71 氨基酸類藥物的制備

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1、單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),*,*,7.1 氨基酸類藥物的制備,7.2 多肽與蛋白質(zhì)類藥物的制備,7.3 核酸類藥物的制備,7.4 酶類藥物的制備,7.5 糖類藥物的制備,7.6 脂類藥物的制備,第二篇 重要生物藥物制備工藝,1,7.1 氨基酸類藥物的制備,一、氨基酸及其衍生物在醫(yī)藥中的應(yīng)用,氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的根本組成單位，蛋白質(zhì)的生物功能與構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸種類、數(shù)量、排列順序及由其形成的空間構(gòu)象有密切的關(guān)系。,氨基酸通過(guò)體內(nèi)轉(zhuǎn)化而維持其動(dòng)態(tài)平衡，若其動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)，則機(jī)體代謝紊亂，甚至引起病變。必需氨基酸：人及哺乳動(dòng)物自身不能合成，需

2、由食物供給。,氨基酸具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，能治療多種疾病，氨基酸及其衍生物能夠治療消化道疾病、肝病、腦及神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤和其它與氨基酸相關(guān)聯(lián)的疾病。,2,二、氨基酸類藥物的生產(chǎn)方法,1、目前全世界天然氨基酸的年總產(chǎn)量在,百萬(wàn)噸,左右，其中產(chǎn)量較大者有,谷氨酸、蛋氨酸,及,賴氨酸,，其次為,天門冬氨酸、苯丙氨酸,及,胱氨酸,等。它們主要用于,醫(yī)藥、食品、飼料及化工,行業(yè)中。,2、氨基酸的生產(chǎn)方法有天然,蛋白質(zhì)水解法、發(fā)酵法、酶轉(zhuǎn)化法,及,化學(xué)合成法,等四種。,3、氨基酸及其衍生物類藥物已有百種之多，但主要是以20種氨基酸為原料經(jīng),酯化、?；⑷〈?及,成鹽,等化學(xué)方法或酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)。,3,（一）

3、水解法,1、根本原理與過(guò)程,以毛發(fā)、血粉及廢蠶絲等蛋白質(zhì)為原料，通過(guò)酸、堿或酶水解成多種氨基酸混合物，經(jīng)別離純化獲得各種藥用氨基酸的方法稱為水解法。,目前用水解法生產(chǎn)的氨基酸有L-胱氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-組氨酸、L-脯氨酸及L-絲氨酸等。,水解法生產(chǎn)氨基酸的主要過(guò)程為水解、別離和結(jié)晶精制三個(gè)步驟。,4,（1）蛋白質(zhì)水解方法,目前蛋白質(zhì)水解分為酸水解法、堿水解法及酶水解法三種。,酸水解法：蛋白質(zhì)原料用610molL鹽酸或8molL硫酸于110120（回流煮沸）水解1224h，除酸后即得多種氨基酸混合物。此法優(yōu)點(diǎn)是水解迅速而徹底，產(chǎn)物全部為L(zhǎng)-型氨基酸，無(wú)消旋作用。缺點(diǎn)是

4、色氨酸全部被破壞，絲氨酸及酪氨酸局部被破壞，且產(chǎn)生大量廢酸污染環(huán)境。工業(yè)上較普遍采用。,5,堿水解法：蛋白質(zhì)原料經(jīng),6molL氫氧化鈉或4molL氫氧化鋇于100水解6h即得多種氨基酸混合物,。該法,水解迅速而徹底,，且,色氨酸不被破壞,，但,含羥基或巰基,的氨基酸全部被破壞，且,產(chǎn)生消旋作用,。工業(yè)上多不采用。,酶水解法：蛋白質(zhì)原料在一定pH和溫度條件下經(jīng),蛋白水解酶,作用分解成,氨基酸和小肽,的過(guò)程稱為酶水解法。,此法,優(yōu)點(diǎn),為反應(yīng)條件溫和，無(wú)需特殊設(shè)備，氨基酸不破壞，無(wú)消旋作用。,缺點(diǎn),是水解不徹底，產(chǎn)物中除氨基酸外，尚含較多肽類。工業(yè)上,很少用,該法生產(chǎn)氨基酸而主要用于生產(chǎn)水解蛋白及蛋

