（浙江選考）2019版高考生物一輪總復(fù)習(xí) 第九單元 生物技術(shù)實踐 第30講 微生物的利用學(xué)案

第30講微生物的利用考試標(biāo)準(zhǔn)必考加試考試標(biāo)準(zhǔn)必考加試1.大腸桿菌的培養(yǎng)和分離2.分離以尿素為氮源的微生物考點一微生物的培養(yǎng)和分離1大腸桿菌(1)特性：大腸桿菌是革蘭氏陰性、兼性厭氧(代謝類型)的腸道桿菌，在腸道中一般對人無害，但若進入人的泌尿系統(tǒng)，就會對人體產(chǎn)生危害。(2)用途：是基因工程技術(shù)中被廣泛采用的工具。2細菌的培養(yǎng)和分離(1)細菌的繁殖：以分裂的方式繁殖，分裂速度很快，約20 min分裂一次。(2)培養(yǎng)的方法：需要將已有細菌的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基中，一般用接種環(huán)(工具)轉(zhuǎn)移帶菌的培養(yǎng)物。(3)細菌分離的方法與特點分離方法特點劃線分離法操作簡單涂布分離法操作復(fù)雜，單菌落更易分開3.大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實驗(1)實驗內(nèi)容：將大腸桿菌擴大培養(yǎng)和劃線分離，即用LB液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)大腸桿菌，培養(yǎng)后再在LB固體平面培養(yǎng)基上劃線進行分離，隨后培養(yǎng)基上就會形成一個個單獨的菌落。(2)實驗步驟培養(yǎng)基滅菌倒平板接種劃線分離培養(yǎng)觀察50 mL LB液體培養(yǎng)基和50 mL LB固體培養(yǎng)基及培養(yǎng)皿高壓蒸汽滅菌將培養(yǎng)基分別倒至4個滅菌后的培養(yǎng)皿中，水平放置，使之形成平面在裝有液體培養(yǎng)基的三角瓶中接種大腸桿菌，培養(yǎng)12 h用接種環(huán)在接種有大腸桿菌的三角瓶中蘸菌液一次，在固體培養(yǎng)基的平板上連續(xù)劃線，蓋好培養(yǎng)皿培養(yǎng)皿倒置(蓋在下面)，放在37 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1224 h后，可看到劃線的末端出現(xiàn)不連續(xù)的單個菌落(3)大腸桿菌分離的用途：單菌落的分離是消除污染雜菌的通用方法，也是用于篩選高表達量菌株的最簡便方法之一。4微生物兩種常用的接種方法比較比較劃線分離法涂布分離法工具接種環(huán)玻璃刮刀原理通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離到由一個細菌細胞繁殖而來的肉眼可見的細胞群體，即菌落將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個細菌細胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落特點方法簡單，但不適宜計數(shù)單菌落更易分開，但操作復(fù)雜些目的使培養(yǎng)基上形成由單個細菌細胞繁殖而來的子細胞群體菌落思考討論1連線無菌技術(shù)的方法、類型及對象，并總結(jié)消毒與滅菌的區(qū)別。消毒和滅菌的區(qū)別項目條件結(jié)果常用的方法消毒較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外線或化學(xué)藥物消毒法滅菌強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌2.觀察甲、乙、丙、丁四幅圖，熟悉倒平板的操作流程，請?zhí)羁眨?1)請用文字和箭頭寫出正確的倒平板操作流程：丙乙甲丁。(2)甲、乙、丙中的滅菌方法是灼燒滅菌。(3)丁中的操作需要等待平板冷卻凝固才能進行。3下圖中甲為劃線分離法中最重要的環(huán)節(jié)，乙為操作的結(jié)果：(1)每一次劃線后都要將接種環(huán)灼燒()(2)除第一次劃線外，每一次劃線的起點都是第一次劃線的末端(×)提示平板劃線時除第一次劃線外，每一次劃線的起點都是上一次劃線的末端，而不是第一次劃線的末端。(3)說明乙圖劃線結(jié)束后，培養(yǎng)皿要倒置(蓋在下面)在37 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的原因是什么？提示平板冷凝后倒置培養(yǎng)，使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)；防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基中造成污染。4如圖是采用純化微生物培養(yǎng)的兩種接種方法接種后培養(yǎng)的效果圖，請思考：(1)獲得圖A效果和B效果的接種方法分別是什么？提示獲得效果A的接種方法為涂布分離法，獲得效果B的接種方法為劃線分離法。(2)某同學(xué)在純化土壤中的細菌時，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基上的菌落連成了一片，最可能的原因是什么？應(yīng)當(dāng)怎樣操作才可避免此種現(xiàn)象？提示最可能的原因是菌液濃度過高或劃線時在劃下一區(qū)域前未將接種環(huán)灼燒滅菌；采取的措施是增大稀釋倍數(shù)或每次劃新區(qū)域前先將接種環(huán)灼燒滅菌。1(2017·杭州一模)據(jù)報道，一些企業(yè)生產(chǎn)的速凍食品中檢出金黃色葡萄球菌超標(biāo)，加上熟鹵制品的大腸桿菌超標(biāo)，“細菌門”事件引起公眾普遍關(guān)注。