《外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)》ppt.ppt

大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢全基因組測序 共有4405個開放型閱讀框架基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善繁殖迅速 培養(yǎng)簡單 操作方便 遺傳穩(wěn)定被美國FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物 大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素 外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的原理啟動子終止子核糖體結(jié)合位點(diǎn)密碼子質(zhì)粒拷貝數(shù) 轉(zhuǎn)錄 翻譯 Ptac 3Ptrp 11Plac 啟動子 轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理具有多順反子結(jié)構(gòu) 基因排列次序?yàn)?啟動子 lacP 操縱基因 lacO 結(jié)構(gòu)基因 lacZ lacY lacA 正調(diào)節(jié)因子CAP負(fù)調(diào)節(jié)因子lacI 啟動子 Lac表達(dá)系統(tǒng)以大腸桿菌lac操縱子調(diào)控機(jī)理為基礎(chǔ)設(shè)計 構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng) lacIPlaclacOlacZlacYlacA lacIPlaclacOlacZlacYlacA Lac表達(dá)系統(tǒng)正調(diào)節(jié)因子CAPcAMP激活CAP CAP cAMP復(fù)合物與lac操縱子上專一位點(diǎn)結(jié)合后 能促進(jìn)RNA聚合酶與 35 10序列的結(jié)合 進(jìn)而促進(jìn)Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄 基因工程中使用的lac啟動子均為抗葡萄糖代謝阻遏的突變型 即PlacUV5 Lac表達(dá)系統(tǒng)lacUV5突變體PlacUV5突變體能夠在沒有CAP存在的情形下非常有效的起始轉(zhuǎn)錄 受它控制的基因在轉(zhuǎn)錄水平上只受lacI的調(diào)控 因此用它構(gòu)建的表達(dá)載體在使用時比野生型Plac更易操作 Lac表達(dá)系統(tǒng)負(fù)調(diào)節(jié)因子lacI在無誘導(dǎo)物情形下 lacI基因產(chǎn)物形成四聚體阻遏蛋白 與啟動子下游的操縱基因緊密結(jié)合 阻止轉(zhuǎn)錄的起始 lacIPlaclacOlacZlacYlacA lacIPlaclacOlacZlacYlacA Tac表達(dá)系統(tǒng)tac啟動子是由trp的 35序列和lacUV5的 10序列拼接而成的雜合啟動子 調(diào)控模式與lacUV5相似 但mRNA轉(zhuǎn)錄水平更高于trp和lacUV5啟動子 Ptac 3Ptrp 11Plac 因此在要求有較高基因表達(dá)水平的情況下 選用tac啟動子比用lacUV5啟動子更優(yōu)越 lac tac啟動子對宿主菌的要求在普通大腸桿菌中 LacI阻遏蛋白僅能滿足細(xì)胞染色體上lac操縱子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的需要 當(dāng)多拷貝的lacO隨著帶有l(wèi)acUV5 tac啟動子的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌后 LacI阻遏蛋白與lacO的比例顯著下降 無法保證每一個lacO都能獲得足夠的LacI阻遏蛋白參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控 表現(xiàn)為在無誘導(dǎo)物存在的情形下 lacUV5 tac啟動子有較高的本底轉(zhuǎn)錄 lac tac啟動子對宿主菌的要求為了使以Lac Tac表達(dá)系統(tǒng)具有嚴(yán)緊調(diào)控外源基因轉(zhuǎn)錄的能力 一種能產(chǎn)生過量的LacI阻遏蛋白的lacI基因的突變體lacIq被應(yīng)用于表達(dá)系統(tǒng) 大腸桿菌JM109等菌株的基因型均為lacIq 常被選用為Lac Tac表達(dá)系統(tǒng)的宿主菌 但是這些菌株也只能對低拷貝的表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)嚴(yán)緊調(diào)控 在使用高拷貝復(fù)制子構(gòu)建表達(dá)載體時 仍能觀察到較高水平的本底轉(zhuǎn)錄 需在表達(dá)載體中插入lacIq基因以保證有較多的LacI阻遏蛋白產(chǎn)生 lac tac表達(dá)系統(tǒng)存在的問題IPTG用于誘導(dǎo)lac tac啟動子的轉(zhuǎn)錄 但由于IPTG本身具有一定的毒性 從安全角度 對表達(dá)和制備用于醫(yī)療目的的重組蛋白并不適合 一些國家規(guī)定在生產(chǎn)人用重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)工藝中不能使用IPTG解決方法lac和tac啟動子的轉(zhuǎn)錄受溫度嚴(yán)緊調(diào)控乳糖替代IPTG誘導(dǎo)lac和tac啟動子的轉(zhuǎn)錄 