5、白胨。,6,（2）氨基酸別離方法,氨基酸別離方法較多，通常有溶解度法、等電點(diǎn)沉淀法、特殊試劑沉淀法、吸附法及離子交換法等。,溶解度法：是依據(jù)不同氨基酸在水中或其它溶劑中的溶解度差異而進(jìn)行別離的方法。,胱氨酸和酪氨酸均難溶于水，但在熱水中酪氨酸溶解度較大，而胱氨酸溶解度變化不大，故可將混合物中胱氨酸、酪氨酸及其它氨基酸彼此分開(kāi)。,特殊試劑沉淀法：系采用某些有機(jī)或無(wú)機(jī)試劑與相應(yīng)氨基酸形成不溶性衍生物的別離方法。,7,吸附法：是利用吸附劑對(duì)不同氨基酸吸附力的差異進(jìn)行別離的方法。如顆?；钚蕴繉?duì)苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的吸附力大于對(duì)其它非芳香族氨基酸的吸附力，故可從氨基酸混合液中將上述氨基酸別離出來(lái)。,

6、離子交換法：是利用離子交換劑對(duì)不同氨基酸吸附能力的差異進(jìn)行別離的方法。氨基酸為兩性電解質(zhì)，在特定條件下，不同氨基酸的帶電性質(zhì)及解離狀態(tài)不同，故同一種離子交換劑對(duì)不同氨基酸的吸附力不同。,8,（3）氨基酸的精制方法,別離出的特定氨基酸中常含有少量其它雜質(zhì)，需進(jìn)行精制，常用的有結(jié)晶和重結(jié)晶技術(shù)，也可采用溶解度法或結(jié)晶與溶解度法相結(jié)合的技術(shù)。,丙氨酸在稀乙醇或甲醇中溶解度較小，且pI為6.0，故丙氨酸可在pH6.0時(shí)，用50冷乙醇結(jié)晶或重結(jié)晶加以精制。,溶解度與結(jié)晶技術(shù)相結(jié)合的方法精制氨基酸。如在沸水中苯丙氨酸溶解度大于酪氨酸100倍，若將含少量酪氨酸的苯丙氨酸粗品溶于15倍體積（wv）的熱水中，調(diào)

7、pH4.0左右，經(jīng)脫色過(guò)濾可除去大局部酪氨酸；濾液濃縮至原體積的13，加2倍體積（vv）的95乙醇，4放置，濾取結(jié)晶，用95%乙醇洗滌，烘干即得苯丙氨酸精品。,9,2、用水解法生產(chǎn)氨基酸的品種及工藝,絕大多數(shù)氨基酸均可采用酸水解法生產(chǎn)，但目前由于發(fā)酵方法及酶工程技術(shù)的迅速開(kāi)展，僅有幾種氨基酸仍采用酸水解法生產(chǎn)?，F(xiàn)胱氨酸與亮氨酸生產(chǎn)為例。,L-胱氨酸（L-Cystine，L-Cys2）的制備：,（1）L-胱氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)：以毛、發(fā)及蹄甲等角蛋白中含量最多。其分子由兩分子半胱氨酸脫氫氧化而成，結(jié)構(gòu)為：,10,L-胱氨酸自稀酸中形成六角形或六角柱形晶體，分解點(diǎn)258261，pI為5.05，25D

8、為-232。在25水中溶解度為0.011，在75水中為0.052。溶于無(wú)機(jī)酸及無(wú)機(jī)堿，在熱堿液中可被分解。不溶于乙醇、乙醚及丙酮?？杀粡?fù)原為L(zhǎng)-半胱氨酸。,（2）工藝路線,11,（3）工藝過(guò)程,水解：在1-1.5h內(nèi)升溫至110117水解7h（自100時(shí)計(jì)）后出料,玻璃布過(guò)濾,收集濾液。,中和：用30%工業(yè)堿調(diào)至pH4.8，靜置36h，滌綸布濾取沉淀，離心甩干得L-胱氨酸粗品。,粗制：參加10mol/L鹽酸、水，升溫至6570，攪拌0.5小時(shí)，加活性炭16kg/0.2t粗品，于8090保溫0.5h，濾除活性炭。用30%工業(yè)堿調(diào)濾液至pH4.8，靜置結(jié)晶，吸出上清液后，底部沉淀經(jīng)離心甩干得胱氨酸

