 1 2 3 45 67 8 1 2 3 45 6 7123 4 567 8R1 H R2 COCH 2CH (CH 3)2 COCH 3 COCH 2CH 2CH 3 COCH 2CH 3 COCH 2CH 3 COCH 3 2、 蒽 環(huán) 類 抗 生 素 產(chǎn) 生 菌 的 組 合 生 物 合 成 （ 略

53、 ） 蒽 環(huán) 類 抗 生 素 是 一 類 臨 床 上 非 常 重 要 的 抗腫 瘤 抗 生 素 ， 它 們 同 樣 是 PKS生 物 合 成 途 徑 ，因 此 ， 通 過 以 下 集 中 組 合 生 物 合 成 的 方 法 ，可 以 得 到 一 系 列 “ 非 天 然 的 天 然 雜 合 化 合物 ” 。 1） 通 過 破 壞 靶 基 因 的 組 合 生 物 合 成 通 過 基 因 框 內(nèi) 的 誘 變 或 缺 失 ， 或 插 入 抗 生素 耐 藥 基 因 盒 的 方 法 ， 可 以 將 所 選 擇 的 靶基 因 特 異 性 地 鈍 化 ； 盡 管 靶 基 因 的 破 壞 可 以 得 到 新 的

54、 化 合 物 ，但 會 出 現(xiàn) 錯 誤 的 結(jié) 果 ， 這 是 因 為 一 方 面 由于 極 性 效 應(yīng) 影 響 下 游 基 因 的 表 達(dá) ， 另 一 方面 受 到 由 于 外 源 DNA片 斷 的 插 入 造 成 的 反 義RNA合 成 影 響 上 游 基 因 。 1） 通 過 破 壞 靶 基 因 的 組 合 生 物 合 成 在 光 神 霉 素 （ mithramycin） 產(chǎn) 生 菌S.argillaceus中 ， 破 壞 編 碼 葡 萄 糖 1 磷 酸 胸 苷 5 三 磷 酸 胸 苷 轉(zhuǎn) 移 酶 的 基 因 mtmD后 ， 獲得 了 兩 個 四 環(huán) 類 的 光 神 霉 素 衍 生 物

55、：premithramycinone和 4 脫 甲 基premithramycinone衍 生 物 ； Premithramycinone的 抗 腫 瘤 生 物 活 性 與 光 神 霉素 相 似 ， 且 有 趣 的 是 其 化 學(xué) 結(jié) 構(gòu) 與 來 源 于 黑 曲 霉A.niger的 神 經(jīng) 肽 受 體 抑 制 劑 BMS非 常 相 似 ， 如 圖所 示 。 通 過 基 因 破 壞 后 得 到 的 兩 個 光 神 霉 素衍 生 物 和 BMS-192548 2） 通 過 表 達(dá) 雜 合 基 因 方 法的 組 合 生 物 合 成 來 源 于 S.fradiae的 urdE基 因 ， 編 碼 一 種

56、 氧化 酶 ， 其 可 能 涉 及 到 將 1分 子 氧 引 入 到 烏 達(dá)霉 素 結(jié) 構(gòu) 中 ； 在 控 制 啟 動 子 ermE的 條 件 下 ， 將 其 在 丁 省霉 素 C產(chǎn) 生 菌 S.glaucescens中 表 達(dá) ， 產(chǎn) 生一 種 新 的 雜 合 化 合 物 ， 6 羥 基 丁 省 霉 素 C，如 圖 所 示 。 通 過 將 烏 達(dá) 霉 素 產(chǎn) 生 菌 的 urdE基 因 在 丁 省 霉 素 C產(chǎn) 生 菌 中 表 達(dá) ， 得 到 一 種 雜 合 產(chǎn) 物 6 羥 基 丁 省 霉 素 C 2） 通 過 表 達(dá) 雜 合 基 因 方 法 的 組 合 生 物 合 成 另 外 一 個 實

