實(shí)驗(yàn)指導(dǎo) - 生物技術(shù)大實(shí)驗(yàn)

《實(shí)驗(yàn)指導(dǎo) - 生物技術(shù)大實(shí)驗(yàn)》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《實(shí)驗(yàn)指導(dǎo) - 生物技術(shù)大實(shí)驗(yàn)（13頁(yè)珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、0.1 mol/L CaCl2 （滅菌）、無(wú)菌水、冰、LB液體培養(yǎng)基（胰蛋白胨、酵母粉）、氨芐青霉素（Amp）、溫控?fù)u床。 四、儀器耗材. 控溫?fù)u床(37℃)、冷凍離心機(jī)、水浴鍋、 ...* 生物技術(shù)大實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 一、 質(zhì)粒DNA的提取 二、 質(zhì)粒DNA的檢測(cè) 三、 DNA重組技術(shù)－酶切、連接 四、 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化 五、 重組質(zhì)粒的篩選 實(shí)驗(yàn)一、質(zhì)粒DNA的提取 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 通過(guò)本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)和掌握堿裂解法提取質(zhì)粒。 二、實(shí)驗(yàn)原

2、理 堿裂解法提取質(zhì)粒是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來(lái)分離它們。在pH值介于12.0～12.5這個(gè)狹窄的范圍內(nèi)，線性的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性，盡管在這樣的條件下，共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵會(huì)被斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此相互纏繞，仍會(huì)緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復(fù)pH 至中性時(shí)，共價(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條互補(bǔ)鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，而線性的染色體DNA的兩條互補(bǔ)鏈彼此已完全分開，復(fù)性就不會(huì)那木迅速而準(zhǔn)確，它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA，蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去。 三、

3、主要試劑 1． 溶液Ⅰ 50 mmol/L 葡萄糖 5 mmol/L 三羥甲基氨基甲烷（Tris）Tris.HCl(pH 8.0) 10 mmol/L 乙二胺四乙酸Na（EDTA）（pH 8.0） [0.5 M EDTA：93.05g EDTA.Na2，8g NaOH，充分溶解后調(diào)pH值至8.0] （滅菌）。 [1M Tris-HCl（1000 mL）：121.1g Tris，49 mL濃HCl，充分溶解后調(diào)pH值至8.0]（滅菌） 2． 溶液 Ⅱ 0.4 mol/L NaOH， 2% SDS，用前等體積混合（新鮮配制） 3． 溶液 Ⅲ 5 mol/L 乙

4、酸鉀 60 ml 冰乙酸 11.5 ml 水 28.5 ml 4. TE 緩沖液 10 mmol/L Tris.HCl 1 mmol/L EDTA(pH 8.0) 5. 70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回） 6. RNase 將RNA酶溶于10 mmol/L Tris.HCl(pH7.5)、15 mmol/L NaCl中，配成 10 mg／ml的濃度，于100℃加熱15min，緩慢冷卻至室溫，保存于－20℃。 7. LB+Amp100培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基內(nèi)加入100ug/mL的氨芐青霉素。注意Amp遇高溫分解，

5、待培養(yǎng)基溫度低于60℃時(shí)加入。 四、儀器耗材 恒溫?fù)u床、冷凍離心機(jī)、移液槍一套、制冰機(jī)、三角瓶、Eppendorf管、試管、培養(yǎng)皿、試劑瓶、超凈工作臺(tái)。 五、實(shí)驗(yàn)步驟 （一）細(xì)菌的培養(yǎng) 將含有pUC19質(zhì)粒的大腸桿菌，在LB+Amp100培養(yǎng)基平皿上劃線，獲得單菌落。（37℃培養(yǎng)過(guò)夜） (二) 質(zhì)粒提取 1. 將2 mL含Amp（100ug/mL）的LB液體培養(yǎng)基加入試管中，接入上述的含pUC19質(zhì)粒的大腸桿菌（單菌落），37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。 2. 取培養(yǎng)物倒入1.5 mL微量離心管中，4000 r/min 離心2 min。 3. 倒出培養(yǎng)液，使細(xì)胞沉淀盡可能干燥。

