三維細胞培養(yǎng)簡介閆輝ppt課件

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1、三維細胞培養(yǎng)技術(shù)的簡介閆 輝2014.10.9 目錄1 三維細胞培養(yǎng)技術(shù)的概念2 三維細胞培養(yǎng)技術(shù)產(chǎn)生的背景3三維細胞培養(yǎng)技術(shù)的亮點4 三維細胞培養(yǎng)模型的建立5 三維細胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用 6 三維細胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展前景 1 三維細胞培養(yǎng)技術(shù)的概念三維細胞培養(yǎng)技術(shù)( three-dimensional cell culture,TDCC) 是指將具有三維結(jié)構(gòu)不同的載體與各種不同種類的細胞在體外共同培養(yǎng), 使細胞能夠在載體的三維立體空間結(jié)構(gòu)中遷移、生長, 構(gòu)成三維的細胞載體復(fù)合物。三維細胞培養(yǎng)是將細胞培植在一定的細胞外基質(zhì)中,細胞外基質(zhì)（ extracellular matrixc，)（1）蛋白充當(dāng)

2、生長支架,使得細胞能夠分化產(chǎn)生一定的三維組織特異性結(jié)構(gòu),所創(chuàng)建的細胞生長環(huán)境,則最大程度地模擬體內(nèi)環(huán)境。 2 三維細胞培養(yǎng)技術(shù)產(chǎn)生的背景細胞的體外培養(yǎng),關(guān)注的不僅僅是它們的分裂生長,而更為重要的是它們經(jīng)過傳代后能否維持體內(nèi)的性狀。在很多情況下,單層細胞培養(yǎng)技術(shù)所取到的研究結(jié)果和體內(nèi)的情況不符合,因為細胞在體外改變的環(huán)境下增生,逐漸喪失了原有的性狀。動物實驗完全在體內(nèi)進行,但由于體內(nèi)的多種因素制約以及體內(nèi)和外界環(huán)境相互影響而變得復(fù)雜化,難以研究單一過程。 另外,我們在動物身上所觀察到的結(jié)果,往往是最終呈現(xiàn)的表現(xiàn),而非研究者最為關(guān)心的中間過程。顯然,如何填補單層細胞培養(yǎng)和動物實驗的鴻溝,一直是生命

3、科學(xué)家思索的問題。尤其是在發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域,迫切需要建立一套細胞培養(yǎng)技術(shù),既能生長傳代,還能最大程度地維持體內(nèi)性狀,并分化產(chǎn)生新的組織結(jié)構(gòu),以便全面研究發(fā)育過程。隨著組織工程的新興發(fā)展,三維細胞培養(yǎng)技術(shù)就應(yīng)運而生了。 3 三維細胞培養(yǎng)技術(shù)的亮點 三維培養(yǎng)體系為細胞提供類似體內(nèi)生長環(huán)境的支架或基質(zhì)，細胞通過緊密連接和/或縫隙連接等連接方式建立細胞間及細胞與胞外基質(zhì)間的聯(lián)系，形成一定的三維結(jié)構(gòu)； 三維培養(yǎng)細胞在基因表達、基質(zhì)分泌及細胞功能活動等方面與單層培養(yǎng)均有明顯差異，而與體內(nèi)細胞生長情況更為相似；因此，三維細胞培養(yǎng)既能保留體內(nèi)細胞微環(huán)境的物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，又能體現(xiàn)細胞培養(yǎng)的直觀性及條件可控制性，把體

4、外無細胞及單層細胞培養(yǎng)體系與組織器官及整體研究聯(lián)系起來。 4 三維細胞培養(yǎng)模型的建立4.1三維基質(zhì)膠（2）的種類以及常用基質(zhì)膠的介紹4.2三維模型的種類4.3常見三維細胞培養(yǎng)模型的建立方法 4.1.1目前已經(jīng)知道的基質(zhì)膠主要有海藻酸鈣凝膠、瓊脂糖凝膠，這兩種凝膠主要適用于懸浮細胞的培養(yǎng)，還有一種是血纖維蛋白，將動物細胞和血纖維蛋白原混合，然后加入凝血酶。凝血酶將血纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為不溶性的血纖維蛋白，將動物細胞固定在其中。血纖維蛋白可以促進細胞貼壁，因此無論是懸浮細胞還是貼壁細胞都適合。 4.1.2實驗室大量使用的基質(zhì)膠是Matrigel膠，是從小鼠腫瘤組織中提取的抽提物，在室溫下，Matrig