57、例 是 ， 將 柔 紅 霉 素 產(chǎn) 生 菌S.peucetius中 編 碼 11-aklavinone-羥 化 酶的 基 因 （ dnrF） ， 在 阿 克 拉 霉 素 產(chǎn) 生 菌S.galilaeus中 表 達(dá) ， 結(jié) 果 得 到 了 一 種 新 的雜 合 化 合 物 ， 11 羥 基 阿 克 拉 霉 素 A， 如 圖所 示 。 這 種 羥 基 化 的 產(chǎn) 物 ， 其 對 白 血 病 細(xì) 胞 和 黑色 素 瘤 細(xì) 胞 的 生 物 活 性 比 阿 克 拉 霉 素 要 強 。 雜 合 化 合 物 11 羥 基 阿 克 拉 霉 素 A的 組 合 生 物 合 成 2） 通 過 表 達(dá) 雜 合 基 因

58、 方 法 的 組 合 生 物 合 成 通 過 這 種 組 合 生 物 合 成 的 方 法 ， 已 經(jīng) 獲 得 了 數(shù)個 雜 合 糖 苷 化 的 丁 省 霉 素 ， 如 用 含 有 一 個 完 整埃 羅 霉 素 （ elloramycin） 基 因 簇 （ 具 有 產(chǎn) 生 8 去 甲 基 丁 省 霉 素 C的 能 力 ） 的 黏 粒 轉(zhuǎn) 化 烏 達(dá) 霉素 產(chǎn) 生 菌 或 光 神 霉 素 產(chǎn) 生 菌 ， 可 以 得 到 四 種 新的 糖 苷 化 合 物 ： 齊 墩 果 糖 基 、 鼠 李 糖 基 、mycarosyl丁 省 霉 素 C和 雙 齊 墩 果 糖 基 丁 省 霉 素 C，如 圖 所 示

59、。 有 趣 的 是 ， 這 些 脫 氧 糖 在 烏 達(dá) 霉 素 和 光 神 霉素 苷 元 上 的 附 著 位 置 ， 與 在 埃 羅 霉 素 的 附 著 位置 不 同 。 表 明 ， 這 些 聚 酮 體 的 糖 基 轉(zhuǎn) 移 酶 具 有底 物 寬 泛 性 。 雜 合 糖 苷 化 丁 省 霉 素 的 組 合 生 物 合 成 能 夠 被 ElmGT糖 基 轉(zhuǎn) 移 酶 轉(zhuǎn) 移 的 一 些 糖 基 和 elloramycin甙 元 的 結(jié) 構(gòu) OCH 3 OO O OHCH 3H 3COOC R 2O OH OH OR 1 R 2 R 1L-R ham nose OH 3CHO HO OH L-R ho

60、dinose OOHH 3C L-O livose OHOHOH 3C L-O leandrose OH 3CHO MeO OH 3CMeO MeO OH 3CHOHO OH 3CHOH 3C OH 3CHO OOHOHO H 3C 3,4-D im ethoxy-L-olivose D -O livose D -M ycarose D -D iolivose 表 柔 紅 霉 素 和 表 阿 霉 素 基 因 工 程 菌 的 構(gòu) 建 O OOCH 3 OH OH O H OH CH3O OH3C OHH2N Daunomycinone Daunosamine 柔 紅 霉 素O O OH OHOC

61、H 3 O OHH CH3O OHOH3C H2N 表 柔 紅 霉 素 O OOCH 3 OH OH O OHH O OH3C OH OH NH2 Adriamycinone Daunosamine 阿 霉 素 O O OHOCH 3 OH O OHH OHO OH2NHOH3C表 阿 霉 素 表 柔 紅 霉 素 和 表 阿 霉 素 基 因 工 程 菌 的 構(gòu) 建 通 過 鈍 化 dnmV基 因 ， 得 到 一 個 柔 紅 霉 素 和 阿 霉 素 產(chǎn)生 菌 的 阻 斷 突 變 株 ， dnmV基 因 編 碼 4 酮 基 還 原 酶 ，其 與 合 成 這 類 抗 生 素 結(jié) 構(gòu) 中 的 脫 氧

62、糖 ， 柔 毛 霉 胺 的合 成 有 關(guān) 。 分 別 將 阿 維 菌 素 產(chǎn) 生 菌 中 編 碼 合 成 齊 墩 果 糖 的 基 因avrE， 以 及 紅 霉 素 產(chǎn) 生 菌 中 編 碼 合 成 mycarose的 基因 eryBIV， 克 隆 到 dnmV基 因 阻 斷 突 變 株 中 。 由 于 重 組 工 程 菌 中 的 外 源 基 因 表 達(dá) 的 4-酮 基 還 原 酶的 特 性 與 柔 紅 霉 素 產(chǎn) 生 菌 中 的 4-酮 基 還 原 酶 不 同 ，前 者 具 有 非 對 映 立 體 催 化 特 性 而 能 夠 形 成 L-epidaunosamine（ 表 柔 毛 霉 氨 ） 。

