實驗室常用技術(shù)參數(shù)資料[共31頁]

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1、實驗室常用技術(shù)參數(shù)資料 一、核酸及蛋白質(zhì)常用數(shù)據(jù) 化合物 分子量 λmax(pH7.0) 1摩爾溶液（pH7.0）中λmax時的最大吸收值 OD280/OD260 ATP 507 259 15400 0.15 CTP 483 271 9000 0.97 GTP 523 253 13700 0.66 UTP 484 262 10000 0.38 dATP 494 259 15200 0.15 dCTP 467 271 9300 0.98 dGTP 5

2、07 253 13700 0.66 dTTP 482 267 9600 0.71 2．常用核酸的長度與分子量 核酸 核苷酸數(shù) 分子量 λDNA 48502（雙鏈環(huán)狀） 3.0107 pBR322 4363（雙鏈） 2.8106 28SrRNA 4800 1.6106 23SrRNA 3700 1.2106 18SrRNA 1900 6.1105 19SrRNA 1700 5.5105 5SrRNA 120 3.6104 tRNA（大腸桿菌） 75 2.5104 3．常用核酸蛋白換算數(shù)據(jù) （1）重量換算

3、 1μg=10-6g　　　　　 1pg=10-12g 1ng=10-9g 　　　　　1fg=10-15g （2）分光光度換算： 1A260雙鏈DNA=50μg/ml 1A260單鏈DNA=30μg/ml 1A260單鏈RNA=40μg/ml （3）DNA摩爾換算： 1μg 100bp DNA=1.52pmol=3.03pmol末端 1μg pBR322 DNA=0.36pmol 1pmol 1000bp DNA=0.66μg 1pmol pBR322=2.8μg 1kb雙鏈DNA（鈉鹽）=6.6105道爾頓 1kb單鏈DNA（鈉鹽）=3.3105道爾頓 1kb單鏈R

4、NA（鈉鹽）=3.4105道爾頓 （4）蛋白摩爾換算： 100pmol分子量100，000蛋白質(zhì)=10μg 100pmol分子量50，000蛋白質(zhì)=5μg 100pmol分子量10，000蛋白質(zhì)=1μg 氨基酸的平均分子量=126.7道爾頓 （5）蛋白質(zhì)/DNA換算： 1kb DNA=333 個氨基酸編碼容量=3.7104MW蛋白質(zhì) 10，000MW蛋白質(zhì)=270bp DNA 30，000MW蛋白質(zhì)=810bp DNA 50，000MW蛋白質(zhì)=1.35kb 100，000MW蛋白質(zhì)=2.7kb DNA 4．常用蛋白質(zhì)分子量標準參照物 （1）高分子量標準參照 （2）中

5、分子量標準參照 （3）低分子量標準參照 肌球蛋白 分子量 磷酸化酶B 97，400 碳酸酐酶 31，00 肌球蛋白 212，000 牛血清白蛋白 66，200 大豆脻蛋白酶 21，500 β-半乳糖甘酶B 116，000 谷氨酶脫氫酶 55，000 抑制劑 　 磷酸化酶B 97，400 卵白蛋白 42，700 馬心肌球蛋白 16，900 牛血清白蛋白 66，200 醛縮酶 40，000 溶菌酶 14，400 過氧化氫酶` 57，000 碳酸酐酶 31，000 肌球蛋白（F1） 8，100 醛縮酶 40，000 大豆

6、脻蛋白酶 21，500 肌球蛋白（F2） 6，200 　 　 抑制劑 　 肌球蛋白（F3） 2，500 　 　 溶菌酶 14，400 　 　 5．常用DNA分子量標準參照物 λDNA/HindⅢ λDNA/EcoRⅠ λ/HindⅢ+EcoRⅠ pBR322/HaeⅢ 23130 21226 21227 587 123 9416 7421 5148 405 104 6557 5804 4973 504 89 4361 5643 4268 458 80 2322 4843 3530 434 64 2027

7、 3530 2027 267 57 564 　 1904 234 51 125 　 1584 213 21 　 　 1375 192 18 　 　 974 184 11 　 　 831 124 7 　 　 564 　 　 　 　 125 　 　 續(xù)上表 pBR322/HinfⅠ φχ174/HinfⅠ φχ174/Hae Ⅲ φχ174/TapⅠ 1631 726 140 1353 2914 517 713 118 1078 1175 506 553 100 872 404

8、396 500 82 603 327 344 417 66 310 231 298 413 48 281 141 221 311 42 271 87 220 249 40 234 54 154 200 24 194 33 75 151 　 118 20 　 　 　 72 　 二、常用緩沖液 1．分子克隆常用緩沖液 2．磷酸緩沖液 （1）25℃下0.1mol/L磷酸鉀緩沖液的配制※ pH 1mol/L K2HPO4(ml) 1mol/L KH2PO4(ml) 5.8 8.5 91.5 6.0 1

9、3.2 86.8 6.2 19.2 80.8 6.4 27.8 72.2 6.6 38.1 61.9 6.8 49.7 50.3 7.0 61.5 38.5 7.2 71.7 28.3 7.4 80.2 19.8 7.6 86.6 13.4 7.8 90.8 9.2 8.0 94.0 6.2 （2）25℃下0.1mol/L磷酸鈉緩沖液的配制※ pH 1mol/L Na2HPO4(ml) 1mol/L NaH2PO4(ml) 5.8 7.9 92.1 6.0 12.0 88.0 6.2 17.8 82.2