6、 4. 將細(xì)菌沉淀懸浮于100 uL溶液Ⅰ中，充分振蕩混勻，室溫放置5 min。 5. 加200 uL溶液 Ⅱ（新鮮配制），蓋緊管口，顛倒混勻內(nèi)容物，將離心管放冰上 5 min 。 6. 加入150 uL溶液 Ⅲ（冰上預(yù)冷），蓋緊管口，顛倒數(shù)次使混勻。冰上放置 5 min 。 7. 12000 r/min ，離心15 min ，將上清轉(zhuǎn)至另一離心管中。 8. 向上清中加入等體積氯仿/異戊醇（24:1）（去蛋白），反復(fù)混勻，10000 r/min，離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。 9. 向上清加入2倍體積乙醇，混勻后，室溫放置15～20min。12000r/min離

7、心 10 min。倒去上清液，把離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體。 10. 用500 μL 70% 乙醇洗滌質(zhì)粒DNA沉淀，振蕩并離心，倒去上清液，真空抽干或空氣中干燥。 11. 加入適量（30 μL）的TE其中含有20 ug/ml的RNA酶，使DNA完全溶解， －20℃保存。 實(shí)驗(yàn)二、質(zhì)粒DNA的檢測(cè) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 通過(guò)本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的方法和技術(shù)。 二、實(shí)驗(yàn)原理 DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于糖－磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，

8、因此他們能以相同的速度向正極方向移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段泳動(dòng)速度不一樣，可進(jìn)行分離。DNA分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳不僅可以分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNA， 也可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子。如上次實(shí)驗(yàn)提取的pUC19質(zhì)粒，有3種構(gòu)型：超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA(covalently closed circular DNA，簡(jiǎn)稱 CCCDNA)；開環(huán)質(zhì)粒DNA，即共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA 1條鏈斷裂，（open circular DNA， 簡(jiǎn)稱O

9、CDNA）；線狀質(zhì)粒DNA ，即共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA 2條鏈發(fā)生斷裂，（linear DNA，簡(jiǎn)稱L DNA）。這3種構(gòu)型的質(zhì)粒DNA分子在凝膠電泳中的遷移率不同。因此電泳后呈3條帶，超螺旋質(zhì)粒DNA泳動(dòng)最快，其次為線狀DNA和開環(huán)質(zhì)粒DNA。 三、主要試劑 1. 10 x TAE (10倍體積的TAE儲(chǔ)存液) 配 1000mL50 x TAE： Tris 242g 冰乙酸 57.1ml 0.5 mol/L EDTA 100 ml pH 8.0 2. 凝膠加樣緩沖液（6x） 溴酚藍(lán)

10、 0.25％ 蔗糖 40％ 3. 瓊脂糖（1%）：稱1g瓊脂糖，放入250 mL三角瓶?jī)?nèi)，加入100 mL 1×TAE電泳緩沖液，加熱煮沸等其冷至60℃左右，倒入封好的電泳板上。 4. 溴化乙錠溶液 (EB) 0.5 μg /mL。 四、儀器耗材 電泳儀、電泳槽、凝膠成像儀、移液槍一套、微波爐。 五、實(shí)驗(yàn)步驟 (一) 制備瓊脂糖凝膠 按照被分離DNA的大小，決定凝膠中瓊脂糖的百分含量?？蓞⒄障卤恚? 瓊脂糖凝膠濃度／％ 線狀DNA的有效分離范圍／Kb 0.3 5

11、 ～60 0.6 1 ～20 0.7 0.8～10 0.9 0.5～7 1.2 0.4 ～6 1.5 0.2～4 2.0 0.1～3 稱取0.1g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入10mL 1XTAE緩沖液，至微波爐加熱至完全溶化，取出搖勻，則為1％的瓊脂糖凝膠液。 （二）膠板的制備 1. 取有機(jī)玻璃內(nèi)槽，洗

12、凈，晾干，用橡皮膏將有機(jī)玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣封好。 2. 將有機(jī)玻璃內(nèi)槽放置于一水平位置，并放好樣品梳子。 3. 將冷到60℃左右的瓊脂糖凝膠液，緩緩倒入有機(jī)玻璃內(nèi)槽，直至有機(jī)玻璃板上形成一層均勻的膠面（注意不要形成氣泡）。 4. 待膠凝固后，取出梳子，放在電泳槽內(nèi)。 5. 加入電泳緩沖液至電泳槽中。 （三）加樣 將樣品5uL與上樣緩沖液1uL混合，用移液槍將該混合樣品加入樣品孔（記錄點(diǎn)樣順序及點(diǎn)樣量）。同時(shí)加入DNA marker和購(gòu)買的pUC18質(zhì)粒作為對(duì)照。 （四）電泳 1. 接通電泳槽與電泳儀的電源（注意正負(fù)極，DNA片段從負(fù)極向正極移動(dòng)）。DNA的遷移速度與電壓成正

