《基因工程基因操作的工具酶》由會員分享，可在線閱讀，更多相關《基因工程基因操作的工具酶（38頁珍藏版）》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。
1、單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,*,3.3 DNA聚合酶,DNA聚合酶,：能夠催化脫氧核糖核苷酸連續(xù)加到雙鏈DNA分子引物鏈的游離3-OH末端，使核苷酸發(fā)生聚合作用，而不從模板上解離。,反應特點,：,(1) 以四種三磷酸脫氧核糖核苷（dNTP）為底物,(2) 反應需要模板的指導，加入的核苷酸由模板鏈所決定,(3) 聚合反應需要有引物存在，且引物要有3-OH游離基團,(4) DNA鏈的生長方向為5,3,(5) 產物DNA鏈的性質與模板相同（半保留復制）,DNA聚合酶只能在已有的核酸鏈上延伸DNA鏈，而不能從無到有開始DNA鏈的合成。,種類,：,
2、到目前為止，已從,E.coli,中發(fā)現(xiàn)了Pol I、Pol II、Pol III三種DNA聚合酶 。其中Pol I 和Pol II的主要功能是參與DNA的修復過程，Pol III與DNA的復制有關。三種聚合酶中，只有Pol I 同分子克隆關系密切。,3.3.1 大腸桿菌DNA聚合酶 I,（,E.coli,DNA Pol I）,DNA Pol I是從大腸桿菌細胞中分離得到的，該酶是由單一多肽組成的球蛋白，MW=109000，直徑=65,DNA Pol I已得到高度純化，從100 kg大腸桿菌中可以分離到約500 mg純化的酶蛋白。每個成熟的大腸桿菌細胞中約有400個分子的Pol I。,1. DN
3、A Pol I在空間結構上有三個位點：,(1)DNA模板結合位點結合模板,(2)核苷酸-磷酸結合位點結合引物,(3)dNTP結合位點結合底物,2. DNA Pol I是一種多功能酶：,(1) 5,3的聚合酶活性,催化單核苷酸逐個地結合到DNA模板的3-OH末端，沿著引物的3-OH方向按模板順序從5,3延伸。,每分子DNA pol I每分鐘可以催化約1000個核苷酸的聚合。,(2) 5,3的外切酶活性,只作用于雙鏈DNA（dsDNA） ，從5端切割下一個個單核苷酸。,(3) 3,5的外切酶活性,能從游離的3末端降解單鏈DNA（ssDNA）成為單核苷酸，通常對雙鏈,DNA不作用,。,在正常聚合條件
4、下，該酶對dsDNA的,3,5外切酶活性受到5,3聚合酶活性的抑制。但一旦出現(xiàn)錯配堿基時，聚合反應立即停止，由3,5外切酶迅速除去錯誤進入的核苷酸，然后聚合反應才得以繼續(xù)進行下去。所以3,5核酸外切酶活力被認為起著校對功能，對DNA復制的忠實性極為重要。,3.,E.coli,DNA Pol I在基因工程中的用途:,(1),可用于填補dsDNA上的缺口，以便有效地進行DNA重組,(2) 用于DNA序列分析,(3) 用于制備DNA探針,在DNA分子的單鏈缺口上，DNA聚合酶I的5,3核酸外切酶活性和聚合作用可以同時發(fā)生。當外切酶活性從缺口的5一側移去一個5核苷酸后，聚合作用就會在缺口的3一側補上一
5、個新的核苷酸。隨著反應的進行，5一側的核苷酸不斷地被移去，3一側的核苷酸又按序地增補，于是缺口便沿著DNA分子按合成的方向移動,缺口平移,（Nick Translation）。,應用缺口平移法制備DNA雜交探針，其典型的反應體系是：在25,l總體積中含有1,g純化的特定的DNA片段，并加入適量的DNase I、pol I、,32,P,dNTP和未標記的dNTP。,脫氧核糖核苷酸酶 I（DNase I）是一種內切酶，它能夠水解單鏈或雙鏈DNA，形成帶有5-磷酸末端的單（寡）核苷酸。,由于,32,P,dNTP比,較,較昂貴，所,以,以一般都采,用,用低濃度的,32,P,dNTP（2,mol/L,）