10、6.4 25.5 74.5 6.6 35.2 64.8 6.8 46.3 53.7 7.0 57.7 42.3 7.2 68.4 31.6 7.4 77.4 22.6 7.6 84.5 15.5 7.8 89.6 10.4 8.0 93.2 6.8 ※:用蒸餾水將混合的兩種1mol/L貯存液稀釋至1000ml，根據(jù)Henderson-Hasselbalch方程計算其pH值： pH=pK’+1g([質(zhì)子受體]/[質(zhì)子供體]) 在此，pK’=6.86(25℃)。 3．電泳緩沖液 測序凝膠加樣緩沖液 98%去離子甲酰胺 10mol/L

11、 EDTA(pH8.0) 0.025%二甲苯青FF 0.025%溴酚藍 甲酰胺：許多批號的試劑級甲酰胺，其純度符合使用要求，無須再進行處理。不過，一旦略呈黃色，則應用在磁力攪拌器上將甲酰胺與Dowex XG8混合床樹脂共同攪拌1小時進行去離子處理，并用Whatman 1號濾紙過濾2次，去離子甲酰胺分裝成小份，充氮存于-70℃。 常用的電泳緩沖液 緩沖液 使用液 濃貯存液（每升） Tris-乙酸（TAE） 1：0.04mol/L Tris-乙酸 50：242g Tris堿 　 0.001mol/L EDTA 57.1ml冰乙酸 　 　 100ml 0.5mol/L

12、 EDTA(pH8.0) Tris-磷酸（TPE） 1:0.09mol/L Tris-磷酸 10:10g Tris堿 　 0.002mol/L EDTA 15.5ml85%磷酸（1.679g/ml） 　 　 40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) Tris-硼酸（TBE）a 0.50.045mol/L Tris-硼酸 5：54g Tris堿 　 0.001mol/L EDTA 27.5硼酸 　 　 20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) 堿性緩沖液b 1:50mmol/L NaOH 1:5ml 10mol/L NaOH 　

13、1mmol/L EDTA 2ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0) Tris-甘氨酸c 1:25mmol/L Tris 5:15.1g Tris 　 250mmol/L 甘氨酸 94g 苷氨酸（電泳級）（pH8.3） 　 0.1% SDS 50ml 10% SDS(電泳級) 說明： ①TBE溶液長時間存放后會形成沉淀物，為避免這一問題，可在室溫下用玻璃瓶保存5溶液，出現(xiàn)沉淀后則予以廢棄。 以片都以1TBE作為使用液（即1：5稀釋濃貯液）進行瓊脂糖凝膠電泳。但0.5的使用液已具備足夠的緩沖容量。目前幾乎所有的瓊脂糖膠電泳都以1：10稀釋的貯存液作為使用液。

14、進行聚丙烯酰胺凝膠垂直槽的緩沖液槽較小， 故通過緩沖液的電流量通常較大，需要使用1TBE以提供足夠的緩沖容量。 ②堿性電泳緩沖液應現(xiàn)用現(xiàn)配。 ③Tris-甘氨酸緩沖液用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。 2SDS凝膠加樣緩沖液： 100mmol/L TrisHCl(6.8) 200mmol/L二硫蘇糖醇（DTT） 4%SDS（電泳級） 0.2%溴酚藍 20%甘油 不含DTT的2SDS凝膠加樣緩沖液可保存于室溫，應在臨用前取1mol/L貯存液現(xiàn)加于上述緩沖液中。 4．凝膠加樣緩沖液 緩沖液類型 6緩沖液 貯存溫度 Ⅰ 0.25%溴酚藍 4℃ 0.25%二甲苯青F

15、F 40%（W/V）蔗糖水溶液 Ⅱ 0.25溴酚藍 室溫 0.25%二甲苯青FF 15%聚蔗糖(Ficoll400) Ⅲ 0.25%溴酚藍 4℃ 0.25%二甲苯青FF 30%甘油水溶液 Ⅳ 0.25%溴酚藍 4℃ 40%(W/V)蔗糖水溶液 　 堿性加樣緩沖液: 　 300mmol/L NaOH 6mmol/L EDTA Ⅴ 18%聚蔗糖(Ficoll400) 4℃ 0.15%溴甲酚綠 0.25%二甲苯青FF 使用以上凝膠加樣緩沖液的目的有三：增大樣品密度；以確保DNA均勻進入樣品孔內(nèi)；使樣品呈現(xiàn)顏色，從而使

16、加樣操作更為便利，含有在電塊中能以可預知速率向陽極泳動的染料。溴酚藍在瓊脂糖中移動的速率約為二甲苯青FF的2.2倍，而與瓊脂糖濃度無關(guān)。以0.5TBF作電泳液時，溴酚藍在瓊脂糖中的泳動速率約與長300bp的雙鏈線狀DNA相同，而二甲苯青FF的泳動則與長4kb的雙鏈線狀DNA相同。在瓊脂糖濃度為0.5%～1.4%的范圍內(nèi)，這些對應關(guān)系受凝膠濃度變化的影響并不顯著。 選用哪一種加樣染料純屬個人喜惡。但是，對于堿性凝膠應當使用溴甲酚綠作為示蹤染料，因為在堿性pH條件下其顯色較溴酚更藍為鮮明。 5．各種pH值的Tris緩沖液的配制 各種pH值的Tris緩沖液的配制　 所需pH值（25℃）