9、粗品（）。,12,精制、中和：粗品參加1mol/LHCl，升溫至70，加活性炭1.52.5kg/50kg粗品，85攪拌0.5h，過(guò)濾，加1.5倍體積蒸餾水，升溫至7580，攪拌下用12氨水（化學(xué)純）中和至pH3.54.0，析出結(jié)晶，濾取胱氨酸結(jié)晶，蒸餾水洗至無(wú)氯離子，真空枯燥得L-胱氨酸成品。,檢驗(yàn)與含量測(cè)定：應(yīng)為六角形或六角柱形白色結(jié)晶，含量在98.5以上，枯燥失重小于0.5，熾灼殘?jiān)∮?.2，氯化物小于0.15，鐵鹽小于0.001，重金屬小于20ppm。,作用與用途：L-胱氨酸具有增強(qiáng)造血機(jī)能、升高白細(xì)胞、促進(jìn)皮膚損傷的修復(fù)及抗輻射作用。臨床上用于治療輻射損傷、重金屬中毒、慢性肝炎、牛皮

10、癬及病后或產(chǎn)后繼發(fā)性脫發(fā)。,13,L-亮氨酸（L-Leucine，L-leu）的制備（自學(xué)）,14,(二)發(fā)酵法,1、根本原理與過(guò)程,工業(yè)上，發(fā)酵實(shí)質(zhì)上是利用微生物細(xì)胞中酶的作用，將培養(yǎng)基中有機(jī)物轉(zhuǎn)化為細(xì)胞或其它有機(jī)物的過(guò)程。,利用微生物代謝中間產(chǎn)物參加NH3或HNO3，合成氨基酸。,15,16,初生氨基酸：微生物通過(guò)固氮作用、硝酸復(fù)原及自外界吸收氨使酮酸氨基化成相應(yīng)的氨基酸，或微生物通過(guò)轉(zhuǎn)氨酶作用，將一種氨基酸的氨基轉(zhuǎn)移到另一種酮酸上，生成的新氨基酸也稱為初生氨基酸。,次生氨基酸：在微生物作用下，以初生氨基酸為前體轉(zhuǎn)化成的其它氨基酸。,大多數(shù)氨基酸均可通過(guò)以初生氨基酸為原料的微生物轉(zhuǎn)化作用而

11、產(chǎn)生。,17,18,2、發(fā)酵法生產(chǎn)的氨基酸品種及工藝,微生物利用碳源、氮源及鹽類幾乎可合成所有氨基酸。目前絕大局部氨基酸皆可通過(guò)發(fā)酵法生產(chǎn)，其缺點(diǎn)是產(chǎn)物濃度低，設(shè)備投資大，工藝管理要求嚴(yán)格，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，本錢高。本文僅以L-異亮氨酸直接發(fā)酵法為例，說(shuō)明發(fā)酵法的根本過(guò)程。,19,L-異亮氨酸（L-Isoleucine，L-Ile）的制備,（1）L-異亮氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì),：,L-Ile存在子所有蛋白質(zhì)中，為,人體必需氨基酸,之一，分子式為C,6,H,13,NO,2,，分子量為131.17，結(jié)構(gòu)式為：,20,L-Ile在乙醇中形成,菱形葉片狀,或,片狀,晶體，分解點(diǎn)為285286，L-Ile,溶于熱醋

12、酸,，在20,乙醇,中溶解度為0.072，在25水中為4.12，在75水中為6.08，不溶于乙醚。,（2）工藝路線,21,（3）工藝過(guò)程,菌種培養(yǎng),種子培養(yǎng)基組成（%）為：,葡萄糖 2 尿素 0.3 玉米漿 2.5,豆餅水解液0.1（以干豆餅計(jì)）pH6.5。,二級(jí)種子培養(yǎng)基另加,菜籽油,0.4，其余同一級(jí)種子培養(yǎng)基。,一級(jí)種子培養(yǎng)：1000ml三解瓶中培養(yǎng)基裝量為200ml，接種一環(huán)牛肉膏斜面AS1.998菌種，搖床30培養(yǎng)（沖程7cm，頻率105次min）16h。,二級(jí)種子培養(yǎng)：接種量3.5，培養(yǎng)8h，如此逐級(jí),22,放大培養(yǎng)得足夠量菌種。,滅菌、發(fā)酵,發(fā)酵培養(yǎng)液組成（%）為:,硫酸銨 4.