金黃色葡萄球菌能分解卵黃中的卵磷脂，在含卵黃的固體培養(yǎng)基上形成的菌落周圍會出現(xiàn)特有的乳白色的乳濁環(huán)。請回答下列問題：(1)某生物興趣小組欲檢測某果汁類食品中是否含有金黃色葡萄球菌以及該菌的含量。配制培養(yǎng)基：稱取適量的牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂等，加入蒸餾水，攪拌加熱至完全溶解后_，分裝到錐形瓶后利用_進行滅菌，在無菌狀態(tài)下加入卵黃液(100 mL 10%滅菌NaCl溶液中加一個雞蛋黃，振蕩均勻)搖勻后立即倒平板。接種：該小組采用涂布分離法檢測果汁樣品中的細菌含量。在涂布接種前，隨機取若干滅菌后的空白平板先行培養(yǎng)了一段時間，這樣做的目的是_；然后，將1 mL果汁樣品稀釋10倍，在3個平板上用涂布分離法分別接入0.1 mL稀釋液。培養(yǎng)及結(jié)果：將培養(yǎng)皿_放入恒溫培養(yǎng)箱中經(jīng)適當(dāng)培養(yǎng)，3個平板上的菌落數(shù)分別為19、18和17。據(jù)此可得出每升果汁樣品中的活菌數(shù)為_個。(2)示意圖A和B中_表示的是用涂布分離法接種培養(yǎng)后得到的結(jié)果。(3)下列有關(guān)常用涂布分離法的操作正確的是_。A在超凈工作臺中進行接種時應(yīng)關(guān)閉紫外燈B接種前需先稀釋，然后過濾除去雜菌C在每個固體培養(yǎng)基表面都可形成單菌落D玻璃刮刀浸泡在70%的酒精中滅菌，不用灼燒(4)菌種保存：在無菌條件下將單菌落用接種環(huán)取出，再用劃線法接種在_上，在37 下培養(yǎng)24 h后，置于4 冰箱中保存。答案(1)調(diào)節(jié)pH高壓蒸汽滅菌鍋檢測培養(yǎng)基平板滅菌是否合格倒置1.8×106(2)B(3)A(4)斜面解析(1)培養(yǎng)基配制好后應(yīng)調(diào)節(jié)酸堿度(pH)，分裝到錐形瓶后利用高壓蒸汽滅菌鍋進行滅菌。涂布接種前，將制好的空白平板先培養(yǎng)一段時間，目的是檢測培養(yǎng)基平板滅菌是否合格；接種后，培養(yǎng)皿需要倒置培養(yǎng)，防止皿蓋上凝集的水滴滴落造成污染；0.1 mL稀釋液(稀釋10倍)含細菌數(shù)約為18個，得出每升果汁含有活菌數(shù)1.8×106個。(2)圖中A為劃線分離得到的結(jié)果，B為涂布分離得到的結(jié)果。(3)在超凈工作臺進行接種操作時應(yīng)關(guān)閉紫外燈，A正確；涂布分離前需稀釋，但不能過濾除菌，B錯誤；稀釋度較大的溶液涂布分離不一定出現(xiàn)菌落，C錯誤；玻璃刮刀浸泡后需要灼燒，D錯誤。(4)純化的菌種保存在斜面上。2下圖為“大腸桿菌的培養(yǎng)和分離”實驗的基本流程，請回答下列問題：C.擴大培養(yǎng)(液體培養(yǎng)基)D.劃線分離和培養(yǎng)(固體培養(yǎng)基)(1)A過程配制的是通用細菌培養(yǎng)基，稱為_培養(yǎng)基。配制時除了加入特定的營養(yǎng)物質(zhì)以外，還要加入一定量的氯化鈉，以維持一定的_。對培養(yǎng)基酸堿度的調(diào)節(jié)，應(yīng)該在B過程的_(填“前面”或“后面”)。(2)D過程與C過程相比，培養(yǎng)基中增加的物質(zhì)是_，E過程所需的溫度是_。(3)D過程后，一個菌體便會形成一個_，這種分離方法是_的通用方法，也是篩選特定菌株的最簡便方法之一。(4)植物組織培養(yǎng)時，先配制MS培養(yǎng)基，再加入一定比例的植物激素，當(dāng)生長素相對較多時，可促進_。(5)植物組織培養(yǎng)和微生物培養(yǎng)都需要無菌操作，下列不適宜用高壓蒸汽滅菌的是()A接種環(huán)和鑷子B三角瓶和廣口瓶C發(fā)芽培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基D用于培養(yǎng)的幼莖和幼芽答案(1)LB液體滲透壓前面(2)瓊脂4 (3)(單)菌落消除污染雜菌(或純化菌種)(4)生根(5)D解析(1)LB液體培養(yǎng)基是通用的細菌培養(yǎng)基，LB固體平面培養(yǎng)基則用于劃線分離形成單菌落。氯化鈉的作用是維持培養(yǎng)基的滲透壓。調(diào)節(jié)好酸堿度后才能進行滅菌，若滅菌后再進行酸堿度調(diào)節(jié)，又會產(chǎn)生新的污染。(2)在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入一定量的瓊脂可形成固體培養(yǎng)基。菌種應(yīng)置于4 °C冰箱中保存。(3)通過劃線分離后，一個菌體就會繁殖出一個菌落。(4)植物組織培養(yǎng)中生長素相對較多時，有利于生根，而細胞分裂素相對較多時，則有利于生芽。(5)高壓蒸汽滅菌常用于培養(yǎng)基、培養(yǎng)器材等的滅菌，而用于培養(yǎng)的幼莖和幼芽則不能進行任何滅菌操作，否則會導(dǎo)致細胞死亡。3(2017·嘉興期末)下列是有關(guān)大腸桿菌的培養(yǎng)實驗，請回答問題：(1)配制培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)基時，根據(jù)“細菌喜葷，霉菌喜素”的規(guī)律，通常在培養(yǎng)基中加入蛋白胨和_作為營養(yǎng)物質(zhì)，為維持一定的滲透壓，常需加入一定量的_。(2)大腸桿菌培養(yǎng)和分離的實驗中，在_中進行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)液經(jīng)_后，在LB固體培養(yǎng)基上進行_，并將培養(yǎng)皿_放在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，可以獲得如圖效果。