17、0.1mol/L HCl的體積 7．1 45．7 7．2 44．7 7．3 43．4 7．4 42．0 7．5 40．3 7．6 38．5 7．7 36．6 7．8 34．5 7．9 32．0 8．0 29．2 8.1 26.2 8.2 22.9 8.3 19.9 8.4 17.2 8.5 14.7 8.6 12.4 8.7 10.3 8.8 8.5 8.9 7.0 某一特定pH值的0.05mol/L Tris緩沖液的配制：將50ml 0.1mol/L Tris堿溶液與上表所示相應體積（單位：ml）的0.1ml/L

18、HCl混合，加水將體積調(diào)至100ml （2）溫度對50mmol/L TrisHCl液pH值的影響 4℃ 25℃ 37℃ 8．1 7．5 7．2 8．2 7．6 7．3 8．3 7．7 7．4 8．4 7．8 7．5 8．5 7．9 7．6 8．6 8．0 7．7 8．7 8．1 7．8 8．8 8．2 7．9 8．9 8．3 8．0 9．0 8．4 8．1 9．1 8．5 8．2 9．2 8．6 8．3 9．3 8．7 8．4 9．4 8．8 8．5 （6）常用緩沖液的pKa值 緩沖液 分子量

19、pKa值 緩沖范圍 Trisa 12.1 8.08 7.1～7.9 HEPESb 283.3 7.47 7.2～8.2 MPOSc 209.3 7.15 6.6～7.8 PIPESd 304.3 6.76 6.2～7.3 MESe 195.2 6.09 5.4～6.8 a：三羥甲基氨基甲烷；b：N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磷酸；c：3-（N-嗎啉代）丙磺酸；d：N，N’-雙（2-乙磺酸）哌嗪；e：2-（N-嗎啉代）乙磺酸。 7．溫度對常用緩沖液pH的影響 緩沖體系 pKa(20℃) △pKa/10℃ Mes 6.15 -0.110

20、 Ada 6.60 -0.110 PiPes 6.80 -0.085 Aces 6.90 -0.200 Bes 7.15 -0.160 Mops 7.20 -0.013 Tes 7.50 -0.200 Hepes 7.55 -0.014 Tricine 8.15 -0.210 Tris 8.30 -0.310 Bicine 8.35 -0.180 Glycylglycine 8.40 -0.280 三、常用酶的配制 1．溶菌酶 用水配制成50mg/ml的溶菌酶溶液，分裝成小份并保存于-20℃。每一小份一經(jīng)使用后便予丟棄。

21、2．蛋白水解酶類 　 貯存液 貯存溫度 反應濃度 反應緩沖液 溫度 預處理 　 0.01mol/L Tris(pH7.8) 　 鏈霉蛋白酶a 20mg/ml -20℃（溶于水） 1mg/ml 0.01mol/L EDTA 37℃ 自消化b 　 0.5% SDS 　 　 0.01mol/L Tris(pH7.8) 　 蛋白酶Kc 20mg/ml -20℃（溶于水） 50μg/ml 0.005mol/L EDTA 37～56℃ 無須預處理 　 0.5% SDS 　 a：鏈霉蛋白酶是從鏈球菌（Streptomyces griseus

22、）中分離到的一種絲氨酸酶和酸性蛋白酶的混合物。 b：自消化可消除DNA酶和RNA酶的污染，經(jīng)自消化的鏈酶蛋白酶的配制方法如下：把該酶的粉末溶解于10mmol./L TrisHCl(pH7.5)、10mmol/L NaCl中，配成20mg/ml濃度，于37℃溫育1h。經(jīng)消化的鏈霉蛋白酶分裝成小份放在密封試管中，保存-20℃。 c：蛋白酶K是一種枯草蛋白酶類的高活性蛋白酶，從林伯氏白色念球菌（Tritirachium album Limber）中純化得到。該酶有兩個Ca2+結(jié)合位點，它們離酶的活性中心有一定距離，與催化機理并無直接關(guān)系。然而，如果從該酶中除去Ca2+，由于出現(xiàn)遠程的結(jié)構(gòu)變化，催

23、化活性將喪失80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情況下污染酸制品的蛋白質(zhì)。所以，蛋白酶K消化過程中通常加入EDTA（以抑制依賴于Mg2+的核酸酶的作用）。但是，如果要消化對蛋白酶K具有較強耐性的蛋白，如角蛋白一類，則可能需要使用含有1mmol/L Ca2+而不含EDTA的緩沖液。在消化完畢后、純化核酸前要加入EGT（pH8.0）至終濃度為2mmol/L,以鰲合Ca2+。 3．無DNA酶的RNA酶 將胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/L TrisHCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的濃度，于100℃加熱15min，緩慢冷卻至室溫，分裝成小份保

24、存于-20℃。 四、常用抗生素溶液 抗生素 貯存液a 工作濃度 濃度 保存條件 嚴緊型質(zhì)粒 松弛型質(zhì)粒 氨芐青霉素 50mg/ml(溶于水) -20℃ 20μg/ml 60μg/ml 羧芐青霉素 50mg/ml(溶于水) -20℃ 20μg/ml 60μg/ml 氯霉素 34mg/ml(溶于乙醇) -20℃ 25μg/ml 170μg/ml 卡那霉素 10mg/ml(溶于水) -20℃ 10μg/ml 50μg/ml 鏈霉素 10mg/ml(溶于水) -20℃ 10μg/ml 50μg/ml 四環(huán)素b 5mg/ml(溶于