13、5 豆餅水解液 0.4，玉米漿 2.0,碳酸鈣 4.5 pH7.2，淀粉水解復(fù)原糖初糖濃,度 11.5。,在5m3發(fā)酵罐中添加3噸發(fā)酵培養(yǎng)液，加熱至118120，維持在1.1105Pa壓力，滅菌30min，立即通冰鹽水冷卻至25。接入1菌種（vv），維持180轉(zhuǎn)min的攪拌速度，升溫至3031，以0.2L（minL）通氣量發(fā)酵60h，在2450h之間不斷補(bǔ)加尿素至0.6，氨水至0.27。,23,除菌體、酸化,發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液加熱至100并維持10min，冷卻過(guò)濾，濾液加工業(yè)硫酸和草酸至pH3.5，過(guò)濾除沉淀。,離子交換、吸附別離,上述濾液每分鐘以樹脂量1.5的流速進(jìn)H十-型732離子交換柱（

14、40100cm），以100L去離子水洗柱，再以60、0.5molL氨水按3L/min的流速進(jìn)行洗脫，分部收集洗脫液。,24,濃縮趕氨,合并pH312的洗脫液，7080,減壓蒸餾、濃縮,至粘稠狀，加去離子水至原體積的14，再濃縮至粘稠狀。如此重復(fù)三次。,脫色、濃縮、中和,上述濃縮物加去離子水至原體積的14，攪拌均勻，加2molL,鹽酸調(diào)pH3.5,，加上1（wv）,活性炭,，70攪拌,脫色,1h。濾除活性炭，濾液減壓濃縮至適當(dāng)體積，用2molL,氨水調(diào)pH6.0,，,5沉淀過(guò)夜,過(guò)濾抽干，105烘干得：L-異亮氨酸半成品。,25,精制、烘干,每10kg L-異亮氨酸半成品加8L濃鹽酸和20L去離

15、子水，加熱至80，攪拌溶解，加10kg氯化鈉至飽和，加工業(yè)堿液調(diào)pH10.5，過(guò)濾，濾液用堿調(diào)pH 1.5，5放置過(guò)夜。濾取沉淀，用80L，去離子水加熱至80攪拌溶解，加適量氯化鈉和1%（wv）活性炭，70攪拌脫色lh過(guò)濾，濾液減壓濃縮至適當(dāng)濃度，用氨水調(diào)pH6.0，5放置結(jié)晶過(guò)夜。次日過(guò)濾收集結(jié)晶，抽干，于105烘房中烘干得L-異亮氨酸成品。,（4）檢驗(yàn),應(yīng)為菱形葉片狀或片狀晶體，含量應(yīng)為98.5101.5，枯燥失重不超過(guò)0.3，熾灼殘?jiān)淮笥诤繙y(cè)定與L-亮氨酸的規(guī)定相同。,26,氯化物低于0.05，硫酸鹽低于0.03，鐵鹽低于0.003,重金屬低于0.0015，砷鹽低于1.5ppm。,（

16、5）作用與用途 L-Ile為必需氨基酸，是復(fù)方氨基酸輸液的重要成份之一。,27,（三）酶轉(zhuǎn)化法（自學(xué)）,（四）化學(xué)合成法（自學(xué)）,28,三、氨基酸輸液,氨基酸輸液：多種結(jié)晶L-氨基酸依特定比例混合制成的靜脈內(nèi)輸注液。氨基酸輸液可直接注入血液中，促進(jìn)蛋白質(zhì)、酶及肽類激素的合成，提高血漿蛋白濃度與組織蛋白含量，維持氮平衡，調(diào)節(jié)肌體正常代謝。,現(xiàn)已有含氨基酸數(shù)目為11、14、17、18及20、21種等多種輸液類型，氨基酸濃度分別有3、5、9、10及12等多種規(guī)格。,有些氨基酸輸液還參加山梨醇、木糖、維生素、Na、K、Ca2+或Mg2+等成分，以補(bǔ)充能量，提高氨基酸的利用率及其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，也有些氨基酸輸液與右旋糖酐配伍制成較理想的代血漿。,29,（一）氨基酸輸液的組成與要求,輸入人體的氨基酸,種類、數(shù)量及比例,需符合機(jī)體要求，否則,利用度將下降,，還會(huì)引起,代謝失調(diào)、拮抗及中毒,等代謝并發(fā)癥。,1、組方原理與模式,體內(nèi)蛋白質(zhì)處于,連續(xù)分解與合成的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài),，故氨基酸輸液以被患者的有效利用為度。目前國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)氨基酸輸液組方多,采用人乳、全蛋白、FAO、FA-WHO或血漿游離氨基酸模式,。組方中