6、,）和高濃度,的,的未標記的dNTP（20,mol/L,）,）。而且就,大,大多數(shù)實驗,的,的要求，使,用,用一種,32,P,dNTP就,足,足夠了，其,他,他3種均可,采,采用未標記,的,的dNTP,，,，或是用適,量,量的未標記,的,的dNTP,稀,稀釋每種,32,P,dNTP。,改變反應體,系,系中DNase I的,數(shù),數(shù)量，可以,控,控制,32,P,dNTP的,參,參入程度，,一,一般希望有30%左右,的,的,32,P,dNTP參,入,入DNA鏈,。,。,大,大腸桿菌DNA聚合,酶,酶 I的Klenow,片,片段,（,E.coli,DNA Pol IKlenow fragment,）,
7、）,用蛋白酶將DNA Pol I,作,作有限水解,，,，可得到分,子,子量為75000 dal和36000 dal的兩個,片,片段，大片,段,段即稱為Klenow,片,片段，它具,有,有5,3的聚合,酶,酶活性和3,5的核酸,外,外切酶活性,，,，但失去了,全,全酶的5,3的核酸,外,外切酶活性,。,。,Klenow聚合酶可,以,以標記DNA片段末端,（,（5延伸,末,末端）。,對于限制性,核,核酸內切酶EcoRI切割后形成,的,的5延伸,末,末端可用,32,P,dATP標,記,記：,而BamHI切割后形,成,成的5延,伸,伸末端可用,32,P,dGTP標,記,記：,4,DNA聚合,酶,酶,是
8、從T,4,噬菌體感染,的,的大腸桿菌,中,中分離純化,的,的一種特殊,的,的DNA聚,合,合酶。,1. T,4,DNA聚合,酶,酶也是一種,多,多功能酶：,(1) 5,3的聚合,酶,酶活性,(2) 3,5的外切,酶,酶活性,其外切酶活,性,性比,E.coli,DNA Pol I,的,的活性高200倍。,(3)取代反應活,性,性,如果在反應,混,混合物中僅,存,存在一種dNTP，則,此,此酶的3,5外切酶,活,活性將從dsDNA,的,的3末端,降,降解，直到,互,互補于這個dNTP的,堿,堿基出現(xiàn)為,止,止，然后在,這,這一位置發(fā),生,生取代反應,。,。,2. T,4,DNA聚合,酶,酶在基因工
9、,程,程中的應用,(1) 以,填,填充反應標,記,記帶有5,延,延伸末端的dsDNA,片,片段,(2),將,將DNA,的,的3,延,伸,伸末,端,端切,成,成平,末,末端,(3),以,以取,代,代反,應,應標,記,記帶,有,有3,延,伸,伸末,端,端或,平,平末,端,端的dsDNA片,段,段,(4),以,以部,分,分消,化,化dsDNA,法,法標,記,記DNA,片,片段,作,作為,雜,雜交,探,探針,（,（鏈,特,特異,的,的探,針,針）,逆,逆轉,錄,錄酶,是一,種,種有,效,效的,轉,轉錄RNA成,為,為DNA,的,的酶,，,，又,稱,稱RNA,依,依賴,的,的DNA,聚,聚合,酶,酶，,
10、其,其產,物,物DNA,稱,稱cDNA，,即,即互,補,補DNA,。,。,1.,逆,逆,轉,轉錄,酶,酶也,是,是一,個,個多,功,功能,酶,酶：,(1)RNA依,賴,賴的DNA聚,合,合酶,以RNA,鏈,鏈為,模,模板,，,，以,帶,帶有3-OH末,端,端的DNA片,段,段為,引,引物,，,，沿5,3,方,方向,合,合成DNA鏈,。,。,幾乎,所,所有,真,真核,生,生物,的,的mRNA分,子,子3,末,端,端都,有,有一,段,段PolyA，,故,故加,入,入寡,聚,聚dT后,，,，mRNA就,可,可以,成,成為,逆,逆轉,錄,錄酶,很,很好,的,的模,板,板，,由,由此,可,可合,成,成c
11、DNA。,(2)DNA依,賴,賴的DNA聚,合,合酶,以ssDNA,為,為模,板,板，,以,以帶,有,有3,-OH,末,末端,的,的DNA,片,片段,為,為引,物,物，,沿,沿5,3,方,方向,合,合成DNA鏈,。,。,可在,新,新合,成,成的DNA鏈,上,上合,成,成另,一,一條,互,互補DNA。,(3),外,外切RNA酶,活,活性,底物,是,是RNA-DNA,雜,雜交,分,分子,中,中的RNA鏈,，,，其,水,水解,方,方向,有,有兩,種,種：,*,從,從RNA,鏈,鏈5,末,末端,外,外切,：,：稱5,3,外,外切RNA酶,*,從,從RNA,鏈,鏈3,末,末端,外,外切,：,：稱3,5,
