致畸胎試驗

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1、 致畸胎試驗 致畸胎試驗2.3.10.1 目的 檢測消毒劑對妊娠實驗動物有無致畸胎性,確定其未觀察到發(fā)育毒性的劑量。2.3.10.2 試劑 (1)1/1000 茜素紅溶液:茜素紅 0.1g,氫氧化鉀 10g,加蒸餾水 1000m1。(2)透明液 A:甘油 200ml,氫氧化鉀 10g,蒸餾水 790ml。(3)透明液 B:甘油與蒸餾水等量混合。(4)固定液(Bouins 液):苦味酸飽和液 75 份,甲醛 20 份,冰醋酸 5 份。2.3.10.3 實驗動物 試驗用大鼠或小鼠(必要時可用家兔)。用大鼠和小鼠試驗時,取健康、性成熟、未交配過的體重為 200g250g 的大鼠,或體重為25g30g

2、 的小鼠。2.3.10.4 試驗分組 至少設 4 組,其中 3 個為試驗組,1 個為陰性對照組。每組至少有 15 只孕鼠。高劑量組可用雌鼠的 1/10LD50作為試驗劑量;低劑量組,可用雌性動物的 1/100LD50作為試驗劑量。其間設中劑量組。陰性對照組以受試物的溶劑代替受試物進行試驗。陽性對照組常用阿司匹林(300mg/kg 體重)、敵枯雙(1mg/kg 體重)或維生素A(40000IU)。對于實驗室首次進行的種或品系必需設陽性對照組。為了保證試驗方法的可靠性,每隔半年需用陽性對照物檢查一次。2.3.10.5 操作程序 (1)將雌鼠和雄鼠按 1:1 或 2:1 的比例同籠飼養(yǎng)。每日晨觀察陰

3、栓(或陰道涂片)。查出陰栓或精子的當天定為孕期零天。如 5d內(nèi)未交配,調(diào)換雌鼠。查出的孕鼠按上述隨機分組,并進行稱重和編號。(2)在大、小鼠孕期 6d15d 期間,每天用灌胃法給予受試物。分別于孕期 0d、6d、10d、15d 和 20d 稱重孕鼠,并根據(jù)體重調(diào)整受試物給予量。注意觀察并記錄孕鼠的毒性反應。(3)大鼠于孕期第 20d,小鼠于孕期第 18d,用頸椎脫臼法處死。剖腹,取出子宮稱重,檢查活胎、吸收胎、早期死胎和晚期死胎數(shù)。(4)逐個記錄活胎鼠的性別、體重、身長和尾長。外觀檢查頭面部、軀干部、四肢等有無畸形,諸如皮下出血、露腦、腦膨出、眼部畸形(無眼或開眼等)、鼻孔擴大、單鼻孔、唇裂、

4、脊柱裂、四肢和尾畸形、肛門閉鎖等。(5)每窩取約 1/22/3 活胎鼠,用眼科鑷剝皮。取出內(nèi)臟(注意勿拉斷肋骨),去掉后頸和兩肩胛骨之間的脂肪塊。將胎鼠放入茜素紅溶液染色。當天搖動玻璃瓶 2 次3 次。待骨骼染成紅色時為止。將胎鼠換入透明液 A 中 1d2d,換入透明液 B 中 2d3d。待胎鼠骨骼已染紅,而軟組織的紫紅色基本褪去,可換置甘油中。(6)將染好的標本連同甘油一并倒入含水平皿內(nèi),在解剖顯微鏡下,用透射光源,先觀察胎鼠全身,然后逐步檢查:頭骨、胸骨、脊椎骨、肋骨和四肢等有無骨化不全、骨化遲緩和其他缺陷。觀察脊椎骨有無缺失、融合、縱裂等畸形;觀察胸骨的發(fā)育和數(shù)目,有無胸骨缺失等;檢查肋

5、骨有無融合肋、分叉肋、肋骨中斷、缺肋、短肋、波狀肋、多肋畸形等;最后檢查四肢骨畸形。(7)每窩取約 1/31/2 活胎鼠浸入固定液 2 周,作內(nèi)臟檢查。將已固定的胎鼠用水沖凈,仰放于石蠟板上。剪去四肢和尾,用刀片在頭頸部常規(guī)共切 4 刀,再用剪刀剖開胸、腹腔。著重檢查:有無裂舌、雙叉舌、裂腭及眼、鼻和腦部的畸形;是否出現(xiàn)右位心、心臟過大、肺過大或過小等畸形;消化系統(tǒng)和泌尿生殖系統(tǒng)各器官的大小、形狀以及位置;有無腎盂積水,雙側(cè)有無睪丸,以及子宮發(fā)育不全等畸形。2.3.10.6 評價規(guī)定 主要觀察動物畸胎出現(xiàn)率,同時觀察其他指標,如著床數(shù)、活胎數(shù)、晚期死胎數(shù)、早期死亡數(shù),以及活胎體重、身長、尾長等。觀察全部結果的劑量-反應關系,確定受試物的母體毒性、發(fā)育毒性及致畸性。求出受試物的最小致畸劑量和最大無致畸作用劑量。對致畸強度應以致畸指數(shù)表示。致畸指數(shù)=(雌鼠 LD50)/(最小致畸劑量)致畸指數(shù)小于或等于 10 為基本不致畸;大于 10 至 100 為致畸;大于100 為強致畸。

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