為了檢測接種、培養(yǎng)過程是否受雜菌污染以及_，應(yīng)同時將未接種的培養(yǎng)基放入相同條件的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(3)通常對獲得的純菌種可以依據(jù)_的形狀、大小等特征進行初步的鑒定。(4)下列關(guān)于“大腸桿菌培養(yǎng)和分離”的操作中，敘述正確的是()A高壓滅菌加熱結(jié)束時，打開放氣閥使壓力表指針回到零后，開啟鍋蓋B倒平板時，應(yīng)將打開的皿蓋放到一邊，以免培養(yǎng)基濺到皿蓋上C為了防止污染，接種工具經(jīng)火焰滅菌后應(yīng)趁熱快速挑取菌落D用記號筆標(biāo)記培養(yǎng)皿中菌落時，應(yīng)標(biāo)記在皿底上答案(1)酵母提取物NaCl(2)LB液體培養(yǎng)基稀釋分離倒置無菌操作是否規(guī)范(3)菌落(4)D解析(1)配制培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)基時，根據(jù)“細菌喜葷，霉菌喜素”的規(guī)律，通常在培養(yǎng)基中加入蛋白胨和酵母提取物作為營養(yǎng)物質(zhì)，為維持一定的滲透壓，常需加入一定量的NaCl。(2)大腸桿菌培養(yǎng)和分離的實驗中，在LB液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)液經(jīng)稀釋后，在LB固體培養(yǎng)基上進行分離，并將培養(yǎng)皿倒置放在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；為了檢測接種、培養(yǎng)過程是否受雜菌污染以及無菌操作是否規(guī)范，應(yīng)同時將未接種的培養(yǎng)基放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(3)通常對獲得的純菌種可以依據(jù)菌落的形狀、大小等特征進行初步的鑒定。(4)高壓滅菌加熱結(jié)束，等待壓力表指針回到零后，才能開啟鍋蓋，不能直接打開放氣閥使壓力表指針回到零，A錯誤；倒平板過程中不能打開培養(yǎng)皿的皿蓋，以防止雜菌污染，B錯誤；接種環(huán)在火焰上灼燒后，待冷卻后才可以快速挑取菌落，C錯誤；用記號筆標(biāo)記培養(yǎng)皿中菌落時，應(yīng)標(biāo)記在皿底上，D正確。培養(yǎng)基的成分和類型(1)培養(yǎng)基成分：一般都含有水、碳源、氮源、無機鹽、生長因子等，此外還要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的要求。(2)培養(yǎng)基的類型及其應(yīng)用劃分標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基種類特點用途物理性質(zhì)液體培養(yǎng)基 不加凝固劑工業(yè)生產(chǎn)半固體培養(yǎng)基加凝固劑，如瓊脂觀察微生物的運動及微生物的分類、鑒定固體培養(yǎng)基加凝固劑，如瓊脂微生物的分離、鑒定及活菌計數(shù)目的用途選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長、促進所需要的微生物的生長特定微生物的培養(yǎng)、分離鑒別培養(yǎng)基根據(jù)微生物的代謝特點，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品不同種類的微生物的鑒別考點二分離以尿素為氮源的微生物1菌種特點含有脲酶，可以通過降解尿素作為其生長的氮源。2培養(yǎng)基用以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基培養(yǎng)，以LB全營養(yǎng)培養(yǎng)基為對照。3實驗原理(1)篩選以尿素為氮源的微生物，可使用以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基進行培養(yǎng)選擇。(2)細菌合成的脲酶能將尿素分解成NH3，致使pH升高，使酚紅指示劑變紅。4實驗步驟5反應(yīng)的鑒定在配制培養(yǎng)基時，加入指示劑酚紅，培養(yǎng)時細菌將尿素分解并產(chǎn)生堿性的氨，使培養(yǎng)基上菌落周圍出現(xiàn)紅色的環(huán)帶。思考討論1分析下表所示培養(yǎng)基的配方，回答下列問題。成分含量成分含量KH2PO41.4 g葡萄糖10.0 gNa2HPO42.1 g尿素1.0 gMgSO4·7H2O0.2 g瓊脂糖15.0 g將上述物質(zhì)溶解后，用蒸餾水定容到1 000 mL(1)在該培養(yǎng)基的配方中，為微生物提供碳源的物質(zhì)是葡萄糖，提供氮源的物質(zhì)是尿素。(2)該培養(yǎng)基是(填“是”或“否”)具有選擇作用，因為只有能分解尿素的微生物才能生長。(3)用瓊脂糖代替瓊脂配制固體培養(yǎng)基的原因是什么？提示瓊脂是未被純化的混合物，內(nèi)含一定量的含氮化合物。如果用瓊脂固體培養(yǎng)基，會為細菌提供一定量的非尿素類氮源，這樣會在尿素固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生大量以非尿素為氮源的細菌，所以用經(jīng)純化的瓊脂糖做固化劑。2如圖為分離以尿素為氮源的微生物的實驗，思考回答下列問題：(1)實驗?zāi)康氖鞘褂煤心蛩氐呐囵B(yǎng)基分離能產(chǎn)生脲酶的細菌，使用酚紅作為指示劑。(2)有脲酶的細菌菌落周圍出現(xiàn)有色環(huán)帶的原因是什么？