5、el可自動聚集產(chǎn)生類似于哺乳動物細胞基底膜的生物活性基質(zhì)材料。Matrigel 基底膜基質(zhì)形成的三維培養(yǎng)基質(zhì)，可促進上皮細胞、肝細胞、Sertoli細胞、黑色素瘤細胞、血管內(nèi)皮細胞、甲狀腺細胞及毛囊細胞等的貼壁與分化。同時，Matrigel還能影響乳腺上皮細胞的蛋白表達，支持外周神經(jīng)的新生和牛輸卵管上皮細胞的分化。高濃度的Matrigel適用于研究體內(nèi)血管生成和腫瘤細胞遷移及腫瘤模型的建立等。 4.2三維細胞培養(yǎng)模型的種類三維立體培養(yǎng)的方法有多種，常用的有膠內(nèi)培養(yǎng)模式(細胞與膠原膠混合)、膠上培養(yǎng)模式(細胞生長于膠原膠表面)和三明治培養(yǎng)模式(細胞生長于兩層膠原中間)。 4.2常見三維細胞培養(yǎng)模

6、型的建立方法4.2.1膠內(nèi)培養(yǎng)模式的建立方法 Matrigel母液濃度10.6 mg/mL（3）,放置于4溶解(4)。消化細胞,重懸至完全培養(yǎng)基中計數(shù),細胞懸液濃度為1106/mL。使用時置于冰上,用預(yù)冷的細胞重懸液與Matrigel等體積混勻,24孔板中每孔加入100l。37放置30 min使其成膠,添加完全培養(yǎng)液。置于37 5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育,第二日換液,此后每隔一日換液一次 1。 4.2.2膠上培養(yǎng)模式的建立方法在24 孔培養(yǎng)板中每孔加入75 l冰上過夜解凍的Matrigel，置于37孵箱中 孵 育15min以上使Matrigel 聚集。同時胰酶消化常規(guī)培養(yǎng)的正常鼻咽細胞及其高轉(zhuǎn)

7、移潛能亞株5-8F, 計數(shù)后離心收集細胞.然后把細胞懸浮于含2%Matrigel的Keratinocyte-SFM培養(yǎng)液中，細胞濃度為2*104/ml用 加樣槍吹打成單個細胞后, 每孔加入400 l 細胞懸液于已經(jīng)凝固的Matrigel上，置于含5%CO2的37孵箱中培養(yǎng)，每3-4 天換新鮮培養(yǎng)液2。 4.2.3三明治培養(yǎng)模型的建立方法三明治模式前期工作和凝膠上模式相同,不同之處在于凝膠上的細胞經(jīng)培養(yǎng)融合至(70、80)%左右時,吸去培養(yǎng)液,用無菌PBS沖洗兩次后添加第二層膠(200l/孔),在37下培養(yǎng)30min使其凝固后,再在膠原凝固面上添加培養(yǎng)液3。 三種模型的簡單解釋 4.3不同模型的

8、比較對于膠上培養(yǎng)模式，細胞可以黏附于細胞外基質(zhì)表面并向再造基質(zhì)膠中生長，但是只有貼近 Matrigel 膠的細胞才能得到固體細胞外基質(zhì)的支撐，其他不能貼近再造基質(zhì)膠的細胞仍然處于 2D 培養(yǎng)條件下，在培養(yǎng)過程中不能形成完全的立體克??；對于膠內(nèi)培養(yǎng)模式，細胞直接重懸于完全融化的 Matrigel 膠條件下，細胞生長于完全固態(tài)的細胞外基質(zhì)中，可以很好地模擬體內(nèi)腫瘤細胞生長微環(huán)境，在培養(yǎng)過程中形成了巨大的、無極性的球狀細胞克隆。所以大多數(shù)的實驗建立三維模型采用膠內(nèi)培養(yǎng)模式，但相對來說膠上培養(yǎng)模式簡單一些，對于操作的要求低一些。三種模型共同的缺點是無法對細胞直接利用顯微鏡進行連續(xù)的觀察，需要對某一特定

9、時間的膠原塊進行固定制作電鏡標(biāo)本。 B CA 2D細胞培養(yǎng)模型B細胞生長于 Matrigel 膠表面 C細胞重懸于 Matrigel 膠中 4 5三維細胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用5.1腫瘤生物學(xué)三維細胞培養(yǎng)已被廣泛運用到腫瘤學(xué)研究,在腫瘤的實驗性治療、腫瘤的侵襲性、轉(zhuǎn)移和中心壞死的機制、腫瘤的血管形成和營養(yǎng)供給、體內(nèi)基因表達的模擬等方面發(fā)揮了不可替代的作用5。同時可以研究不同細胞間的相互作用，觀察兩種不同的細胞類型是否融合或是不相關(guān)地各自生長 5.2軟骨和骨組織成熟的軟骨細胞和干細胞被廣泛用于三維細胞培養(yǎng),以再生損傷的軟骨、骨、韌帶、肌腱和膝關(guān)節(jié)半月板。在培養(yǎng)系統(tǒng)中常加入一些生長因子,以刺激分化,產(chǎn)生組