25、乙醇) -20℃ 10μg/ml 50μg/ml a：以水為溶劑的抗生素貯存液通過0.22μm濾器過濾除菌。以乙醇為溶劑的抗生素溶液無須除菌處理。所有抗生素溶液均應放于不透光的容器保存。 b：鎂離子是四環(huán)素的拮抗劑，四環(huán)素抗性菌的篩選應使用不含鎂鹽的培養(yǎng)基（如LB培養(yǎng)基）。 五、常用貯存液的配制 1．30%丙烯酰胺溶液 【配制方法】 將29g丙烯酰胺和1g N，N’-亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為60ml的水中。加熱至37℃溶解之，補加水至終體積為100ml。用Nalgene濾器（0.45μm孔徑）過濾除菌，查證該溶液的pH值應不大于7.0，置棕色瓶中保存于室溫。 【注意】

26、丙烯酰胺具有很強的神經(jīng)毒性并可以通過皮膚吸收，其作用具累積性。稱量丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺時應戴手套和面具?？烧J為聚丙烯酰胺無毒，但也應謹慎操作，因為它還可能會含有少量未聚合材料。 一些價格較低的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺通常含有一些金屬離子，在丙烯酰胺貯存液中加入大約0.2體積的單床混合樹脂（MB-1 Mallinckrodt），攪拌過夜，然后用Whatman 1號濾紙過濾以純化之。 在貯存期間，丙烯酰胺和雙丙烯酰胺會緩慢轉(zhuǎn)化成丙烯酰和雙丙烯酸。 2．40%丙烯酰胺 【配制方法】 把380g丙烯酰胺（DNA測序級）和20g N，N’-亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為600ml的蒸餾水中。繼續(xù)按

27、上述配制30%丙烯酰胺溶液的方法處理，但加熱溶解后應以蒸餾水補足至終體積為1L。 【注意】 見上述配制30%丙烯酰胺的說明，40%丙烯酰胺溶液用于DNA序列測定。 3．放線菌素D溶液 【配制方法】 把20mg放線菌素D溶解于4ml 100%乙醇中，1：10稀釋貯存液，用100%乙醇作空白對照讀取OD440值。放線菌素D（分子量為1255）純品在水溶液中的摩爾消化系數(shù)為21，900，故而1mg/ml的放線菌素D溶液在440nm處的吸光值為0.182，放線菌素D的貯存液應放在包有箔片的試管中，保存于-20℃。 【注意】 放線菌素D是致畸劑和致癌劑，配制該溶液時必須戴手套并在通風櫥內(nèi)操

28、作，而不能在開放在實驗桌面上進行，謹防吸入藥粉或讓其接觸到眼睛或皮膚。 藥廠提供的作治療用途的放線菌素D制品常含有糖或鹽等添加劑。只要通過測量貯存液在440nm波長處的光吸收確定放線菌素D的濃度，這類制品便可用于抑制自身引導作用。 4．0.1mol/L腺苷三磷酸（ATP）溶液 【配制方法】 在0.8ml水中溶解60mg ATP,用0.1mol/L NaOH調(diào)至pH值至7.0，用蒸餾水定容1ml，分裝成小份保存于-70℃ 5．10mol/L乙酸酰溶液 【配制方法】 把770g乙酸酰溶解于800ml水中，加水定容至1L后過濾除菌。 6．10%過硫酸銨溶液 【配制方法】 把1g過

29、硫酸銨溶解于終量為10ml的水溶液中，該溶液可在4℃保存數(shù)周。 7．BCIP溶液 【配制方法】 把0.5g的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二鈉鹽（BCIP）溶解于10ml 100%的二甲基甲酰胺中，保存于4℃ 8．2BES緩沖鹽溶液 【配制方法】 用總體積90ml的蒸餾水溶解1.07g鹽溶液BES[N，N-雙（2-羥乙基）-2-氨基乙磺酸]、1.6g NaCl和0.027g Na2HPO4，室溫下用HCl調(diào)節(jié) 該溶液的pH值至6.96、然后加入蒸餾水定容至100ml，用0.22μm濾器過濾除菌，分裝成小份，保存于-20℃。 9．1mol/L CaCl2溶液 【配制方法】 在20

30、0ml蒸餾水中溶解54g CaCl26H2O，用0.22μm濾器過濾除菌，分裝成10ml小份貯存于-20℃。 【注意】 制備感受態(tài)細胞時，取出一小份解凍并用蒸餾水稀釋至100ml，用Nalgene濾器（0.45μm孔徑）過濾除菌，然后驟冷至0℃。 10．2.5mol/L CaCl2溶液 【配制方法】 在20ml蒸餾水中溶解13.5g CaCl26H2O，用0.22μm濾器過濾除菌，分裝成1ml小份貯存于-20℃。 11．1mol/L二硫蘇糖醇（DTT）溶液 【配制方法】 用20ml 0.01mol/L乙酸鈉溶液（pH5.2）溶解3.09g DTT，過濾除菌后分裝成1ml小份貯存