提示細菌向胞外分泌脲酶，使培養(yǎng)基中尿素水解產(chǎn)生呈堿性的氨，遇培養(yǎng)基中的酚紅指示劑產(chǎn)生顏色變化，形成紅色環(huán)帶。(3)制備尿素固體培養(yǎng)基的過程中采用的滅菌方法有高壓蒸汽滅菌法、G6玻璃砂漏斗過濾法。(4)與全營養(yǎng)培養(yǎng)基相比，尿素培養(yǎng)基上只有少數(shù)菌落的原因是什么？提示土壤中能利用尿素的細菌占極少數(shù)。因為人和其他哺乳動物產(chǎn)生的排泄物畢竟是少量的，此外尿素還可以在高溫下自然分解，因此，以尿素為氮源的菌群較少。(5)從上圖所示實驗過程中可判斷出細菌懸液C的稀釋度為104，用涂布分離法分離細菌。3判斷下列敘述的正誤(1)土樣應(yīng)從有哺乳動物排泄物的地方取()提示有哺乳動物排泄物的地方含脲酶的細菌較多。(2)取104、105的土壤稀釋液各0.1 mL，分別涂布于全營養(yǎng)LB固體培養(yǎng)基、尿素固體培養(yǎng)基上()(3)將實驗組和對照組平板倒置，37 °C恒溫培養(yǎng)2448 h()(4)在尿素固體培養(yǎng)基上生長的細菌都是以尿素為氮源的細菌(×)4海洋發(fā)生石油泄漏事件后，可用一些微生物有效分解石油，如何配制選擇培養(yǎng)基將這類微生物選擇出來？提示配制的選擇培養(yǎng)基中，石油作為唯一的碳源，然后用這種培養(yǎng)基培養(yǎng)多種微生物，凡是能在該種培養(yǎng)基上生存的就是能分解石油的微生物。1(2017·紹興市魯迅高級中學(xué)期中質(zhì)檢)回答下列問題：尿素是一種高濃度氮肥，且長期施用沒有不良影響，但尿素只有通過土壤中某些細菌的分解作用，才能被植物吸收利用。某同學(xué)要分離出土壤中能分解尿素的細菌，并嘗試進行計數(shù)，培養(yǎng)基配方如下：K2HPO4NaClH2O葡萄糖尿素酚紅瓊脂0.12 g0.12 g15 mL0.025 g2.0 g0.25 mg0.5 g(1)上述培養(yǎng)基配制完成后，應(yīng)選擇_法滅菌，根據(jù)培養(yǎng)基的成分推斷，該同學(xué)能否分離出土壤中只分解尿素的細菌？_(填“能”或“否”)，推斷理由是_。(2)分離得到分解尿素的細菌后，則應(yīng)選擇_培養(yǎng)基進行擴大培養(yǎng)。培養(yǎng)一段時間后，要借助顯微鏡對微生物細胞進行計數(shù)。計數(shù)過程中，下列哪種行為會影響計數(shù)的準(zhǔn)確性_。A計數(shù)時直接從靜置培養(yǎng)的試管底部取培養(yǎng)液進行計數(shù)B如果方格內(nèi)微生物細胞數(shù)量多于300個，應(yīng)將培養(yǎng)液先稀釋后再計數(shù)C如果微生物細胞有粘連，要數(shù)出團塊中的每一個細胞D壓在方格線上的細胞只計左線和上線上的細胞數(shù)(3)為了提高尿素肥效，可以將分解尿素的酶和尿素混合，制成“加酶尿素”。為了提高“加酶尿素”中酶的利用率，可采用_技術(shù)。答案(1)高壓蒸汽滅菌否瓊脂是未純化的混合物，內(nèi)含一定量的含氮化合物，導(dǎo)致尿素不是唯一的氮源(2)液體A(3)固定化酶解析(1)高壓蒸汽滅菌適合于耐高溫的物品，如培養(yǎng)基、金屬器械、玻璃等，題述培養(yǎng)基配制完成后，應(yīng)選擇高壓蒸汽滅菌；該同學(xué)不能分離出土壤中只分解尿素的細菌，因為瓊脂是未純化的混合物，內(nèi)含一定量的含氮化合物，導(dǎo)致尿素不是唯一的氮源。(2)應(yīng)選擇液體培養(yǎng)基進行擴大培養(yǎng)；由于重力作用，試管底部培養(yǎng)液中細菌種群密度較大，應(yīng)將培養(yǎng)液搖勻后進行計數(shù)。(3)為了提高“加酶尿素”中酶的利用率，可采用固定化酶技術(shù)，使酶與尿素分開，可重復(fù)利用。2(2016·浙江10月選考)請回答從土壤中分離產(chǎn)脲酶細菌和脲酶固定化實驗的有關(guān)問題：(1)LB固體培養(yǎng)基：取適量的蛋白胨、酵母提取物、NaCl，加入一定量的蒸餾水溶解，再加_，滅菌備用。(2)尿素固體培養(yǎng)基：先將適宜濃度的尿素溶液用_滅菌過的G6玻璃砂漏斗過濾，因為G6玻璃砂漏斗_，故用于過濾除菌。然后將尿素溶液加入到已經(jīng)滅菌的含有酚紅的培養(yǎng)基中，備用。(3)取適量含產(chǎn)脲酶細菌的104、105兩種土壤稀釋液，分別涂布接種到LB固體培養(yǎng)基和尿素固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48 h，推測固體培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)最少的是_。(A.105稀釋液尿素固體培養(yǎng)基B105稀釋液LB固體培養(yǎng)基C104稀釋液尿素固體培養(yǎng)基D104稀釋液LB固體培養(yǎng)基)。在尿素固體培養(yǎng)基上產(chǎn)脲酶細菌菌落周圍出現(xiàn)_，其原因是細菌產(chǎn)生的脲酶催化尿素分解產(chǎn)生_所致。(4)制備固定化脲酶時，用石英砂吸附脲酶，裝柱。再用蒸餾水洗滌固定化酶柱，其作用是_。答案(1)瓊脂(2)高壓蒸汽孔徑小，細菌不能濾過(3)A紅色環(huán)帶氨(或NH3)(4)除去游離的脲酶解析(1)固體培養(yǎng)基中需添加瓊脂起到凝固的作用。(2)因為G6玻璃砂漏斗中存在雜菌，所以在其過濾除菌之前需進行高壓蒸汽滅菌；G6玻璃砂漏斗能過濾除菌的原理是其孔徑較小，細菌不能通過。(3)土壤中的微生物在LB全營養(yǎng)培養(yǎng)基中都能生長，在尿素固體培養(yǎng)基中只有能利用尿素的微生物能生長，104土壤稀釋液中微生物數(shù)量較多，所以推測固體培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)最少的是105尿素固體培養(yǎng)基；在尿素固體培養(yǎng)基上產(chǎn)脲酶的細菌菌落周圍會出現(xiàn)紅色環(huán)帶，這是因為細菌產(chǎn)生的脲酶催化尿素分解產(chǎn)生了氨(NH3)，導(dǎo)致培養(yǎng)基呈堿性，培養(yǎng)基中的酚紅遇堿性條件會變紅。