13、比，最高電壓不超過(guò)5 V/cm。 2. 當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動(dòng)到距凝膠前沿1～2cm處，停止電泳。 （五）染色 將電泳后的凝膠浸入溴化乙錠染色液（0.5mg/mL）中，染色以觀察在瓊脂糖凝膠中的帶（戴手套操作）。 (六) 觀察 六、注意事項(xiàng) 1．EB是強(qiáng)誘變劑并有中等毒性,配制和使用時(shí)都應(yīng)戴手套,并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗或丟棄。 2．. }" `6 e/ X2 i6 k: Y8 a$ j當(dāng)EB太多，膠染色過(guò)深,DNA帶看不清時(shí)，可將膠放入蒸餾水沖泡，30分鐘后再觀察。 3．電泳時(shí)注意導(dǎo)線正負(fù)極，防止接反。 思考題： 1.

14、 如果一個(gè)DNA 酶解液在電泳后發(fā)現(xiàn)DNA 未被切動(dòng)，你認(rèn)為可能是什么原因？ 2. 瓊脂糖凝膠電泳中DNA 分子遷移率受哪些因素的影響？' |, ~??e( [5 [) ?1 ^. w+ q 附：? 質(zhì)粒提取及檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 1. 質(zhì)粒沉淀離心后，在管底能見(jiàn)到少量白色物質(zhì)。 2. 真空干燥后，無(wú)色，貼于管壁。 3. 加ddH2O或TE能迅速溶解。 4. 電泳凝膠上呈現(xiàn)一條亮帶。 5. 如果質(zhì)粒提取中降解，則會(huì)出現(xiàn)上下三條帶，分別代表超螺旋、帶切口和帶切刻的質(zhì)粒。 6. 溶解時(shí)不加RNase，則下部會(huì)有很亮的一片，為小分子RNA片段。 7. 質(zhì)粒中含太多雜質(zhì)，則干燥后會(huì)

15、呈白色或褐色，不易溶解。 8. 電泳時(shí)，吸取可溶的部分，勿取沉淀。 實(shí)驗(yàn)三、DNA重組技術(shù)－酶切、連接 （一）酶切 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 通過(guò)酶切獲得可進(jìn)行體外重組的載體和外源DNA。 二、實(shí)驗(yàn)原理 DNA重組技術(shù)是用內(nèi)切酶分別將載體和外源DNA切開，經(jīng)分離純化后，用鏈接酶將其連接，構(gòu)成新的DNA分子。 限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上，并切割雙鏈DNA。它可分為三類:Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴于ATP的存在。Ⅱ類酶結(jié)合于識(shí)別位點(diǎn)并隨機(jī)的切割識(shí)別位點(diǎn)不遠(yuǎn)處的DNA，而Ⅱ類酶在識(shí)別位點(diǎn)上切割DN

16、A分子，然后從底物上解離。Ⅱ類由兩種酶組成: 一種為限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)，它切割某一特異的核苷酸序列; 另一種為獨(dú)立的甲基化酶，它修飾同一識(shí)別序列。Ⅱ類中的限制性內(nèi)切酶在分子克隆中得到了廣泛應(yīng)用，它們是重組DNA的基礎(chǔ)。絕大多數(shù)Ⅱ類限制酶識(shí)別長(zhǎng)度為4至6個(gè)核苷酸的回文對(duì)稱特異核苷酸序列(如EcoRⅠ識(shí)別六個(gè)核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3')，有少數(shù)酶識(shí)別更長(zhǎng)的序列或簡(jiǎn)并序列。Ⅱ類酶切割位點(diǎn)在識(shí)別序列中，有的在對(duì)稱軸處切割，產(chǎn)生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位點(diǎn)在對(duì)稱軸一側(cè)，產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性未端， 如EcoRⅠ切割識(shí)別序

