卷心菜中過氧化物酶熱穩(wěn)定性的初步研究

實驗一 卷心菜中過氧化物酶熱穩(wěn)定性的初步研究1、 實驗原理果蔬中的過氧化物酶（peroxidase）往往具有較高的熱穩(wěn)定性，對果蔬進行熱燙處理時，常以過氧化物酶是否失活作為熱燙是否充分的標準。許多研究表明果蔬中的過氧化物酶有熱穩(wěn)定和熱不穩(wěn)定兩部分。這兩部分的比例取決于果蔬的品種和熱燙處理的溫度。過氧化物酶催化的典型反應(yīng)為：H2O2AH2A2H2O。AH2是無色的還原性化合物，如果它經(jīng)過氧化轉(zhuǎn)變成有色的A，那么反應(yīng)體系在特定波長下的吸光值就會隨反應(yīng)進行而增加。因此，可以用分光光度法測定過氧化物酶的活力。2、 試劑和儀器試劑：0.05mol/L磷酸鹽緩沖液pH7.0，含1.0mol/L NaCl(緩沖液)、0.1mol/L磷酸鹽緩沖液pH7.0(緩沖液)、1%鄰苯二胺-乙醇溶液、0.3%過氧化氫溶液儀器：組織搗碎機、抽濾裝置、水浴鍋、721分光光度計（含比色皿）、秒表、常規(guī)玻璃儀器3、 實驗步驟1、 從卷心菜中提取過氧化物酶 125g卷心菜125mL緩沖液 均質(zhì)（20000rpm，2min） 勻漿 抽濾 液體 離心（8000rpm，15min，4） 殘渣 濾過液（粗酶液）2、 過氧化物酶熱處理將從卷心菜中萃取得到的過氧化物酶粗酶液置于試管中。取適量酶液稀釋5倍左右，過濾后測定酶活。另取適量酶液分別置于已編號的試管中，將試管在60水浴中保溫1 min，然后移至85水浴鍋中，分別處理0.5min、1min、1.5 min、2 min、3 min、5 min、7 min和10 min，然后立即將試管轉(zhuǎn)移至冰浴中，快速冷卻至0。再取適量酶液分別置于已編號的試管中，并將試管在60水浴中保溫1 min，然后在100下分別處理15s、30 s、45 s、1 min、1.5 min、2 min和3 min，然后在冰浴中快速冷卻，測定殘余過氧化物酶活力。3、 過氧化物酶活力測定如果熱處理后酶液中產(chǎn)生混濁，應(yīng)在比色前過濾去除沉淀。向比色皿中加入2.6mL緩沖液，0.1mL鄰苯二胺-乙醇溶液，0.2mL過氧化氫溶液，然后加入0.1mL酶液，并立即攪勻計時，在430 nm下測定反應(yīng)混合物的吸光值隨時間的變化?？瞻滓跃彌_液代替酶液。根據(jù)吸光值變化情況調(diào)節(jié)加酶量，保持酶液和緩沖液體積之和恒定。4、 數(shù)據(jù)記錄與處理1、 粗酶液活力測定數(shù)據(jù)時間/S102030405060708090100110120吸光度0.1050.1870.2620.3420.4270.5080.5940.6820.7730.8670.9661.062用Excel處理數(shù)據(jù)，得到下圖，加酶量0.1mL，稀釋倍數(shù)為5（1mL原酶液+4mL蒸餾水）。由圖可知：直線的斜率為0.5198，也就是說每分鐘吸光度值上升0.5198。由于稀釋倍數(shù)為5倍，加酶量為0.1mL，因此計算得出酶活力為0.519850=25.99U/mL。2、85熱處理后殘余酶活測定數(shù)據(jù)熱處理時間不同的幾組樣品在不同稀釋倍數(shù)及加酶量條件下分別測定了消光值，如下表：熱處理消光值時間/s10203040506070809010011012085 0.5min0.0450.0880.1380.1880.2400.2930.3480.4050.4640.5230.5850.649851.0min0.0470.0910.1360.1810.2290.2780.3270.3790.4320.4860.5410.59985 1.5min0.0150.0320.0540.0750.0970.1190.1410.1650.1880.2110.2340.25985 2.0min0.0420.0780.1170.1550.1930.2340.2750.3170.3610.4060.4520.49985 3.0min0.0060.0120.0180.0250.0310.0380.0440.0520.0590.0660.0740.082855.0min0.0040.0040.0050.0060.0080.0090.0110.0130.0150.0170.0190.02185 7.0min0.0040.0030.0040.0040.0040.0030.0040.0040.0040.0040.0040.00485 