(4)并不是所有的脲酶都吸附在石英砂上，所以裝柱后需用蒸餾水洗滌固定化酶柱，以洗去多余的未吸附的脲酶。3如圖是從土壤中篩選產(chǎn)脲酶細菌的過程。(1)圖中選擇培養(yǎng)基應(yīng)以_為唯一氮源；鑒別培養(yǎng)基還需添加_作為指示劑，產(chǎn)脲酶細菌在該培養(yǎng)基上生長一段時間后，其菌落周圍的指示劑將變成_色。(2)在5個細菌培養(yǎng)基平板上，均接種稀釋倍數(shù)為105的土壤樣品溶液0.1 mL，培養(yǎng)一段時間后，平板上長出的細菌菌落數(shù)分別為13、156、462、178和191。該過程采取的接種方法是_，每克土壤樣品中的細菌數(shù)量為_×108個；與血細胞計數(shù)板計數(shù)法相比，此計數(shù)方法測得的細菌數(shù)較_。答案(1)尿素酚紅紅(2)涂布分離法1.75少解析(1)脲酶能夠催化尿素分解為氨，故圖中選擇培養(yǎng)基應(yīng)以尿素作為唯一氮源。由于尿素被分解成了氨，氨會使培養(yǎng)基的堿性增強，pH升高，使酚紅指示劑變紅色。(2)用于計數(shù)細菌菌落數(shù)的接種方法是涂布分離法，統(tǒng)計的菌落數(shù)應(yīng)介于30300之間，故選擇細菌菌落數(shù)為156、178和191的平板計數(shù)，每克土壤樣品中的細菌數(shù)量為(156178191)/3÷0.1×1051.75×108個。由于兩個或多個細菌連接在一起時，往往統(tǒng)計的是一個菌落，故用此方法測得的細菌數(shù)偏少。1培養(yǎng)基中觀測指標(biāo)的分析(1)培養(yǎng)基中的酚紅指示劑產(chǎn)生顏色變化(變紅)，標(biāo)志著存在脲酶水解尿素的作用，從而證明這一菌株能以尿素為氮源。紅色環(huán)狀區(qū)域的大小代表脲酶活性的強弱和含量的多少。紅色區(qū)域越大，表明菌株利用尿素的能力越強。(2)與全營養(yǎng)培養(yǎng)基上的菌落數(shù)比較，尿素培養(yǎng)基上只有少數(shù)菌落，這一現(xiàn)象表明能利用尿素的細菌在土壤菌群中只占極少部分。2微生物篩選過程中必要的兩種對照培養(yǎng)基及其作用對照組作用現(xiàn)象結(jié)論未接種培養(yǎng)基有無雜菌污染的判斷未接種的培養(yǎng)皿中無菌落生長未被雜菌污染接種的LB全營養(yǎng)培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基篩選作用的確認LB全營養(yǎng)培養(yǎng)基上的菌落數(shù)大于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目選擇培養(yǎng)基具有篩選作用3.樣品稀釋的原因和標(biāo)準(zhǔn)(1)稀釋原因：樣品的稀釋度直接影響平板上生長的菌落數(shù)。在適當(dāng)?shù)南♂尪认?，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。因此，恰當(dāng)?shù)南♂尪仁浅晒Φ亟y(tǒng)計菌落數(shù)的關(guān)鍵。(2)稀釋標(biāo)準(zhǔn)：選用一定范圍的樣品稀釋液進行培養(yǎng)，為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30300的平板計數(shù)。模擬演練1下圖是微生物平板劃線示意圖。劃線的順序為1、2、3、4、5。下列操作方法正確的是()A操作前要將接種環(huán)放在火焰旁滅菌B劃線操作須在火焰上進行C在5區(qū)域中才有可能得到所需菌落D在1、2、3、4、5區(qū)域中劃線前后都要對接種環(huán)進行滅菌答案D解析操作前要將接種環(huán)放在火焰上灼燒滅菌，A項錯誤；劃線操作須在火焰旁進行，B項錯誤；在5區(qū)域中最有可能得到所需菌落，C項錯誤；在1、2、3、4、5區(qū)域中劃線前后都要對接種環(huán)進行滅菌，D項正確。2下列關(guān)于大腸桿菌的培養(yǎng)的敘述，不正確的是()A在大腸桿菌培養(yǎng)過程中，除考慮營養(yǎng)條件外，還要考慮pH、溫度和滲透壓等條件B若對大腸桿菌活菌進行計數(shù)，要想使所得估計值更接近實際值，除應(yīng)嚴格操作、多次重復(fù)外，還應(yīng)保證待測樣品的稀釋度合適C在微生物培養(yǎng)操作過程中，為防止雜菌污染，需對培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿進行消毒D使用過的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物必須經(jīng)過滅菌處理后才能丟棄答案C解析微生物培養(yǎng)條件有營養(yǎng)條件、pH、溫度、滲透壓等，A正確；為計數(shù)活菌數(shù)，要多次實驗求平均值、操作要嚴格，還要保證樣品的稀釋度合適，便于檢測，B正確；為防止雜菌污染，對培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿要進行滅菌，C錯誤；為防止對環(huán)境的污染，用過的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物必須經(jīng)過滅菌處理后才能丟棄，D正確。3下圖是“分離以尿素為氮源的微生物”實驗的基本流程，請回答下列問題：(1)該實驗培養(yǎng)基不能含有_。