lac tac表達(dá)系統(tǒng)存在的問題lac和tac啟動子的轉(zhuǎn)錄受溫度嚴(yán)緊調(diào)控把阻遏蛋白LacI的溫度敏感突變體lacI ts lacIq ts 插入表達(dá)載體或整合到染色體后 均能使lac和tac啟動子的轉(zhuǎn)錄受到溫度嚴(yán)緊調(diào)控在較低溫度 30 時抑制 在較高溫度 42 時開放 用乳糖替代IPTG誘導(dǎo)lac和tac啟動子的轉(zhuǎn)錄乳糖在b 半乳糖苷酶作用下生成異乳糖 異乳糖具有誘導(dǎo)劑的作用這一過程涉及乳糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)化 其效率受到多種因素的影響和制約因此乳糖誘導(dǎo)的有效劑量大大高于IPTG 乳糖本身作為一種碳源可以被大腸桿菌代謝利用 較多的乳糖存在也會導(dǎo)致菌體生理及生長特性變化 乳糖替代lPTG作為誘導(dǎo)劑的研究要與發(fā)酵工藝結(jié)合起來 才能顯示其良好的前景 轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理色氨酸啟動子Ptrp受色氨酸 阻遏蛋白復(fù)合物的阻遏 轉(zhuǎn)錄呈基底狀態(tài) 在培養(yǎng)系統(tǒng)中去除色氨酸或者加入3 吲哚丙烯酸 IAA 便可有效地解除阻遏抑制作用 在正常的細(xì)菌培養(yǎng)體系中 除去色氨酸是困難的 因此基因工程中往往添加IAA誘導(dǎo)Ptrp介導(dǎo)的目的基因表達(dá) 啟動子 Trp表達(dá)系統(tǒng)以大腸桿菌trp操縱子調(diào)控機(jī)理為基礎(chǔ)設(shè)計 構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng) Trp表達(dá)系統(tǒng) PL和PR表達(dá)系統(tǒng)以l噬菌體早期轉(zhuǎn)錄啟動子PL PR為核心構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)在野生型l噬菌體中 PL PR啟動子轉(zhuǎn)錄與否決定了l噬菌體進(jìn)入裂解循環(huán)還是溶源循環(huán) 啟動子 PL和PR表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理由l噬菌體PE啟動子控制的cI基因的產(chǎn)物是PL PR啟動子轉(zhuǎn)錄的阻遏物 cI基因的產(chǎn)物在大腸桿菌宿主中的濃度取決于一系列宿主與噬菌體因子之間的錯綜復(fù)雜的平衡關(guān)系 由于通過細(xì)胞因子來控制cI基因產(chǎn)物的產(chǎn)生和消失是相當(dāng)困難的 因此PL PR表達(dá)系統(tǒng)都選用溫度敏感突變體cI857 ts 的基因產(chǎn)物來調(diào)控PL PR啟動子的轉(zhuǎn)錄 在較低溫度 30 時以活性形式存在在較高溫度 42 時失活脫落 PL和PR表達(dá)系統(tǒng)宿主菌中沒有cI基因產(chǎn)物 PL PR啟動子的高強(qiáng)度直接轉(zhuǎn)錄 帶有PL或PR啟動子的表達(dá)載體在普通大腸桿菌中相當(dāng)不穩(wěn)定 對宿主菌的要求用溶源化l噬菌體的大腸桿菌作PL PR啟動子表達(dá)載體的宿主菌N4830 1 POP2136等菌株已經(jīng)溶源化cI857 ts l噬菌體 可用作表達(dá)外源基因時的宿主菌 把cI857 ts 基因組裝在表達(dá)載體上宿主菌選擇范圍更大 PL和PR表達(dá)系統(tǒng)存在的問題由于PL和PR表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)時不加化學(xué)誘導(dǎo)劑 成本又低廉 最初幾個在大腸桿菌中制備的藥用重組蛋白質(zhì)都采用PL或PR表達(dá)系統(tǒng) 缺陷在熱脈沖誘導(dǎo)過程中 大腸桿菌熱休克蛋白的表達(dá)也會被激活 其中一些是蛋白水解酶 有可能降解所表達(dá)的重組蛋白 在大體積發(fā)酵培養(yǎng)菌體時 通過熱平衡交換方式把培養(yǎng)溫度從30 提高到42 需要較長的時間 這種緩慢的升溫方式影響誘導(dǎo)效果 對重組蛋白表達(dá)量有一定的影響 T7表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌T7噬菌體具有一套專一性非常強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄體系 利用這一體系中的元件為基礎(chǔ)構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)稱為T7表達(dá)系統(tǒng) T7表達(dá)系統(tǒng)T7噬菌體基因1編碼的T7RNA聚合酶選擇性的激活T7噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄 T7RNA聚合酶活性高 其合成RNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍左右 并可以轉(zhuǎn)錄某些不能被大腸桿菌RNA聚合酶有效轉(zhuǎn)錄的序列 在細(xì)胞中存在T7RNA聚合酶和T7噬茵體啟動子的情形下 大腸桿菌宿主本身基因的轉(zhuǎn)錄競爭不過T7噬菌體轉(zhuǎn)錄體系 最終受T7噬菌體啟動子控制的基因的轉(zhuǎn)錄達(dá)到很高的水平 