31、于-20℃。 【注意】 DTT或含有DTT的溶液不能進行高壓處理。 12．脫氧核苷三磷酸（dNTP）溶液 【配制方法】 把每一種dNTP溶解于水至濃度各為100mmol/L左右，用微量移液器吸取0.05mol/L Tris堿分別調(diào)節(jié) 每一dNTP溶液的pH值7.0（用pH試紙檢測），把中和后的每種dNTP溶液各取一份作適當稀釋，在下表中給出的波長下讀取光密度計算出每種dNTP的實際濃度，然后用水稀釋成終濃度為50mmol/L的dNTP，分裝成小份貯存于-70℃。 堿基 波長（nm） 消化系數(shù)（ε）[L/（molcm）] A 259 1.54104 G 253 1.3

32、7104 C 271 9.10103 T 260 7.40103 比色杯光徑為1cm時,吸光度=εM 13．0.5mol/L EDTA(pH8.0)溶液 【配制方法】 在800ml水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2H2O），在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用NaOH調(diào)節(jié) 溶液的pH值至8.0（約需20g NaOH顆粒）然后定容至1L，分裝后高壓滅菌備用。 【注意】 EDTA二鈉鹽需加入NaOH將溶液的pH值調(diào)至接近8.0，才能完全溶解。 14．溴化乙錠（10mg/ml溶液） 【配制方法】 在100ml水中加入1g溴化乙錠，磁力攪拌數(shù)小時以確保其完全

33、溶解，然后用鋁箔包裹容器或轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，保存于室溫。 【注意】 小心：溴化乙錠是強誘變劑并有中度毒性，使用含有這種染料的溶液時務必戴上手套，稱量染料時要戴面罩。 15．2HEPES緩沖鹽溶液 【配制方法】 用總量為90ml的蒸餾水溶解1.6g NaCl、0.074g KCl、0.027g Na2PO42H2O、0.2g葡聚糖和1gHEPES，用0.5mol/L NaOH調(diào)節(jié) pH值至7.05，再用蒸餾水定容至100ml。用0.22μm濾器過濾除菌，分裝成5ml小份，貯存于-20℃。 16．IPTG溶液 【配制方法】 IPTG為異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（分子量為238.3）

34、，在8ml蒸餾水中溶解2g IPTG后，用蒸餾水定容至10ml，用0.22μm濾器過濾除菌，分裝成1ml小份貯存于-20℃。 17．1mol/L乙酸鎂溶液 【配制方法】 在800ml水中溶解214.46g四水乙酸鎂，用水定容至1L過濾除菌。 18．1mol/L MgCl2溶液 【配制方法】 在800ml水中溶解203.4g MgCl26H2O，用水定容至1L，分裝成小份并高壓滅菌備用。 【注意】 MgCl2極易潮解，應選購小瓶（如100g）試劑，啟用新瓶后勿長期存放。 19．β-巰基乙醇（BME）溶液 【配制方法】 一般得到的是14.4mol/L溶液，應裝在棕色瓶中保存于

35、4℃。 【注意】 BME或含有BME的溶液不能高壓處理。 20．NBT溶液 【配制方法】 把0.5g氯化氮藍四唑溶解于10ml 70%的二甲基甲酰胺中，保存于4℃。 21．酚/氯仿溶液 【配制方法】 把酚和氯仿等體積混合后用0.1mol/L TrisHCl(pH7.6)抽提幾次以平衡這一混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆蓋等體積的0.01mol/L TrisHCl(pH7.6)液層，保存于4℃。 【注意】 酚腐蝕性很強，并可引起嚴重灼傷，操作時應戴手套及防護鏡，穿防護服。所有操作均應在化學通風櫥中進行。與酚接觸過的部位皮膚應用大量的水清洗，并用肥皂和水洗滌，忌用乙醇。 22．

36、10mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）溶液 【配制方法】 用異丙醇溶解PMSF成1.74mg/ml（10mmol/L），分裝成小份貯存于-20℃。如有必要可配成濃度高達17.4mg/ml的貯存液（100mmol/L）。 【注意】 PMSF嚴重損害呼吸道粘膜、眼睛及皮膚，吸入、吞進或通過皮膚吸收后有致命危險。一旦眼睛或皮膚接觸了PMSF，應立即用大量水沖洗之。凡被PMSF污染的衣物應予丟棄。 PMSF在水溶液中不穩(wěn)定。應在使用前從貯存液中現(xiàn)用現(xiàn)加于裂解緩沖液中。PMSF在水溶液中的活性喪失速率隨pH值的升高而加快，且25℃的失活速率高于4℃。pH值為8.0時，20μmmol/L PM

37、SF水溶液的半壽期大約為85min，這表明將PMSF溶液調(diào)節(jié) 為堿性（pH>8.6）并在室溫放置數(shù)小時后，可安全地予以丟棄。 23．磷酸鹽緩沖溶液（PBS）溶液 【配制方法】 在800ml蒸餾水中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,用HCl調(diào)節(jié) 溶液的pH值至7.4加水定容至1L，在15lbf/in2(1034105Pa)高壓下蒸氣滅菌20min。保存于室溫。 24．1mol/L乙酸鉀（pH7.5）溶液 【配制方法】 將9.82g乙酸鉀溶解于90ml純水中，用2mol/L乙酸調(diào)節(jié) pH值至7.5后加入純水定容到1L，保存于-2