A尿素 B氯化鈉C葡萄糖 D瓊脂(2)尿素溶液可用_使之無菌。若要檢查B過程滅菌是否徹底，可以采用的方法是_。(3)圖中步驟C為_。相對于劃線分離法，過程D涂布分離法的優(yōu)點是_。(4)如果菌落周圍出現(xiàn)_色環(huán)帶，說明該菌落能分泌脲酶。答案(1)D(2)G6玻璃砂漏斗過濾將空白培養(yǎng)基放在適宜溫度下培養(yǎng)一段時間，觀察有無菌落出現(xiàn)(3)倒平板單菌落更易分開(4)紅解析(1)分離以尿素為氮源的微生物，應(yīng)該以尿素為唯一氮源，所以不應(yīng)有瓊脂。(2)尿素用G6玻璃砂漏斗過濾除去其中的細菌等微生物。(4)若菌落能分泌脲酶，則菌落周圍會出現(xiàn)紅色環(huán)帶。4(2017·寧波期末測試)石油烴是環(huán)境的重要污染源。為了篩選出具有強分解石油烴能力的微生物，進行了一系列操作，請回答下列問題：(1)分解石油烴的微生物一般要從土壤中分離，獲取土壤樣品的取樣地點最好選在_。(2)微生物實驗室采用_法對培養(yǎng)基進行滅菌處理。A干熱滅菌 B過濾滅菌C灼燒滅菌 D高壓蒸汽滅菌(3)下圖為獲取土壤樣品后的培養(yǎng)研究過程：為了能有效地分離出分解石油烴的微生物，過程所用培養(yǎng)基的成分的特點是_，從而有利于分解石油烴的微生物的生長。(4)對進行接種常采用的兩種方法分別是_和_。(5)若發(fā)現(xiàn)在中無法區(qū)分菌落，可以將圖中取出的菌液_。(6)若實驗室為分離純化優(yōu)良菌種進行了如下操作，排序最合理的是_。A BC D(7)整個微生物的分離和培養(yǎng)的操作，一定要注意在_條件下進行。答案(1)石油污染明顯處(2)D(3)以石油烴作為唯一碳源(4)劃線分離法涂布分離法(5)進行(梯度)稀釋(6)B(7)無菌解析(1)分解石油烴的微生物在石油污染明顯處分布較多。(2)微生物實驗室常用高壓蒸汽滅菌法對培養(yǎng)基滅菌。(3)實驗過程中，過程所用培養(yǎng)基應(yīng)用石油烴作為唯一碳源，以抑制其他種類微生物的生長，從而分離出以石油烴為碳源的微生物。(4)在微生物的分離實驗中，常用劃線分離法或涂布分離法進行接種。(5)若發(fā)現(xiàn)在中無法區(qū)分菌落，可能是菌液中細菌濃度太高，可進行梯度稀釋處理后再進行接種。(6)圖示為用劃線分離法進行接種分離。接種過程中應(yīng)先在酒精燈火焰上灼燒接種環(huán)后，蘸取菌液進行接種，整個操作在酒精燈火焰旁進行，接種結(jié)束后還須在酒精燈上灼燒接種環(huán)。(7)為避免污染，整個微生物的分離和培養(yǎng)的操作，一定要注意在無菌條件下進行。課時訓(xùn)練一、選擇題1下圖為實驗室培養(yǎng)和純化大腸桿菌過程中的部分操作步驟，下列說法錯誤的是()A步驟操作時需要在酒精燈火焰旁進行B步驟中，待倒入的培養(yǎng)基冷卻后蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋C步驟中，每次劃線前后都需對接種環(huán)進行灼燒處理D劃線接種結(jié)束后，將圖平板倒置后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)答案B解析由圖可知，步驟是倒平板，步驟是用接種環(huán)蘸取菌液，步驟是進行平板劃線，步驟是培養(yǎng)。步驟操作時需要在酒精燈火焰旁進行，防止被雜菌污染，A項正確；倒完平板后應(yīng)立即蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋，冷卻后將平板倒過來放置，B項錯誤；每次劃線前后灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到單菌落，C項正確；劃線接種結(jié)束后，將平板倒置放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，有利于培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)和防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基造成污染，D項正確。2尿素是尿素分解菌的氮源，因此在配制培養(yǎng)基時()A葡萄糖在培養(yǎng)基中含量越多越好B尿素在培養(yǎng)基中含量越少越好C尿素分解菌有固氮能力，故培養(yǎng)基中的尿素為無機氮D尿素分解菌無固氮能力，故培養(yǎng)基中的尿素為有機氮答案D解析尿素既可以作為尿素分解菌的氮源，也可以作為其碳源，葡萄糖在培養(yǎng)基中并不是越多越好，葡萄糖過多會使培養(yǎng)基的滲透壓過高，影響尿素分解菌的繁殖，A錯誤；添加尿素的目的是篩選尿素分解菌，其他微生物不能很好地生活在該培養(yǎng)基上，尿素在培養(yǎng)基中不是越少越好，過少就失去了選擇作用，過多又會使細胞失水死亡，B錯誤；尿素分解菌沒有固氮能力，故培養(yǎng)基中需要添加尿素為氮源，C錯誤，D正確。3(2016·舟山中學(xué)期末測試)下列有關(guān)微生物培養(yǎng)的敘述中，不正確的是()A獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止雜菌污染B單菌落的分離是消除污染的雜菌的通用方法C培養(yǎng)基都必須使用高壓蒸汽滅菌法滅菌D倒置平板防止培養(yǎng)皿蓋上的冷凝水滴落答案C解析微生物培養(yǎng)中獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止雜菌污染，A項正確；通常可以采用涂布分離法或劃線分離法進行單菌落的分離，以消除污染的雜菌，B項正確；培養(yǎng)基通?？