17、列后產(chǎn)生兩個(gè)互補(bǔ)的粘性末端。 　　5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3' 　　3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5' 限制性內(nèi)切酶的酶解反應(yīng)最適條件各不相同，各種酶有其相應(yīng)的酶切緩沖液和最適反應(yīng)溫度(大多數(shù)為37℃)。對(duì)質(zhì)粒DNA酶切反應(yīng)而言， 限制性內(nèi)切酶用量可按標(biāo)準(zhǔn)體系1μg DNA加1單位酶，消化1-2小時(shí)。但要完全酶解則必須增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反應(yīng)時(shí)間也要適當(dāng)延長(zhǎng)。 酶活力通常用酶單位（U）表示，酶單位的定義是：在最適反應(yīng)條件下，1小時(shí)完全降解1mg λDNA的酶量為一個(gè)單位，但是許多實(shí)驗(yàn)制備的DNA不象λDNA那

18、樣易于降解，需適當(dāng)增加酶的使用量。反應(yīng)液中加入過(guò)量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質(zhì)可能干擾隨后的反應(yīng)。 三、主要試劑 λ DNA、EcoR I、質(zhì)粒（pUC19）、無(wú)菌水、70％，100％酒精、3Mol/L KAc(pH5.2)、 ice、瓊脂糖、溴酚藍(lán)、TE 、TAE、EB、DNA marker. 四、儀器耗材 水浴鍋(37℃)、滅菌鍋、離心機(jī)、電泳儀、電泳槽、凝膠成像儀、移液槍一套、微波爐。 五、酶切反應(yīng) DNA純度、緩沖液、溫度條件及限制性內(nèi)切酶本身都會(huì)影響限制性內(nèi)切酶的活性。大部分限制性內(nèi)切酶不受RNA或單鏈DNA的影響。當(dāng)微量的污染物

19、進(jìn)入限制性內(nèi)切酶貯存液中時(shí)，會(huì)影響其進(jìn)一步使用，因此在吸取限制性內(nèi)切酶時(shí)，每次都要用新的吸管頭。 反應(yīng)體系 1. PUC 4ul (0.5ug/ul) buffer 1ul EcoR1 1ul (15U/ul) H2O 4ul --------------------------- Total 10ul 反應(yīng)體系 2. λDN

20、A 4ul (1.5ug/ul，0.4ug/ul) bf 1ul EcoR1 1ul H2O 4ul ---------------------- Total 10ul 37℃，2hr；終止反應(yīng) 65℃ 10min。 六、注意事項(xiàng) 1、 限制性內(nèi)切酶一旦拿出冰箱后應(yīng)當(dāng)立即置于冰上。酶應(yīng)當(dāng)是最后一個(gè)被加入到反應(yīng)體系中（在加入酶之前

21、所有的其它反應(yīng)物都應(yīng)當(dāng)已經(jīng)加好并已預(yù)混合）。 2、 10x bf工作濃度為1x，注意混勻。 3、 酶切時(shí)所加的DNA溶液體積不能太大，否則DNA溶液中其他成分會(huì)干擾酶反應(yīng)。 4、 ) S: `+ a/ w5 `( N5 F# ~* a; b3 y酶通常保存在50%的甘油中，實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)將反應(yīng)液中甘油濃度控制在1/10之下，否則，酶活性將受影響。 5、 1 ' _5 b' ^# u+ ?7 [$ b6 |5 Q8 V/ O, C: s" H7 g: I) d) P如果反應(yīng)較長(zhǎng)時(shí)間而酶切體系又很小比如10微升，那么哪怕用PCR小管做反應(yīng)，體積損失也會(huì)很大。采用石蠟油覆蓋的方法可避免水分損失甘

22、油濃度提高而引起的星活性。& O; c$ }??H8 6、 混合：這是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反應(yīng)完全，必須使反應(yīng)液充分混合。我們推薦用槍反復(fù)吸取混合，或是用手指輕彈管壁混合，然后再快速離心一下即可。注意：不可振蕩。 （二）電泳檢測(cè) 各取2ul酶解液，電泳檢測(cè)。EcoRI切割λDNA后電泳得到6個(gè)片段，長(zhǎng)度分別為 21.2， 7.4， 5.8， 5.6， 4.9 和 2.5kb （三）連接 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 體外連接獲得重組分子，用于轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞。 二、實(shí)驗(yàn)原理 質(zhì)粒具有穩(wěn)定可靠和操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。如果要克隆較小的DNA片段(＜10kb)且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，質(zhì)粒要比其它