10.0min0.0030.0030.0030.0030.0030.0030.0030.0030.0030.0030.0030.003數(shù)據(jù)處理如下圖：（85，30秒，稀釋4倍，加酶量0.1mL）（85，60秒，稀釋3倍，加酶量0.1mL）（85，90秒，稀釋2倍，加酶量0.1mL）（85，120秒，稀釋1倍，加酶量0.1mL）（85，180秒，稀釋1倍，加酶量0.1mL）（85，300秒，稀釋1倍，加酶量0.1mL）（85，420秒，稀釋1倍，加酶量0.1mL）（85，600秒，稀釋1倍，加酶量0.1mL）3、100熱處理后殘余酶活測定熱處理時間不同的幾組樣品在不同加酶量條件下分別測定了消光值，如下表：熱處理消光值時間/s102030405060708090100110120100 0.25min0.0820.1440.2080.2750.3430.4140.4870.5640.6430.7240.8090.897100 0.5min0.1350.1760.2230.2830.3410.4040.4690.5360.6050.6750.7480.825100 0.75min0.0040.0080.0120.0170.0210.0240.0290.0330.0380.0430.0470.052100 1.0min0.0050.0080.0110.0140.0170.0210.0250.0280.0310.0340.0380.042100 1.5min0.0880.0930.0960.1000.1070.1090.1140.1170.1220.1270.1310.135100 2.0min0.0870.0910.0910.0920.0930.0940.0950.0990.0960.0980.0980.099100 3.0min0.0980.0980.0970.0980.0980.0980.0990.0990.0990.0990.1000.100數(shù)據(jù)處理如下面一系列圖：（100，15秒，稀釋4倍，加酶量0.1mL）（100，30秒，稀釋3倍，加酶量0.1mL）（100，45秒，稀釋2倍，加酶量0.1mL）（100，60秒，稀釋1倍，加酶量0.1mL）（100，90秒，稀釋1倍，加酶量0.1mL）（100，120秒，稀釋1倍，加酶量0.1mL）（100，180秒，稀釋1倍，加酶量0.1mL）4、 酶活計算Excel處理數(shù)據(jù)所的斜率熱處理條件酶液稀釋倍數(shù)加酶量/mL酶活/U/mL相對殘余活力（%）相對殘余活力對數(shù)0.5198無50.125.99100.02.0000.330385熱處理0.540.113.21250.8351.7060.300585熱處理130.19.01534.6861.4820.134185熱處理1.520.12.68210.3191.01360.248885熱處理2未0.10.24880.957-0.01910.041385熱處理3未0.10.04130.1589-0.79890.009885熱處理5未0.10.00980.0377-1.42370.000285熱處理7未0.10.00020.0000077-5.1140.000085熱處理10未0.10.00000-0.4435100熱處理0.2540.117.7468.2571.8340.3810100熱處理0.530.111.4343.9781.6430.0261100熱處理0.7520.10.5222.00850.30290.0201100熱處理1未0.10.02010.0773-1.11180.0256100熱處理1.5未0.10.02560.0985-1.00660.0069100熱處理2未0.10.00690.0265-1.5770.0013100熱處理3未0.10.00130.00005002-4.30095、 相對殘余活力熱處理時間曲線和相對殘余活力對數(shù)熱處理時間曲線在相對殘余活力熱處理時間曲線中，最初的直線部分代表酶的熱不穩(wěn)定部分失活，中間曲線部分可以認為是過渡區(qū)域，而最后的直線部分表示耐熱部分的失活，擬合最后平緩部分并延長（取最后三個點）可以得出它與縱坐標的交點，由此可以估算出耐熱部分活力占酶的總活力的比例。曲線如下圖：由圖中可知，85熱處理時，卷心菜中過氧化物酶耐熱部分所占比例約為-0.0397 ，而100熱處理時，其比例僅占-0.0508.5、 討論1、 根據(jù)文獻報道，卷心菜中過氧化物酶的最適pH接近中性。2、過氧化物酶經(jīng)熱處理失活，當(dāng)溫度下降時失活的酶能部分再生，此種再生現(xiàn)象在室溫條件下（2535）表現(xiàn)得較為明顯，當(dāng)溫度接近0時酶的再生受到抑制。3、在一些植物中的過氧化物酶的熱失活遵循一級動力學(xué)。