梢赃M行高壓蒸汽滅菌，但對于培養(yǎng)基中有高溫易分解的成分，就不能用此方法，如培養(yǎng)基中的尿素等物質(zhì)，C項錯誤；劃線接種結(jié)束后需要將培養(yǎng)皿倒置，以防止培養(yǎng)基蒸發(fā)冷凝成的水滴入培養(yǎng)基而造成污染，D項正確。4(2017·欽州期末)在做土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)實驗時，甲組實驗用氮源只含尿素的培養(yǎng)基，乙組實驗用氮源除尿素外還含硝酸鹽的培養(yǎng)基，其他成分都相同，在相同條件下操作、培養(yǎng)與觀察，則乙組實驗屬于()A空白對照 B標(biāo)準(zhǔn)對照C相互對照 D條件對照答案D解析乙組和甲組實驗的培養(yǎng)條件不同，形成了條件對照。二、非選擇題5幽門螺桿菌(Hp)感染是急慢性胃炎和消化性潰瘍的主要致病因素。在患者體內(nèi)采集樣本并制成菌液后，進行分離培養(yǎng)。實驗基本步驟如下：請回答下列問題：(1)在配制培養(yǎng)基時，要加入尿素和酚紅指示劑，這是因為Hp含有_，它能以尿素作為氮源；若有Hp，則菌落周圍會出現(xiàn)_色環(huán)帶。(2)下列對尿素溶液進行滅菌的最適方法是_滅菌。A高壓蒸汽 B紫外燈照射C70%酒精浸泡 D過濾(3)步驟X表示_。在無菌條件下操作時，先將菌液稀釋，然后將菌液_到培養(yǎng)基平面上。菌液稀釋的目的是為了獲得_菌落。(4)在培養(yǎng)時，需將培養(yǎng)皿倒置并放在_中，若不倒置培養(yǎng)，將導(dǎo)致_。(5)臨床上用14C呼氣試驗檢測人體是否感染Hp，其基本原理是Hp能將14C標(biāo)記的_分解為NH3和14CO2。答案(1)脲酶紅(2)D(3)接種涂布單(4)恒溫培養(yǎng)箱無法形成單菌落(5)尿素解析(1)幽門螺桿菌(Hp)含有脲酶，能以尿素為氮源，在加入尿素和酚紅指示劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)Hp，由于尿素經(jīng)脲酶的降解可產(chǎn)生堿性的NH3，NH3能使培養(yǎng)基中的酚紅由紅黃色變成紅色，故菌落周圍會出現(xiàn)紅色環(huán)帶。(2)由于尿素加熱會分解，對尿素溶液進行滅菌最好用G6玻璃砂漏斗過濾。(3)微生物的分離和培養(yǎng)步驟：配制培養(yǎng)基滅菌、倒平板接種培養(yǎng)。為獲得單菌落，接種操作前應(yīng)先將菌液稀釋，然后將菌液涂布到培養(yǎng)基平面上即可。(4)微生物培養(yǎng)時需將培養(yǎng)皿倒置并放在恒溫培養(yǎng)箱中，若不倒置培養(yǎng)，則無法形成單菌落。(5)幽門螺桿菌能將14C標(biāo)記的尿素分解為NH3和14CO2，故臨床上常用14C呼氣試驗檢測人體內(nèi)幽門螺桿菌的存在。6(2017·寧波三中期末)飼養(yǎng)動物常用的植物飼料中含有難溶的植酸鈣等物質(zhì)，很難被動物吸收利用，還影響對其他營養(yǎng)物質(zhì)的利用。若在飼料中添加植酸酶，則能催化其水解成為可以吸收利用的磷酸鹽等。以下是科研人員從作物根部土壤中分離出產(chǎn)植酸酶的菌株的過程示意圖。請分析作答：(1)為防止雜菌污染，要對培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿等進行_，而且須將接種后的培養(yǎng)皿呈_狀態(tài)放置。(2)接種以前進行的一系列操作，目的是在培養(yǎng)皿表面形成_。根據(jù)土壤樣品的稀釋倍數(shù)和接種稀釋液的體積，統(tǒng)計平板上的_就能大致推測出樣品中的活菌數(shù)。(3)由于植酸鈣的不溶解性，使培養(yǎng)基中形成白色渾濁。產(chǎn)植酸酶的菌株會水解植酸鈣，菌落的周圍將形成透明的區(qū)域，根據(jù)透明區(qū)域的有無，可初步判斷該菌是否產(chǎn)植酸酶，實驗結(jié)果顯示AE五種菌株中，_是產(chǎn)植酸酶的最理想菌株。(4)獲得目的菌以后，若要用于植酸酶的生產(chǎn)，還需要進行_。答案(1)(高壓蒸汽)滅菌倒置(2)單個菌落菌落數(shù)(3)E(4)擴大培養(yǎng)解析(1)為防止雜菌污染，要對培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿進行(高壓蒸汽)滅菌處理，而且須將接種后的培養(yǎng)皿呈倒置狀態(tài)放置，以防止污染。(2)接種以前對樣品進行稀釋的目的是在培養(yǎng)皿表面形成單個菌落；根據(jù)土壤樣品的稀釋倍數(shù)和接種稀釋液的體積，統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)就能大致推測出樣品中的活菌數(shù)。(3)根據(jù)題意，菌落體積越小，透明圈越大，說明產(chǎn)植酸酶越多，故E是產(chǎn)植酸酶的最理想菌株。(4)獲得目的菌后，若用于植酸酶的生產(chǎn)，還需要進行擴大培養(yǎng)。7有些細菌可分解原油，從而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同學(xué)欲從受原油污染的土壤中篩選出能高效降解原油的菌株。請回答問題：(1)在篩選過程中，應(yīng)將土壤樣品稀釋液接種于以_為唯一碳源的培養(yǎng)基上。從功能上講，該培養(yǎng)基屬于_(A.固體B液體C純化D選擇)培養(yǎng)基。(2)純化菌種時，為了得到單菌落，常采用的接種方法有兩種，即_。(3)為了篩選出高效菌株，可比較單菌落周圍透明圈的大小，透明圈越大說明該菌株的降解能力_。(4)通常情況下，在微生物培養(yǎng)過程中，實驗室常用的滅菌方法有灼燒滅菌、_和高壓蒸汽滅菌。無菌技術(shù)要求實驗操作應(yīng)在酒精燈_附近進行，以避免周圍環(huán)境中微生物的污染。