23、任何載體都要好。在質(zhì)粒載體上進(jìn)行克隆，從原理上說(shuō)是很簡(jiǎn)單的，先用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒DNA和目的DNA片段， 然后體外使兩者相連接， 再用所得到重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌，即可完成。但在實(shí)際工作中， 如何區(qū)分插入有外源DNA的重組質(zhì)粒和無(wú)插入而自身環(huán)化的載體分子是較為困難的。通過(guò)調(diào)整連接反應(yīng)中外源DNA片段和載體DNA的濃度比例，可以將載體的自身環(huán)化限制在一定程度之下，也可以進(jìn)一步采取一些特殊的克隆策略，如載體去磷酸化等來(lái)最大限度的降低載體的自身環(huán)化，還可以利用遺傳學(xué)手段如α互補(bǔ)現(xiàn)象等來(lái)鑒別重組子和非重組子。 外源DNA片段和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)策略有以下幾種： 1、帶有非互補(bǔ)突出端的片段 用兩種不同

24、的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化可以產(chǎn)生帶有非互補(bǔ)的粘性末端，這也是最容易克隆的DNA片段，一般情況下，常用質(zhì)粒載體均帶有多個(gè)不同限制酶的識(shí)別序列組成的多克隆位點(diǎn)，因而幾乎總能找到與外源DNA片段末端匹配的限制酶切位點(diǎn)的載體，從而將外源片段定向地克隆到載體上。也可在PCR擴(kuò)增時(shí)，在DNA片段兩端人為加上不同酶切位點(diǎn)以便與載體相連。 2、帶有相同的粘性末端 用相同的酶或同尾酶處理可得到這樣的末端。 由于質(zhì)粒載體也必須用同一種酶消化，亦得到同樣的兩個(gè)相同粘性末端，因此在連接反應(yīng)中外源片段和質(zhì)粒載體DNA均可能發(fā)生自身環(huán)化或幾個(gè)分子串連形成寡聚物， 而且正反兩種連接方向都可能有。所以，必須仔細(xì)調(diào)整連接反應(yīng)中

25、兩種DNA的濃度， 以便使正確的連接產(chǎn)物的數(shù)量達(dá)到最高水平。還可將載體DNA的5'磷酸基團(tuán)用堿性磷酸酯酶去掉， 最大限度地抑制質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化。帶5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地與去磷酸化的載體相連，產(chǎn)生一個(gè)帶有兩個(gè)缺口的開環(huán)分子，在轉(zhuǎn)入E. coli受體菌后的擴(kuò)增過(guò)程中缺口可自動(dòng)修復(fù)。 3、帶有平末端 是由產(chǎn)生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產(chǎn)生，或由DNA聚合酶補(bǔ) 平所致。由于平端的連接效率比粘性末端要低得多，故在其連接反應(yīng)中，T4 DNA連接酶的濃度和外源DNA及載體DNA濃度均要高得多。通常還需加入低濃度的聚乙二醇(PEG 8000)以促進(jìn)DNA分子凝聚成聚集體的物質(zhì)以提高

26、轉(zhuǎn)化效率。 特殊情況下，外源DNA分子的末端與所用的載體末端無(wú)法相互匹配，則可以在線狀質(zhì)粒載體末端或外源DNA片段末端接上合適的接頭(linker)或銜接頭(adapter)使其匹配， 也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3'凹端，使不相匹配的末端轉(zhuǎn)變?yōu)榛パa(bǔ)末端或轉(zhuǎn)為平末端后再進(jìn)行連接。 三、 主要試劑 　 T4 連接酶、無(wú)菌水、PUC/λDNA（酶切產(chǎn)物）。 四、儀器耗材 　 微量移液槍，Tip、eppendorf管?！　? 五、 連接反應(yīng)　　　 PUC (酶切產(chǎn)物) 5ul λDNA

27、(酶切產(chǎn)物) 5ul T4 ligase 1ul 10x bf 1.5 ul H2O 2.5 ul ------------------------------- Total 15ul 六、注意事項(xiàng) 進(jìn)行酶連接反應(yīng)時(shí)，注意保持低溫狀態(tài)，因?yàn)長(zhǎng)igase酶很容易降解。一般14-16℃,O/N. 實(shí)驗(yàn)四、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 獲得感受態(tài)細(xì)胞；制備含有目的片段的克隆。 二、實(shí)驗(yàn)原理 在自然條件下，