12、外,外切RNA酶,2.,逆,逆,轉,轉,錄,錄,酶,酶,在,在,基,基,因,因,工,工,程,程,中,中,的,的,應,應,用,用,：,：,主,要,要,用,用,途,途,是,是,轉,轉,錄,錄,真,真,核,核,生,生,物,物,的,的mRNA,成,成,為,為cDNA,，,，,從,從,而,而,制,制,備,備,基,基,因,因,片,片,段,段,。,。,3.,商,商,品,品,化,化,的,的,逆,逆,轉,轉,錄,錄,酶,酶,有,有,兩,兩,種,種,：,：,(1),禽,禽,成,成,髓,髓,細,細,胞,胞,瘤,瘤,病,病,毒,毒,（,（AMV,）,）,逆,逆,轉,轉,錄,錄,酶,酶,(2)Moloney,鼠,鼠,白
13、,白,血,血,病,病,病,病,毒,毒,（,（Mo-MLV,）,）,逆,逆,轉,轉,錄,錄,酶,酶,AMV,逆,逆,轉,轉,錄,錄,酶,酶,雖,雖,能,能,更,更,有,有,效,效,地,地,拷,拷,貝,貝,復,復,雜,雜,的,的mRNA,，,，,但,但,它,它,有,有,很,很,強,強,的,的,外,外,切,切RNA,酶,酶,活,活,性,性,。,。,而,而Mo-MLV,逆,逆,轉,轉,錄,錄,酶,酶,的,的,外,外,切,切RNA,酶,酶,活,活,性,性,較,較,弱,弱,，,，,更,更,有,有,利,利,于,于,制,制,備,備,全,全,長,長,的,的cDNA,。,。,兩,種,種,逆,逆,轉,轉,錄,錄,酶
14、,酶,均,均,無,無3,5,外,外切DNA酶,活,活性,，,，故,不,不具,備,備校,對,對功,能,能，,在,在高,濃,濃度dNTP,和,和Mn,2+,存在,下,下，,容,容易,出,出現(xiàn),核,核苷,酸,酸錯,誤,誤摻,入,入。,3.4DNA和RNA的,修,修飾,酶,酶,核,核酸,酶,酶SI,1.,作,作用,特,特點,：,：,此酶,是,是從,米,米曲,霉,霉（,Aspergillusoryzae,）中,提,提取,的,的，,可,可降,解,解ssDNA,或,或ssRNA,，,，又,稱,稱單,鏈,鏈特,異,異性,酶,酶，,其,其降,解,解產,物,物是5-磷,酸,酸末,端,端的,單,單或,寡,寡核,苷,
15、苷酸,片,片段,。,。,核酸,酶,酶SI對DNA底,物,物的,活,活性,比,比對RNA強,。,。高,濃,濃度,的,的核,酸,酸酶SI,可,可從,缺,缺口,（,（nick）,或,或小,裂,裂縫,（,（gap,）,）處,降,降解dsDNA。,2.,作,作,用,用條,件,件：,需要Zn,2+,作為,輔,輔助,因,因子,，,，最,適,適pH是4.5，,這,這是,與,與基,因,因工,程,程的,其,其它,工,工具,酶,酶不,同,同的,兩,兩個,特,特點,。,。,3.,在,在,基,基因,工,工程,中,中的,應,應用,：,：,由于,核,核酸,酶,酶SI能,從,從DNA,片,片段,中,中切,除,除單,鏈,鏈尾,
16、巴,巴，,因,因而,在,在質,粒,粒的,重,重建,和,和DNA,重,重組,中,中被,廣,廣泛,使,使用,。,。,切除,單,單鏈,粘,粘性,末,末端,，,，產,生,生平,末,末端,，,，再,用,用T,4,連接,酶,酶連,接,接。,切除cDNA,的,的發(fā),夾,夾結,構,構。,末,末端,脫,脫氧,核,核苷,酸,酸轉,移,移酶,1.,作,作,用,用特,點,點：,此酶,是,是從,小,小牛,胸,胸腺,中,中提,取,取的,，,，可,催,催化,單,單核,苷,苷酸,轉,轉移,到,到另,一,一個DNA分,子,子的3-OH末,端,端上,，,，不,需,需要,模,模板,，,，其,引,引物,是,是帶3-OH末,端,端的s
17、sDNA,（,（Mg,2+,為輔,因,因子,）,）。,平,平末,端,端的dsDNA只,有,有CO,2+,存在,時,時才,能,能作,引,引物,。,。,2. 在,基,基因工程,中,中的應用,：,：,在連接平,末,末端DNA片段時,加,加上互補,的,的同源多,聚,聚物（同,聚,聚物加尾,法,法）。,3.4.3 外核,酸,酸酶III,1. 作,用,用特點：,此酶是從,E.coli,中分離得,到,到的，是,一,一種從dsDNA,的,的3-OH末端,降,降解產生5單核,苷,苷酸的外,切,切酶。,2. 在,基,基因工程,中,中的應用,：,：,產生具有5延伸,末,末端的DNA片段,制備特異,的,的DNA,探,