38、0℃。 25．乙酸鉀溶液（用于堿裂解） 【配制方法】 在60ml 5mol/L乙酸鉀溶液中加入11.5ml冰乙酸和28.5ml水，即成鉀濃度為3mol/L而乙酸根濃度為5mol/L的溶液。 26．3mol/L乙酸鈉（pH5.2和pH7.0）溶液 【配制方法】 在80ml水中溶解408.1g三水乙酸鈉，用冰乙酸調(diào)節(jié) pH值至5.2或用稀乙酸調(diào)節(jié) pH值至7.0，加水定容到1L，分裝后高壓滅菌。 27．5mol/L NaCl溶液 【配制方法】 在800ml水中溶解292.2g NaCl加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。 28．10%十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液 【配制方法】

39、在900ml水中溶解100g電泳級SDS，加熱至68℃助溶，加入幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié) 溶液的pH值至7.2，加水定容至1L，分裝備用。 【注意】 SDS的微細晶粒易擴散，因此稱量時要戴面罩，稱量完畢后要清除殘留在稱量工作區(qū)和天平上的SDS，10% SDS溶液無須滅菌。 29．20SSC溶液 【配制方法】 在800ml水中溶解175.3g NaCl和88.2g檸檬酸鈉，加入數(shù)滴10mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié) pH值至7.0，加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。 30．20SSPE溶液 【配制方法】 在800ml水中溶解17.5g NaCl、27.6g NaH2PO4H2O和7.4g ED

40、TA，用NaOH溶液調(diào)節(jié) pH值至7.4（約需6.5ml 10ml/L NaOH），加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。 31．100%三氯乙酸溶液 【配制方法】 在裝有500g TCA的瓶中加入227ml水，形成的溶液含有100%（M/V）TCA。 32．1mol/L Tris溶液 【配制方法】 在800ml水中溶解121.91g Tris堿，加入濃HCl調(diào)節(jié) pH值至所需值。 pH　　　HCl 7.4　　 70ml 7.6 　　60ml 8.0　　 42ml 應使溶液冷至室溫后方可最后調(diào)定pH值，加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。 【注意】 如1mol/L溶液呈現(xiàn)黃色，

41、應予丟棄并置備質(zhì)量更好的Tris。 盡管多種類型的電極均不能準確測量Tris溶液的pH值，但仍可向大多數(shù)廠商購得合適的電極。 Tris溶液的pH值因溫度而異，溫度每升高1℃，pH值大約降低0.03個單位。例如：0.05mol/L的溶液在5℃、25℃、和37℃時的pH值分別為9.5、8.9和8.6。 33．Tris緩沖鹽溶液（TBS）（25mmol/L Tris） 【配制方法】 在800ml蒸餾水中溶解8g NaCl、0.2g KCl和3g Tris堿，加入0.015g酚并用HCl調(diào)至pH值至7.4，用蒸餾水定容至1L，分裝后在151bf/in2(1.034105Pa)高壓下蒸汽滅菌2

42、0min，于室溫保存。 34．X-gal溶液 【配制方法】 X-gal為5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷。用二基甲酰胺溶解X-gal配制成的20mg/ml的貯存液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中，裝有X-gal溶液的試管須用鋁箔封裹以防因受光照而被破壞，并應貯存于-20℃。X-gal溶液無須過濾除菌。 雜交試驗中用于降低背景的封閉劑 試劑 用途 Denhardt試劑 Northern雜交 使用RNA探針的雜交 單拷貝序列的Southern雜交 將DNA固定于尼龍膜上的雜交 Denhardt試劑通常配制50貯存液，過濾后保存于-20℃?？蓪⒃撡A存液10倍稀釋于預雜交液

43、（常為含有0.5%SDS和100μg/ml經(jīng)變性被打斷的鮭精DNA的6SSC或6SSPE）中。50Denhardt液中含5g聚蔗糖（Ficoll,400型，Pharmacia）、5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白（組分V”Sigmal），加水至終體積為500ml。 BLOTTO Grunstein-Hogness雜交 Benton-Davis雜交 除單拷貝序列Southern雜交以外的所有Southern雜交 斑點印跡 1BLOTT（牛乳轉(zhuǎn)移技術(shù)優(yōu)化液，Bovine Lacto Transfer Technique Optimizer）,是含5%膠脂奶粉和0.02%疊氮鈉的水溶液

44、，應保存于4℃。使用前可用預雜交液稀釋25倍。BLOTTO不應與高濃度的SDS并用，因為后者會導致牛奶中蛋白質(zhì)析出。如果雜交背景不合要求，可在雜交液中加入NP-40至終濃度為1%。BLOTTO不能用作Northern雜交的封閉劑，因為這一封閉劑中可能含有RNA酶，其活性之高使人無法接受。 注意：疊氮鈉有毒性，取用時需戴手套小心操作。含疊氮鈉的溶液應予明確標記。 肝素 Southern雜交 原位雜交 肝素（Sigma H-7005，從豬中提取的二級產(chǎn)品或相當?shù)燃壍漠a(chǎn)品）用4SSPE或4SSC溶解配制成50mg/ml的濃度，保存于4℃。肝素在含有葡聚糖硫酸酯的雜交液中用作封閉劑的濃度為5