63、 而 突 變 株 dnmV生物 合 成 甙 元 的 能 力 和 合 成 糖 基 轉(zhuǎn) 移 酶 的 能 力 仍 然 保持 ， 且 由 于 糖 基 轉(zhuǎn) 移 酶 的 底 物 專 一 性 較 差 而 不 影 響將 表 柔 毛 霉 氨 連 接 在 原 來 的 蒽 環(huán) 酮 上 ， 從 而 得 到4 -表 柔 紅 霉 素 和 4 -表 阿 霉 素 ， 如 圖 所 示 。 表 柔 紅 霉 素 和 表 阿 霉 素 基 因 工 程 菌 的 構(gòu) 建 O OHO OHOO OHOH OOMe NH2CH3OH O OHO OHOO OHOH OOMe NH2CH3OH aveE eryEIV 阿霉素 4-表阿霉素 二

64、、 具 有 非 核 糖 體 生 物 合 成 肽 類 途 徑 的微 生 物 藥 物 產(chǎn) 生 菌 的 組 合 生 物 合 成 n 具 有 非 核 糖 體 生 物 合 成 途 徑 （ none ribosomal peptide synthases， NRPSs）的 環(huán) 肽 或 糖 肽 類 “ 天 然 產(chǎn) 物 ” ， 如 萬 古 霉素 、 博 萊 霉 素 、 環(huán) 孢 菌 素 A和 埃 坡 霉 素 等 進(jìn)行 了 大 量 的 研 究 工 作 ， 并 取 得 了 令 人 注 目的 成 果 。 Chloroeremomycin 生 物 合 成 n （ 1） 小 分 子 準(zhǔn) 備 在 酶 的 催 化 下 生 成

65、 裝 配 過 程 中需 要 的 小 分 子 化 合 物 ， 對 于 萬 古 霉 素 族 糖 肽 類 抗生 素 而 言 包 括 ： 非 蛋 白 氨 基 酸 和 TDP-L-b-epivancosamine；n （ 2） 裝 配 上 步 準(zhǔn) 備 好 的 氨 基 酸 通 過 腺 苷 化 反 應(yīng)（ adenylation） 轉(zhuǎn) 換 成 為 腺 苷 酸 ， 而 后 與 鄰 近 肽載 體 蛋 白 （ peptide carrier protein, PCP） 上的 巰 基 形 成 硫 酯 （ thiolation） ， PCP之 間 的 縮 合功 能 域 （ condensation） 催 化 肽 鍵 形

66、 成 。 經(jīng) 過 幾個 延 伸 過 程 ， 最 后 TE域 將 完 成 的 肽 切 下 。 有 時 過程 中 還 會 有 差 向 異 構(gòu) 作 用 (epimerisation)。 n （ 3） 裝 配 后 修 飾 在 這 步 反 應(yīng) 中 通 常 進(jìn) 行 氧 化 反應(yīng) 和 糖 基 化 ， 對 于 有 的 化 合 物 還 存 在 N端 甲 基 化 反應(yīng) 。 萬 古 霉 素 的 生 物 合 成 另 據(jù) 研 究 ， 天 然 的 萬 古 霉 素 生 物 合 成 共 有 35步 ， 其 先 以 五 種 自 由 的 氨 基 酸 單 體 合 成 一 線形 的 七 肽 ， 然 后 芳 基 側(cè) 鏈 在 交 聯(lián) 酶 的 催 化 下適 時 地 組 合 、 交 聯(lián) ， 形 成 復(fù) 雜 的 七 肽 骨 架 ，最 后 UDP-glucose和 UDP-4-epi-vancosamine在 糖 基 轉(zhuǎn) 移 酶 的 作 用 下 連 接 到 七 肽 骨 架 上 。 萬 古 霉 素 生 物 合 成 的 五 種 起 始 自 由 氨 基 酸 單 體 萬 古 霉 素 生 物 合 成 的 逆 向 合 成 分 析 圖 在 萬 古 霉