18、探針,3.4.4 外核,酸,酸酶Bal 31,1. 作,用,用特點：,此酶是從,乳,乳白短桿,菌,菌（,Brevibacerium aldidum,）中提取,的,的。能以,漸,漸進的方,式,式從線型DNA分,子,子的3,，,，5兩,端,端同時降,解,解，產物,是,是單核苷,酸,酸或寡核,苷,苷酸片段,。,。底物可,以,以是帶延,伸,伸末端或,是,是平末端,的,的dsDNA，對3、5,兩端的,降,降解速度,相,相同。,2. 作,用,用條件：,降解時需,要,要Ca,2+,作輔助因,子,子，以EDTA作,螯,螯合劑，,可,可使Bal 31,失,失活。,3. 在,基,基因工程,中,中的應用,：,：,可
19、用于組,建,建DNA,的,的物理圖,譜,譜，以及,造,造成克隆DNA分,子,子的末端,缺,缺失。,3.4.5 T,4,多核苷酸,激,激酶,1. 作,用,用特點：,此酶是從,噬,噬菌體T,4,感染的,E.coli,中分離的,。,。能催化ATP的,-磷酸,轉,轉移到DNA或RNA的5,-OH,末,末端上。,2. 在,基,基因工程,中,中的應用,：,：,可用于缺,乏,乏5-,磷,磷酸的待,連,連接DNA片段的5端磷,酸,酸化：反,轉,轉錄mRNA生成,的,的cDNA、人工,合,合成的DNA片段,及,及PCR,擴,擴增得到,的,的DNA,都,都缺少5,-磷酸,基,基，在與,克,克隆載體,連,連接之前,
20、，,，需用T,4,多核苷酸,激,激酶將DNA的5,-磷酸,化,化。,3.4.6 堿性,磷,磷酸化酶,（,（堿性磷,酸,酸酯酶）,1. 作,用,用特點：,從細菌中,分,分離的堿,性,性磷酸化,酶,酶簡稱BAP，從,小,小牛腸中,分,分離的簡,稱,稱CAP,。,。它能特,異,異性地切,去,去DNA,或,或RNA,的,的5-,磷,磷酸。底,物,物可以是ssDNA、dsDNA或RNA，,也,也可以是,核,核糖或脫,氧,氧核糖核,苷,苷三磷酸,。,。,2. 在,基,基因工程,中,中的應用,：,：,在用,32,P標記DNA的5,末端之,前,前，除去,磷,磷酸。,在DNA,重,重組技術,中,中，除去DNA片
21、,段,段的5-,磷,磷酸，,阻,阻止質,粒,粒自身,環(huán),環(huán)化，,提,提高轉,化,化效率,。,。,形成帶,有,有兩個,缺,缺口的,開,開環(huán)分,子,子，由,于,于環(huán)狀DNA,（,（即使,是,是有缺,口,口的環(huán),狀,狀DNA）的,轉,轉化效,率,率比線,狀,狀質粒DNA,片,片段高,得,得多，,因,因此絕,大,大多數(shù),轉,轉化子,都,都含有,重,重組質,粒,粒，并,且,且這樣,的,的缺口,在,在寄主,細,細胞內,可,可自行,補,補上。,9,、靜夜四無,鄰,鄰，荒居舊,業(yè),業(yè)貧。12月-2212月-22,Friday, December 23,2022,10,、雨中黃葉,樹,樹，燈下白,頭,頭人。05
22、:56:0405:56:0405:56,12/23/20225:56:04 AM,11,、以,我,我獨,沈,沈久,，,，愧,君,君相,見,見頻,。,。12,月,月-2205:56:0405:56,Dec-2223-Dec-22,12,、故人江,海,海別，幾,度,度隔山川,。,。05:56:0405:56:0405:56,Friday,December23,2022,13,、,乍,乍,見,見,翻,翻,疑,疑,夢,夢,，,，,相,相,悲,悲,各,各,問,問,年,年,。,。,。,。12,月,月-2212,月,月-2205:56:0405:56:04,December23,2022,14,、,他,他,
23、鄉(xiāng),鄉(xiāng),生,生,白,白,發(fā),發(fā),，,，,舊,舊,國,國,見,見,青,青,山,山,。,。,。,。23,十,十,二,二,月,月20225:56:04,上,上,午,午05:56:0412,月,月-22,15,、比不了得,就,就不比，得,不,不到的就不,要,要。十二月 225:56,上,上午12月-2205:56,December 23, 2022,16,、行,動,動出,成,成果,，,，工,作,作出,財,財富,。,。2022/12/235:56:0405:56:04,23December2022,17,、做前，能,夠,夠環(huán)視四周,；,；做時，你,只,只能或者最,好,好沿著以腳,為,為起點的射,線,線向