28、很多質(zhì)粒都可通過(guò)細(xì)菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi)，但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中，一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的mob基因，因此不能自行完成從一個(gè)細(xì)胞到另一個(gè)細(xì)胞的接合轉(zhuǎn)移。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA。 轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。 轉(zhuǎn)化過(guò)程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(Rˉ，Mˉ)，它可以容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法(如電擊法

29、，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化學(xué)試劑法)的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞(Compenent cells)。進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過(guò)復(fù)制，表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子(Transformant，即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞)。目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率較高，但CaCl2 法簡(jiǎn)便易行，且其轉(zhuǎn)化效率完全可以滿足一般實(shí)驗(yàn)的要求，制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí)，可加入占總體積15％

30、的無(wú)菌甘油于-70℃保存(半年)，因此CaCl2法使用更廣泛。 轉(zhuǎn)化率的計(jì)算： 統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)。轉(zhuǎn)化后在抗生素的平板上長(zhǎng)出的菌落即為轉(zhuǎn)化子，根據(jù)此皿中的菌落數(shù)可計(jì)算出轉(zhuǎn)化子總數(shù)和轉(zhuǎn)化頻率，公式如下： 轉(zhuǎn)化子總數(shù)=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積/涂板菌液體積 轉(zhuǎn)化頻率（轉(zhuǎn)化子數(shù)/每ug質(zhì)粒DNA）=轉(zhuǎn)化子總數(shù)/質(zhì)粒DNA加入量（ug） 感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)=對(duì)照組2菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×菌液總體積/涂板菌液體積 感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率=轉(zhuǎn)化子總數(shù)/感受態(tài)細(xì)胞總數(shù) 為了提高轉(zhuǎn)化效率， 實(shí)驗(yàn)中要考慮以下幾個(gè)重要因素： 1. 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度: 不要用經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于４℃的培養(yǎng)菌

31、，最好從－70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長(zhǎng)密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)為好，可通過(guò)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的OD600 來(lái)控制。DH-5α菌株的OD600 為0.5時(shí)，細(xì)胞密度在5×107 個(gè)/ml左右(不同的菌株情況有所不同)，這時(shí)比較合適。密度過(guò)高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。 2. 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度: 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA的量過(guò)多或體積過(guò)大時(shí)，轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。一般情況下，DNA溶液的體積不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞

32、體積的5％。 3. 試劑的質(zhì)量: 所用的試劑，如CaCl2 等均需是最高純度的(GR.或AR.)，并用超純水配制，最好分裝保存于干燥的冷暗處。 4. 防止雜菌和雜DNA的污染：整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行， 所用器皿， 如離心管，tip頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理，所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染， 否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入，為以后的篩選、鑒定帶來(lái)不必要的麻煩。 本實(shí)驗(yàn)以E.coli TOP10菌株為受體細(xì)胞，并用CaCl2處理，使其處于感受態(tài)，然后與pUC質(zhì)粒共保溫，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由于pUC質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr)，可通過(guò)

33、Amp抗性來(lái)篩選轉(zhuǎn)化子。如受體細(xì)胞沒(méi)有轉(zhuǎn)入pUC，則在含Amp的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。能在Amp培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子）已導(dǎo)入了pUC。 三、主要試劑 0.1 mol/L CaCl2 （滅菌）、無(wú)菌水、冰、LB液體培養(yǎng)基（胰蛋白胨、酵母粉）、氨芐青霉素（Amp）、溫控?fù)u床。 四、儀器耗材 控溫?fù)u床(37℃)、冷凍離心機(jī)、水浴鍋、冰箱（-20℃，‐70℃）、超凈工作臺(tái) 培養(yǎng)箱(37℃)、分光光度計(jì)、液器、槍頭、離心管、三角瓶、6cm平皿、酒精燈 三角玻棒、酒精棉球、火柴 五、實(shí)驗(yàn)步驟 實(shí)驗(yàn)材料：E.