45、00μg/ml，在不含葡聚糖硫酸酯的雜交液中的濃度為50μg/ml。 經(jīng)變性并被打斷的鮭精DNA southern和Northern雜交 把鮭魚精子DNA（Sigma,Ⅲ,鹽鈉）溶解于水配制成10mg/ml的濃度，必要時于室溫磁力攪拌2～4h助溶。把溶液中NaCl的濃度調(diào)至0.1mol/L，并用酚和酚/氯仿各抽提一次，回收水相。合DNA溶液快速通17號皮下注射針頭12次，以剪切DNA。加入2倍體積用冰預冷的乙醇沉淀DNA。離心回收DNA并重溶于水，配制成10mg/ml的濃度，測定溶液的OD260值并計算出精確的DNA濃度，然后煮沸10min，分裝成小份保存于-20℃。使用前置沸水浴中加熱

46、5min，然后迅速在冰浴中驟冷。預雜交液中應含有100μg/ml經(jīng)變性并被打斷的鮭魚精子DNA 六、常用凝膠的技術(shù)參數(shù) 1．葡聚糖凝膠的某些技術(shù)數(shù)據(jù) 種類 干顆粒直徑（μ） 分子量分級范圍 床體積毫升/克干分子篩 得水值 溶脹最少平衡時間（h） 柱頭壓力（kPa）(2.5cm直徑柱) 肽及球形蛋白質(zhì) 葡聚糖（線性分子） 室溫 沸水浴 Sephadex G-10 40～ 120 ～700 ～700 2～ 3 1.00.1 3 1 　 Sephadex G-10 40～ 120 ～1500 1500

47、 2.5～3.5 1.53.5 3 1 　 Sephadex G-25 　 　 　 　 　 　 　 　 粗級 100～300 (≈5～100目) 　 　 　 　 　 　 　 中級 50～150 (≈100～200目) 1,000～ 5,000 100～ 5,000 4～6 1.50.2 6 2 細級 20～800(≈200～400目) 　 　 　 　 　 　 　 超細 10～40 　 　 　 　 　 　 　 Sephadex

48、 G-50 　 　 　 　 　 　 　 　 粗級 100～200 　 　 　 　 　 　 　 中級 50～150 1,500～ 500～ 　 　 　 　 　 細級 20～80 30,000 10,000 9～11 5.00.3 6 2 超細 10～40 　 　 　 　 　 　 　 Sephadex G-75 　 　 　 　 　 　 　 　 　 40～120 3,000～ 1,000～ 　 　 　 　 　 超細 10～40 70,000 950,000 12～1

49、5 7.50.5 24 3 3.92～15.86 Sephadex G-100 　 　 　 　 　 　 　 　 　 40～120 4,000～ 1,000～ 　 　 　 　 　 超細 10～40 1,500,000 150,000 15～20 10.01.0 48 5 2.35～9.41 Sephadex G-150 　 　 　 　 　 　 　 　 　 40～120 5,000～ 1,000～ 20～30 　 　 　 　 超細 10～40 400,000 150,000 18～22 1

50、5.01.5 72 5 0.88～3.53 Sephadex G-200 　 　 　 　 　 　 　 　 　 40～120 5000～ 1000～ 30～40 　 　 　 　 　 10～40 800,000 200,000 20～25 20.02.0 72 5 0.39～1.57 2.聚丙烯酰胺凝膠的技術(shù)數(shù)據(jù) 型號 排阻的下限 (分子量) 分級分離范圍 (分子量) 膨脹后的床體積(ml/g干凝膠) 膨脹所需最少時間(室溫,h) Bio-gel-P-2 1,600 200～2,000 3.8 2～4 Bio-

51、gel-P-4 3,600 500～4,000 5.8 2～4 Bio-gel-P-6 4,600 1,000～5,000 8.8 2～4 Bio-gel-P-10 10,000 5,000～17,000 12.4 2～4 Bio-gel-P-30 30,000 20,000～50,000 14.9 10～12 Bio-gel-P-60 60,000 30,000～70,000 19.0 10～12 Bio-gel-P-100 100,000 40,000～100,000 19.0 24 Bio-gel-P-150 150,000

52、 50,000~150,000 24.0 24 Bio-gel-P-200 200,000 80,000～200,000 34.0 48 Bio-gel-P-300 300,000 100～400,000 40.0 48 3．瓊脂糖凝膠的技術(shù)數(shù)據(jù) 型號 瓊脂糖含量 %（W/W） 排阻的下限 （分子量） 分級分離的范圍（分子量） 生產(chǎn)廠家 Sepharose 4B 4 　 0.3106～3106 Pharmacia Sepharose 2B 2 　 2106～25106 Sagavac 10 10 2.5105 1104～2.51

53、05 Seravac Sagavac 8 8 7105 2.5104～7105 Sagavac 6 6 2106 5104～2106 Sagavac 4 4 15106 2105～15106 Sagavac 2 2 150106 5105～15107 Bio-gel A-0.5M 10 0.5106 <1104～0.5106 Bio-Rad Bio-gel A-1.5M 8 1.5106 <1104～1.5106 Bio-gel A-5M 6 5106 1104～5106 Bio-gel A-15M 4 15

54、106 4104～15106 Bio-gel A-50M 2 50106 1105～50106 Bio-gel A-150M 1 150106 1106～150106 4．各處凝膠所允許的最大操作壓 凝膠 最大靜水壓（kPa） Sephadex 　 G-10 9.8 G-15 9.8 G-25 9.8 G-50 9.8 G-75 4.9 5．瓊脂糖凝膠濃度與線性DNA分辨范圍 凝膠濃度（%） 線性DNA長度（bp） 0.5 1000～30000 0.7 800～12000 1.0 500～10000 1.2 400～7000