答案(1)原油D(2)劃線分離法和涂布分離法(3)越強(4)干熱滅菌火焰解析(1)可以將所需要的微生物從混雜的微生物群中分離出來的培養(yǎng)基為選擇培養(yǎng)基。欲篩選出能降解原油的菌株，培養(yǎng)基中應(yīng)只含有原油而無其他碳源，這樣不能降解原油的細菌在此培養(yǎng)基上不能生存，可篩選出能分解原油的菌種。(2)分離純化菌種時，接種的方法有劃線分離法和涂布分離法，其目的都是使聚集在一起的微生物分散成單個細胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單菌落，以便于純化菌種。(3)降解原油能力越強的菌株，在菌落周圍形成的透明圈越大。(4)實驗室常用的滅菌方法有灼燒滅菌(如接種環(huán))、干熱滅菌(如培養(yǎng)皿)和高壓蒸汽滅菌(如培養(yǎng)基)等。無菌技術(shù)要求整個實驗操作都要在酒精燈火焰附近進行，以避免周圍微生物的污染。8(2016·金麗衢十校聯(lián)考)下表是3組生物實驗培養(yǎng)基。請回答下列問題：組別培養(yǎng)基a無機鹽、蔗糖、維生素和甘氨酸等有機物、水、瓊脂b葡萄糖、NaCl、K2HPO4、尿素、酚紅、水、瓊脂糖c蛋白胨、酵母提取物、NaCl、水、瓊脂(1)分離以尿素為氮源的細菌應(yīng)選用培養(yǎng)基_。在含有脲酶的細菌菌落周圍會出現(xiàn)_，這是由于尿素被分解產(chǎn)生的_使pH升高，酚紅指示劑產(chǎn)生顏色變化，從而證明這一菌株能以尿素為氮源。變色區(qū)域越大，表明該菌株利用尿素的能力_。(2)用培養(yǎng)基a進行植物組織培養(yǎng)，則培養(yǎng)基中還需加入_。一般先用_(填“發(fā)芽”或“生根”)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，使之長出較多的叢狀苗，然后將叢狀苗分株培養(yǎng)。答案(1)b紅色環(huán)帶氨越強(2)植物激素(植物生長調(diào)節(jié)劑)發(fā)芽解析(1)分離以尿素為氮源的細菌應(yīng)選用以尿素為唯一氮源并添加酚紅指示劑的培養(yǎng)基。分解尿素的微生物可產(chǎn)生脲酶，脲酶可催化尿素分解產(chǎn)生氨，氨使酚紅指示劑變紅，從而在菌落周圍形成紅色環(huán)帶，形成的紅色環(huán)帶越大，表明該菌株利用尿素的能力越強。(2)植物組織培養(yǎng)所需的MS培養(yǎng)基需加入植物激素。培養(yǎng)過程中一般先用發(fā)芽培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，使之長出較多的叢狀苗，然后將叢狀苗分株培養(yǎng)，誘導(dǎo)生根。9有機農(nóng)藥苯磺隆是一種除草劑，長期使用會污染環(huán)境，研究發(fā)現(xiàn)苯磺隆能被土壤中某些微生物降解。分離能降解苯磺隆菌株的實驗過程如下圖所示。請回答下列問題：(1)微生物生長繁殖所需的主要營養(yǎng)物質(zhì)有碳源、水、_、_四類，該實驗所用的選擇培養(yǎng)基只能以苯磺隆作為唯一碳源，其原因是_。(2)純化菌株時，通常使用的劃線工具是_。在第二次及以后劃線時，總是從上一次的末端開始劃線，這樣做的目的是_。(3)若要檢測土樣中的細菌含量，應(yīng)采用_法。答案(1)氮源無機鹽只有能利用苯磺隆的微生物能正常生長和繁殖(2)接種環(huán)將聚集的菌體逐步減少以便獲得單個菌落(3)涂布分離解析(1)微生物生長所需要的主要營養(yǎng)物質(zhì)包括碳源、氮源、水和無機鹽。使用選擇培養(yǎng)基是因為選擇培養(yǎng)基上只有能利用苯磺隆的微生物能正常生長和繁殖，同時又能抑制或阻止其他微生物的生長。(2)劃線分離法接種時常使用接種環(huán)劃線。在第二次及以后劃線時，總是從上一次的末端開始劃線。這樣做的目的是將聚集的菌體逐步減少以便獲得單個菌落。(3)涂布分離法常常用來進行微生物的分離和計數(shù)。10某研究小組研究了不同濃度的土霉素(一種抗生素)對大腸桿菌生長的影響，實驗結(jié)果見圖1。(1)實驗結(jié)果表明，對大腸桿菌抑制作用最明顯的是濃度為_(圖1中數(shù)字)的土霉素。(2)該實驗中，接種大腸桿菌時所使用的接種方法是_，在培養(yǎng)和接種大腸桿菌時要特別注意進行_操作。為更好地體現(xiàn)土霉素對大腸桿菌的抑制作用，實驗中還應(yīng)增加一組_作為空白對照。為了嚴格控制土霉素的劑量，對圓紙片的要求是_。為減少實驗誤差，每一濃度的土霉素還要制備_。(3)長期大量使用土霉素容易引起大腸桿菌產(chǎn)生抗藥性，這一過程的實質(zhì)是大腸桿菌種群的_發(fā)生了變化。(4)該研究小組運用上述實驗方法研究了相同濃度的A、B、C三種不同抗生素對大腸桿菌生長的影響。請在圖2中表示這一處理方案(可模仿圖1加以必要的注解)。答案(1)(2)涂布分離法無菌用無菌水浸泡的圓紙片大小、質(zhì)地相同多個圓紙片(3)抗藥性基因頻率(4)如圖所示解析(1)據(jù)圖1分析，號圓紙片的抑菌圈最大，說明該濃度的土霉素對大腸桿菌抑制作用最明顯。(2)圖中接種大腸桿菌時所使用的接種方法是涂布分離法。接種和培養(yǎng)大腸桿菌的關(guān)鍵是無菌操作。該實驗要遵循對照原則，故還應(yīng)該增加一組用無菌水浸泡的圓紙片作為空白對照。圓紙片的大小、質(zhì)地屬于無關(guān)變量，應(yīng)該相同或一致。為減少實驗誤差，每一濃度的土霉素還要制備多個圓紙片進行重復(fù)實驗。(3)長期大量使用土霉素容易引起大腸桿菌產(chǎn)生抗藥性，這一過程的實質(zhì)是大腸桿菌種群發(fā)生進化，其抗藥性基因頻率發(fā)生了變化。(4)該方案的自變量為相同濃度的A、B、C三種不同抗生素，注意在圖中要標(biāo)記清楚，具體圖解見答案。20