24、前。5:56:04 上午5:56,上,上午05:56:0412月-22,9,、沒,有,有失,敗,敗，,只,只有,暫,暫時,停,停止,成,成功,！,！。12,月,月-2212,月,月-22,Friday,December23,2022,10,、很,多,多事,情,情努,力,力了,未,未必,有,有結,果,果，,但,但是,不,不努,力,力卻,什,什么,改,改變,也,也沒,有,有。,。,。05:56:0405:56:0405:56,12/23/20225:56:04AM,11,、成功,就,就是日,復,復一日,那,那一點,點,點小小,努,努力的,積,積累。,。,。12月-2205:56:0405:56,D
25、ec-2223-Dec-22,12,、世間,成,成事，,不,不求其,絕,絕對圓,滿,滿，留,一,一份不,足,足，可,得,得無限,完,完美。,。,。05:56:0405:56:0405:56,Friday, December 23,2022,13,、不知香積,寺,寺，數(shù)里入,云,云峰。12月-2212月-2205:56:0405:56:04,December 23, 2022,14,、意志堅強,的,的人能把世,界,界放在手中,像,像泥塊一樣,任,任意揉捏。23 十二,月,月 20225:56:04 上午05:56:0412月-22,15,、楚塞三湘,接,接，荊門九,派,派通。十二月 225:56
26、,上,上午12月-2205:56,December 23, 2022,16,、少年十五,二,二十時，步,行,行奪得胡馬,騎,騎。2022/12/235:56:0405:56:04,23 December 2022,17,、,空,空,山,山,新,新,雨,雨,后,后,，,，,天,天,氣,氣,晚,晚,來,來,秋,秋,。,。,。,。5:56:04,上,上,午,午5:56,上,上,午,午05:56:0412,月,月-22,9,、,楊,楊,柳,柳,散,散,和,和,風,風,，,，,青,青,山,山,澹,澹,吾,吾,慮,慮,。,。,。,。12,月,月-2212,月,月-22,Friday,December23,
27、2022,10,、,閱,閱,讀,讀,一,一,切,切,好,好,書,書,如,如,同,同,和,和,過,過,去,去,最,最,杰,杰,出,出,的,的,人,人,談,談,話,話,。,。05:56:0405:56:0405:56,12/23/20225:56:04AM,11,、越是,沒,沒有本,領,領的就,越,越加自,命,命不凡,。,。12月-2205:56:0405:56,Dec-2223-Dec-22,12,、越是,無,無能的,人,人，越,喜,喜歡挑,剔,剔別人,的,的錯兒,。,。05:56:0405:56:0405:56,Friday,December23,2022,13,、知人,者,者智，,自,自知者
28、,明,明。勝,人,人者有,力,力，自,勝,勝者強,。,。12月-2212月-2205:56:0505:56:05,December23,2022,14,、意志,堅,堅強的,人,人能把,世,世界放,在,在手中,像,像泥塊,一,一樣任,意,意揉捏,。,。23,十,十二月20225:56:05 上,午,午05:56:0512月-22,15,、最具挑戰(zhàn),性,性的挑戰(zhàn)莫,過,過于提升自,我,我。十二月 225:56,上,上午12月-2205:56,December 23, 2022,16,、業(yè)余生活,要,要有意義，,不,不要越軌。2022/12/235:56:0505:56:05,23 December 2022,17,、一個人即,使,使已登上頂,峰,峰，也仍要,自,自強不息。5:56:05 上午5:56,上,上午05:56:0512月-22,MOMODA POWERPOINT,Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit. Fusce id urna blandit, eleifend nulla ac, fringilla purus. Nulla iaculis tempor felis ut cursus.,感謝您的下,載,載觀看,專家告訴,
基因工程基因操作的工具酶