55、 1.5 200～3000 2.0 50～2000 6．染料在變性聚丙烯酰胺凝膠中的遷移速度 凝膠濃度（%） 溴酚藍 二甲苯青FF 5．0 35bp 140bp 6．0 26bp 106bp 8．0 19bp 75bp 10．0 12bp 55bp 20．0 8bp 28bp 7．染料在非變性聚丙烯酰胺凝膠中的遷移速度 凝膠濃度（%） 溴酚藍 二甲苯青FF 3.5 100bp 460bp 5.0 65bp 260bp 8.0 45bp 160bp 12.0 20bp 70bp 15.0 15bp 50bp 2

56、0.0 12bp 45bp 七、氨基酸的特性 氨基酸名稱 三字母縮寫 單字母縮寫 質(zhì)量 側(cè)鏈電離的pHa值 丙氨酸（alanine） Ala A 89.09 　 精氨酸（arginine） Arg R 174.2 12.48 天冬酰氨（asparagine） Asn N 132.1 　 天冬氨酸（aspartic acid） Asp D 133.1 3.86 半胱氨酸（systeine） Cys C 121.12 　 谷氨酰胺（glutamine） Gln Q

57、146.15 　 谷氨酸（glutamic acid） Glu E 147.13 4.25 甘氨酸（glycine） Gly G 75.07 　 組氨酸（histidine） His H 155.16 6.0 異亮氨酸（isoleucine） lle I 131.17 　 亮氨酸（leucine） Leu L 131.17 　 賴氨酸（lycine） Lys K 146.19 　 甲硫氨酸（methionine） Met M 149.21 　 苯丙氨酸（phe

58、nylanaline） Phe P 165.19 　 脯氨酸（proline） Pro P 115.13 　 絲氨酸（serine） Ser S 105.06 　 蘇氨酸(threonine) Thr T 119.12 　 色氨酸（tryptophan） Trp W 204.22 　 酪氨酸（tyrosine） Tyr Y 181.19 10.07 纈氨酸（valine） Val P 117.15 　 八、遺傳密碼 密碼子的第二位 密碼子的第一位（5’端） 　

59、 U C A G 　 密碼子的第三位（3端’） U UUU Phe UCU Ser UAU Tyr UGU Gys U UUC Phe UCC Ser UAC Tyr UGG Gys C UUA Leu UCA Ser UAA 終止（赭石） UGA 終止（乳白） A UUG Leu UGG Ser UAG 終止（琥珀） UGG Trp G C CUU Leu CCU Pro CAU His CGA Arg U CUC Leu CCC Pro CAC His CGC A

60、rg C CUA Leu CCA Pro CAA Gln CGA Arg A CUG Leu CCG Pro CAG Gln CGC Arg G A AUU Ile ACU Thr AAU Asn AGU Ser U AUC Ile ACC Thr AAC Asn AGC Ser C AUA Ile ACA Thr AAA Lys AGA Arg A AUG Met ACG Thr AAG Lys AGC Arg G G GUU Val GCU Ala GAU

61、Asp GGU Gly U GUC Val GCC Ala GAC Asp GGC Gly C GUA Val GCA Ala GAA Glu GGA Gly A GUG Val GCG Ala GAG Glu GGG Gly G 九、常用酸堿技術(shù)參數(shù) 1．常見的市售酸堿的濃度 溶質(zhì) 分子式 分子量 mol/L g/L 重量（%） 比重 配制mol/L溶液的加入量（ml/L） 冰乙酸 CH3COOH 60.05 17.40 1045 99.5 1.050 57.5 乙酸 　 60.05 6.

62、27 376 36 1.045 159.5 甲酸 HCOOH 46.02 23.40 1080 90 1.200 42.7 鹽酸 HCl 36.50 11.60 424 36 1.180 86.2 　 　 　 2.90 105 10 1.050 344.8 硝酸 HNO3 63.02 15.99 1008 71 1.420 62.5 　 　 　 14.90 938 67 1.400 67.1 　 　 　 13.30 837 61 1.370 75.2 高氯酸 HclO3 100.50

63、 11.65 1172 70 1.670 85.8 　 　 　 9.20 923 60 1.540 108.7 磷酸 H2PO4 80.00 18.10 1445 85 1.700 55.2 硫酸 H2P｀O4 98.10 18.00 1776 96 1.840 55.6 氫氧化銨 NH4OH 35.00 14.80 251 28 0.898 67.6 氫氧化鉀 KOH 56.10 13.50 757 50 1.520 74.1 　 　 　 1.94 109 10 1.090 515.5

64、氫氧化鈉 NaOH 40.00 19.10 763 50 1.530 52.4 　 　 　 2.75 111 10 1.110 363.4 2．各種濃度的酸堿貯存液的近似pH值 溶質(zhì) 1Na 0.1Na 0.01Na 0.001Na 乙酸 0.40 2.90 3.40 3.90 鹽酸 0.10 1.07 2.02 3.01 硫酸 0.30 1.20 2.10 　 檸檬酸 　 2.10 2.60 　 氫氧化銨 11.80 11.30 10.80 10.30 氫氧化鈉 14.05 13.07 12.12 11.13 碳酸氫鈉 　 8.40 　 　 碳酸鈉 　 11.50 11.00 　 J a.N為光量濃度[1N≈（1mol/L）離子價數(shù)]。