最新基因工程的基本操作程序新課課件

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1、單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),*,基因工程的基本操作程序新課,基因工程的基本操作程序,1、目的基因的獲取,2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建,3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,4、目的基因的檢測(cè)與鑒定,基因組DNA文庫(kù),cDNA文庫(kù),基因組DNA文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的比較,（3）,如何從基因文庫(kù)中得到所需要的基因？,依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息,。,如：根據(jù)基因的核苷酸序列,基因的功能基因在

2、染色體上的位置,基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA,基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì) 等特性。,（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,PCR,多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),是一項(xiàng)生物,體外復(fù)制,特定,DNA,片段的核酸合成,技術(shù),。通過此技術(shù)，可獲取大量的目的基因。,PCR技術(shù),原理：,前提：,原料,方式,PCR擴(kuò)增儀,DNA復(fù)制,一段已知目的基因的核苷酸序列,：以_方式擴(kuò)增，,即_（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）,指數(shù),2,n,模板DNA；DNA引物；四種脫氧核苷酸；熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）；離子,如：Mg,2+,(激活劑),利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,過程,變性、退火、延伸三步曲,變性：,加熱至,90,95,雙鏈,DNA,解鏈成為單鏈,

3、DNA,退火：,冷卻至,55,60,部分引物與模板的單鏈,DNA,的特定互補(bǔ)部位相配對(duì)和結(jié)合,延伸：,加熱至,70,75,以目的基因?yàn)槟０?，合成互補(bǔ)的新,DNA,鏈,變性,退火,延伸,PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)),PCR,技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較,PCR,技術(shù),DNA,復(fù)制,相同點(diǎn),原理,原料,條件,不同點(diǎn),解旋方式,場(chǎng)所,酶,結(jié)果,堿基互補(bǔ)配對(duì),四種脫氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA在高溫下變性解旋,解旋酶催化,體外復(fù)制,細(xì)胞核內(nèi),熱穩(wěn)定的DNA聚合酶,細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整個(gè)DNA分子,目的基因的mRNA,單鏈DNA,(cDNA）,雙鏈DNA,(即目的基因),反轉(zhuǎn)錄,

4、合成,1）反轉(zhuǎn)錄法：,以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。,蛋白質(zhì)的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列,目的基因,推測(cè),推測(cè),化學(xué)合成,2）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：,3、人工合成的目的基因,1.用一定的_切割,質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切,口，露出_。,2.用_切斷目,的基因，使其產(chǎn)生_,_。,核心,3.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處，,再加入適量_，形成了一個(gè)重組,DNA分子（重組質(zhì)粒）,限制酶,黏性末端,同一種限制酶,的黏性末端,切口,DNA連接酶,相同,(二)基因表達(dá)載體的構(gòu)建,基因表

5、達(dá)載體的構(gòu)建,核心,質(zhì)粒,DNA分子,一個(gè),切口,兩個(gè),黏性末端,兩個(gè),切口,獲得目的基因,DNA 連接酶,重組DNA分子（重組質(zhì)粒）,同一種 限制酶,目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過程，實(shí)際上是不同來源的基因重組的過程。,科學(xué)家在培育抗蟲棉時(shí)，經(jīng)過了許多復(fù)雜的過程和不懈的努力，才獲得成功。,起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲基因在棉花體內(nèi)沒有表達(dá)。,然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入啟動(dòng)子(抗蟲基因首端)，導(dǎo)入棉花受精卵，長(zhǎng)成的棉花植株還是沒有抗蟲能力?？茖W(xué)家又在有啟動(dòng)子、抗蟲基因的質(zhì)粒中插入終止子(抗蟲基因末端)，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長(zhǎng)的植株，有了抗蟲能力

6、。,資 料:,基因表達(dá)載體的組成：,目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。,a、目的基因,b、啟動(dòng)子,c、終止子,d、標(biāo)記基因等,(三)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,常用的受體細(xì)胞：,動(dòng)植物細(xì)胞、大腸桿菌、土壤農(nóng)桿菌、枯草桿菌等。,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理：,借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。,轉(zhuǎn)化,目的基因進(jìn)入_內(nèi)，并且在 受體細(xì)胞內(nèi)維持_和_的過程,受體細(xì)胞,穩(wěn)定,表達(dá),方法,導(dǎo)入植物細(xì)胞,導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞,導(dǎo)入微生物細(xì)胞,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,基因槍法,花粉管通道法,顯微注射法,感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子,(三)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,1、,將目的基因

7、導(dǎo)入植物細(xì)胞,（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,特點(diǎn):,能感染,雙子葉植物,和,祼子植物,對(duì)單子葉植物無感染能力,Ti質(zhì)粒,的TDNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞并整合到其染色體上,轉(zhuǎn)化過程:,Ti質(zhì)粒,目的基因,構(gòu)建,表達(dá)載體,導(dǎo)入,植物細(xì)胞,插入,植物細(xì)胞染色DNA,表達(dá),新性狀,轉(zhuǎn)入,農(nóng)桿菌,（2）基因槍法,基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。,（3）花粉通道法,植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆?，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的