34、coli.（TOP10）、重組質(zhì)粒 第一天： 從大腸桿菌TOP10平板上挑取一個(gè)單菌落接于2 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。 第二天： 1. 取0.5 mL菌液轉(zhuǎn)接到一個(gè)含有50 mL LB液體培養(yǎng)基錐形瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)。2－3 h(此時(shí)，OD600 ≤ 0.4-0.5，細(xì)胞數(shù)務(wù)必 ≤108／mL。（此為實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵) 2. 將菌液轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，冰上放置10 min。 3. 離心10 min（4000r/min），回收細(xì)胞。4℃ 4. 倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以便培養(yǎng)液流盡。 5. 用冰冷的0.1 mol/L CaCl2

35、0.5 mL懸浮沉淀，立即放在冰上30 min。 6. 4℃ 6000 r/min，離心10 min，回收細(xì)胞。 7. 用冰冷的0.1mol/L CaCl2 0.1 mL懸浮細(xì)胞，（務(wù)必放在冰上）。 8. 分裝細(xì)胞，每1200 μL一份。此細(xì)胞為感受態(tài)細(xì)胞。 轉(zhuǎn)化： 9. 取100 μL新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞，加入DNA（重組質(zhì)粒）10 μL（50 ng ）混勻冰上放置30 min。 10. 將管放到42℃循環(huán)水浴90sec。 11. 冰浴2 min。 12. 每管加600 μL LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)1 h（慢搖）。 13. 將適當(dāng)體積（200 μL）已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，

36、涂在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)皿中。（20uLx–gal,4uLIPTG） 14. 倒置平皿37℃培養(yǎng)12－16 h，出現(xiàn)菌落。 15.計(jì)算轉(zhuǎn)化效率 六、注意事項(xiàng) 1. 無(wú)菌操作。 2. 低溫操作。 3．注意加AMP時(shí)的溫度，溫度不能過(guò)高（55-60度），否則加入的抗生素失活，會(huì)使克隆株無(wú)法篩選出來(lái)。 思考題： 1. 制備感受態(tài)細(xì)胞的原理是什么？ 2. 如果實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組本不該長(zhǎng)出菌落的平板長(zhǎng)出了菌落，分析原因？ 實(shí)驗(yàn)五、重組質(zhì)粒的篩選 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 通過(guò)篩選，獲得含目的片斷的重組克隆。 二、實(shí)驗(yàn)原理 藍(lán)白斑篩選的原理:是重組子篩選的一種方法，根

37、據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子，如α-互補(bǔ)、抗生素基因等。現(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個(gè)大腸桿菌的DNA的短區(qū)段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和前146個(gè)氨基酸的編碼信息。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS），它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個(gè)氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞。因此，宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒(méi)有酶活性，但它們同時(shí)存在時(shí)，可形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)，稱為α-互補(bǔ)。由α-互補(bǔ)而產(chǎn)生的LacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)

38、劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色菌落，因而易于識(shí)別。然而，當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，幾乎不可避免地導(dǎo)致無(wú)α-互補(bǔ)能力的氨基端片段，使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍(lán)白斑篩選。如用藍(lán)白斑篩選則經(jīng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的鈣化菌平板37℃溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr后，有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。 由于pUC質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr)，可通過(guò)Amp抗性來(lái)篩選轉(zhuǎn)化子。受體細(xì)胞沒(méi)有轉(zhuǎn)入pUC，則在含Amp的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。能在Amp培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子）肯定已導(dǎo)入了pUC。轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進(jìn)行電泳、酶切等

39、進(jìn)一步鑒定。 三、主要試劑 IPTG、X-Gal 四、儀器耗材 超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、平皿、移液器、tip。 五、實(shí)驗(yàn)步驟 ???挑取白色菌落，移植于2mL的LB中，37℃培養(yǎng)12小時(shí)。以快速堿法抽提質(zhì)粒(方法同實(shí)驗(yàn)一)，同時(shí)以提取的質(zhì)粒作對(duì)照，用酶切（EcoRI）,電泳檢測(cè)。 六、注意事項(xiàng) 在含有IPTG和X-Gal的篩選培養(yǎng)基上，攜帶載體DNA的轉(zhuǎn)化子為藍(lán)色菌落，而攜帶插入片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子為白色菌落，平板如在培養(yǎng)后放于冰箱3-4小時(shí)可使顯色反應(yīng)充分，藍(lán)色菌落明顯。? 思考題： 1. 用質(zhì)粒載體進(jìn)行外源DNA 片段克隆時(shí)主要應(yīng)考慮哪些因素？ 2. 利用α-互補(bǔ)現(xiàn)象篩選帶有插入片段的重組克隆的原理是什么？ 13