10、織. 5.3循環(huán)系統(tǒng)和心臟各組織都配備有大小各異的血管。如何在成熟的組織中及時產(chǎn)生血管網(wǎng)絡(luò)是組織工程的重要課題;在治療領(lǐng)域,所關(guān)心的也是如何有目的地改變血管形成,利用三維培養(yǎng)可以清楚地觀察到細胞通過空間增殖、遷移和錨定,最終形成管狀結(jié)構(gòu)。 6三維細胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展前景近年來,三維細胞培養(yǎng)作為一項新興的細胞培養(yǎng)技術(shù),其與二維細胞培養(yǎng)中細胞的平面生長相比,最大的優(yōu)勢在于提供了一個三維的立體微環(huán)境,細胞在這個微環(huán)境中完成增殖、分化、運動、凋亡等等一系列過程,很大程度上模擬了人體微環(huán)境中的細胞狀態(tài),因而具有極大的可開發(fā)性。 尤其是在抗腫瘤研究領(lǐng)域,模擬腫瘤微環(huán)境,關(guān)注腫瘤細胞外基質(zhì)在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中

11、的作用成為了一個熱點話題。三維細胞培養(yǎng)技術(shù),恰恰為腫瘤細胞的生長提供了與人體相一致的微環(huán)境,因而在為抗腫瘤治療尋找新靶點等方面具有不可替代的價值,值得進一步的開發(fā)和利用。但是必須承認,目前的三維培養(yǎng)技術(shù)仍然有待發(fā)展,一方面其成本仍較高,另一方面由于培養(yǎng)條件尚處于亞最佳狀態(tài),細胞的生存能力和分化程度有限,與真實人體尚存在差異,所以如何通過技術(shù)上的繼續(xù)完善使培養(yǎng)條件盡可能地模擬體內(nèi),是擺在研究人員面前的重要任務(wù)。 注釋（1）細胞外基質(zhì)由細胞分泌到細胞外間質(zhì)中的大分子物質(zhì)，構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，支持并連接組織結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)組織的發(fā)生和細胞的生理活動。在生物學(xué)中，細胞外間質(zhì)或細胞外基質(zhì)是動物組織的一部分，不

12、屬于任何細胞。細胞外間質(zhì)決定結(jié)締組織的特性，對于一些動物組織的細胞具有重要作用。它決定結(jié)締組織的特性，為細胞的生存及活動提供適宜的場所，并通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)影響細胞的形狀、代謝、功能、遷移、增殖和分化，主要成分包括糖胺聚糖、蛋白聚糖，結(jié)構(gòu)蛋白，粘著蛋白。 （2）基質(zhì)膠可認為是一種可溶性的基底膜基質(zhì)。主要成分包括：層黏連蛋白、膠原IV等，同時含TGF-成纖維細胞生長因子、組織纖維酶原活化因子以及其它在EHS腫瘤中自然表達的生長因子等。（3）三維膠的最終濃度，需要根據(jù)實驗條件進一步的確定，濃度的高低不僅影響到凝膠的時間，同時影響到細胞在膠內(nèi)存在的狀態(tài)。（4）Matrigel在22-35溫度環(huán)境下快速

13、成膠，因此溶解時在4冰上過夜凍融（4度時會隨著溫度的上升部分成膠）。所有用品在使用前需置于冰浴，必須使用預(yù)冷的移液管、吸頭及小管操作Matrigel。成膠后的Matrigel可以在4 2448小時后重新呈液態(tài)。 (5) Matrigel基底膜基質(zhì)在室溫條件下，聚合形成具有生物學(xué)活性的三維基質(zhì)，模擬體內(nèi)細胞基底膜的結(jié)構(gòu)、組成、物理特性和功能,基底膜是細胞外基質(zhì)特化而形成的一種柔軟、堅韌的網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)。 參考文獻 1馮志華,米坤. Matrigel膠的肺腺癌細胞株A549體外三維培養(yǎng)的實驗研究J.西部醫(yī)學(xué),2009,21(9): 2廖雯婷,汪慧民,李滿枝等.鼻咽癌變不同時期的體外三維培養(yǎng)模型建立的實驗研究J.Chinese Journal of Cancer,2005, 24(11):1317-1321. 3王銘潔,蔡文杰,姚泰,朱依純.血管內(nèi)皮細胞和心臟組織塊的立體培養(yǎng)J.生理學(xué)報,2005,57(2):259一269. 4吳亞妹.體外三維培養(yǎng)條件下肝癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移的實驗研究 J. 5楊志林,徐如祥.三維細胞培養(yǎng)在腫瘤研究中的進展J.國外醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)分冊,2001,28(2):100-104.