8、基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。,2、,將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞,方法:,顯微注射技術(shù),操作程序,:,提純含目的基因表達(dá)載體,取受精卵,顯微注射,移植到子宮,受精卵發(fā)育,新性狀動(dòng)物,3、,將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞,常用法,：Ca,2+,處理,常用菌,：大腸桿菌,微生物作受體細(xì)胞原因：,繁殖快,、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少,過程：,Ca,2+,處理,大腸桿菌,感受態(tài)細(xì)胞,表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合,感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA,(四)目的基因的檢測(cè)與鑒定,檢查是否成功,檢測(cè),鑒定,檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA,上是否插入了目的基因,檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),抗蟲鑒定、抗

9、病鑒定、活性鑒定等,方法,方法,方法,DNA分子雜交,DNA,分子雜交,抗原-抗體雜交,如果顯示出雜交帶，就表明待測(cè)樣品含有目的基因或目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)錄。,1.下表關(guān)于基因工程中有關(guān)基因操作,的名詞及對(duì)應(yīng)的內(nèi)容，正確的組合是,2、下列屬于獲取目的基因的方法的是(),利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成從基因組文庫(kù)中提取,從受體細(xì)胞中提取 利用PCR技術(shù),利用DNA轉(zhuǎn)錄 人工合成,A.B.C.D.,3.細(xì)菌的質(zhì)粒分子帶有一個(gè)抗菌素抗性基因，該抗性基因在基因工程中的主要作用是,A,提高受體細(xì)胞在自然環(huán)境中的耐藥性,B有利于對(duì)目的基因是否導(dǎo)入進(jìn)行檢測(cè),C增加質(zhì)粒分子的分子量,D便于與外源基因連接,4.,有關(guān)基因工程

10、的敘述正確的是,A限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用,B重組質(zhì)粒的形成是在細(xì)胞內(nèi)完成的,C質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體,D蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料,5.哪項(xiàng)不是基因表達(dá)載體的組成部分(),A.啟動(dòng)子 B.終止密碼,C.標(biāo)記基因 D.目的基因,6.下列哪項(xiàng)不是將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法(),A基因槍法 B顯微注射法,C.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 D花粉管通道法,不可以。因?yàn)槟康幕蛟诒磉_(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是：,（1）生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用,受體生物自身基因,的啟動(dòng)子才能比較有利于基因的表達(dá)；,（2）通過cDNA文庫(kù)獲

11、得的目的基因沒有啟動(dòng)子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無法轉(zhuǎn)錄；,（3）目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記；,（4）為了增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強(qiáng)子等；,（5）有時(shí)需要確定目的基因表達(dá)的產(chǎn)物存在于細(xì)胞的什么部位，往往要加上可以標(biāo)識(shí)存在部位的基因（或做成目的基因與標(biāo)識(shí)基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。,知識(shí)延伸,DNA分子雜交技術(shù),該方法是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，把互補(bǔ)的雙鏈DNA解開，把單股的DNA小片段用同位素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑等進(jìn)行標(biāo)記，之后同被檢測(cè)的DNA中的同源互補(bǔ)序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因。,思考與探究：,2.根據(jù)農(nóng)桿菌可

12、將目的基因?qū)腚p子葉植物的機(jī)理,你能分析出不能導(dǎo)入單子葉植物的原因嗎?若將一個(gè)抗病基因?qū)胄←溨?理論上講你應(yīng)該怎樣做?,要選擇合適的農(nóng)桿菌菌株，因?yàn)椴皇撬械霓r(nóng)桿菌菌株都可以侵染單子葉植物；要加趨化和誘導(dǎo)的物質(zhì)，一般為乙酰丁香酮等，目的是使農(nóng)桿菌向植物組織的受傷部位靠攏（趨化性）和激活農(nóng)桿菌的Vir區(qū)（誘導(dǎo)）的基因，使T-DNA轉(zhuǎn)移并插入到染色體DNA上。,3.利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關(guān)細(xì)胞器功能的知識(shí)，結(jié)合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？,有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價(jià)結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體上加工完成的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和

13、高爾基復(fù)合體存在于真核細(xì)胞中，大腸桿菌不存在這兩種細(xì)胞器，因此，在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。,4.-珠蛋白是動(dòng)物血紅蛋白的重要組成成分。當(dāng)它的成分異常時(shí)，動(dòng)物有可能患某種疾病，如鐮刀形細(xì)胞貧血癥。假如讓你用基因工程的方法，使大腸桿菌生產(chǎn)出鼠的-珠蛋白，想一想，應(yīng)如何進(jìn)行設(shè)計(jì)？,（,1,）從小鼠中克隆出,-珠蛋白基因的編碼序列（cDNA)。,（2）將cDNA前接上在大腸桿菌中可以適用的啟動(dòng)子，另外加上抗四環(huán)素的基因，構(gòu)建成一個(gè)表達(dá)載體。,（3）將表達(dá)載體導(dǎo)入無四環(huán)素抗性的大腸桿菌中，然后在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌。如果表達(dá)載體未進(jìn)入大腸桿菌中，大腸桿菌會(huì)不含有抗四環(huán)素基因而死掉；如果培養(yǎng)基上長(zhǎng)出大腸桿菌菌落，則表明-珠蛋白基因已進(jìn)入其中。,（4）培養(yǎng)進(jìn)入了-珠蛋白基因的大腸桿菌，收集菌體，破碎后從中提取-珠蛋白。,結(jié)束語,謝謝大家聆聽！,47,