T7表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理T7噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄完全依賴于T7RNA聚合酶 因此T7RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式就決定了表達(dá)系統(tǒng)的調(diào)控方式 化學(xué)誘導(dǎo)型溫度誘導(dǎo)型雙質(zhì)粒系統(tǒng) T7表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理化學(xué)誘導(dǎo)型噬菌體DE3是l噬菌體的衍生株 一段含有l(wèi)acI lacUV5啟動子和T7RNA聚合酶基因的DNA片段被插入其int基因中用噬菌體DE3的溶源菌作為表達(dá)載體的宿主菌 調(diào)控方式為化學(xué)誘導(dǎo)型 類似于Lac表達(dá)系統(tǒng) T7RNA聚合酶基因 lac啟動子 E Coli DE3 IPTG誘導(dǎo) T7表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理溫度誘導(dǎo)型PL啟動子控制T7RNA聚合酶基因 通過熱誘導(dǎo)方式激發(fā)T7噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄 這種方式可以使本底轉(zhuǎn)錄降到很低的水平 尤其適用于表達(dá)對大腸桿菌宿主有毒性的重組蛋白質(zhì) T7RNA聚合酶基因 PL啟動子 E Coli CE6 熱誘導(dǎo) cI857 T7表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理雙質(zhì)粒系統(tǒng)一個質(zhì)粒帶有T7RNA聚合酶基因 另一個質(zhì)粒帶有T7啟動子和目的基因兩個質(zhì)粒的復(fù)制子和抗性標(biāo)記不能相同調(diào)控方式為控制T7RNA聚合酶的啟動子調(diào)控類型 熱誘導(dǎo) T7表達(dá)系統(tǒng)存在的問題T7表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的基因的水平是目前所有表達(dá)系統(tǒng)中最高的 但也不可避免出現(xiàn)在相對較高的本底轉(zhuǎn)錄 如果目的基因產(chǎn)物對大腸桿菌宿主有毒性 會影響細(xì)胞的生長 解決辦法之一在表達(dá)系統(tǒng)中低水平表達(dá)T7溶菌酶基因 因?yàn)門7溶菌酶除了作用于大腸桿菌細(xì)胞壁上肽聚糖外 還能與T7RNA聚合酶結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄的活性 目前T7溶菌酶基因都通過共轉(zhuǎn)化質(zhì)拉導(dǎo)入表達(dá)系統(tǒng) 它能明顯降低本底轉(zhuǎn)錄 但對誘導(dǎo)后目的基因的表達(dá)水平無明顯影響 營養(yǎng)調(diào)控型采用大腸桿菌堿性磷酸酯酶基因phoA啟動子或甘油3 磷酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)ugp啟動子構(gòu)建表達(dá)載體 這兩個啟動子受在培養(yǎng)基中的無機(jī)磷 Pi 濃度調(diào)控 Pi 5mmol L時抑制 Pi 1mmol L時激活 具有較高的轉(zhuǎn)錄水平 其他表達(dá)系統(tǒng) 糖原調(diào)控型采用的有大腸桿菌半乳糖轉(zhuǎn)移系統(tǒng) mglBAEC mgl啟動子或沙門氏菌阿拉伯糖基因araB啟動子構(gòu)建表達(dá)載體 這兩個啟動子受葡萄糖抑制 巖藻糖和阿拉伯糖是它們的誘導(dǎo)物 其調(diào)控機(jī)理類似于Lac表達(dá)系統(tǒng) 其他表達(dá)系統(tǒng) pH調(diào)控型采用大腸桿菌賴氨酸脫羧酶基因cadA啟動子構(gòu)建表達(dá)載體 cadA啟動子受培養(yǎng)基中H 濃度 即pH值調(diào)控 在pH 8時抑制 pH 6時激活 pH 6時轉(zhuǎn)錄活力最高 該表達(dá)系統(tǒng)要求菌體發(fā)酵溫度控制在27 30 之間才能使目的基因得到穩(wěn)定的表達(dá) 其他表達(dá)系統(tǒng) 溶氧調(diào)控型采用大腸桿菌丙酮酸甲酸裂解酶基因pfl啟動子 硝基還原酶基因nirB啟動子或透明顫菌血紅蛋白基因vgb啟動子構(gòu)建表達(dá)載體 這些啟動子中都含有對氧響應(yīng)的調(diào)節(jié)因子fnr的作用位點(diǎn) 在富氧條件下轉(zhuǎn)錄被抑制 在貧氧或微氧條件下轉(zhuǎn)錄被激活 其他表達(dá)系統(tǒng) 溶氧調(diào)控型大腸桿菌GJ100有透明顫菌血紅蛋白基因 vgb 啟動子控制下的T7RNA聚合酶基因表達(dá)質(zhì)粒 vgb基因的轉(zhuǎn)錄是受環(huán)境溶氧濃度調(diào)控的 在貧氧條件下vgb基因的啟動子被激活 因此 用大腸桿菌GJ100作為宿主時 表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控方式為貧氧誘導(dǎo)型 菌體發(fā)酵時的溶氧濃度可以通過控制攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量加以調(diào)節(jié) 與其他調(diào)控模式相比更適合于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過程 其他表達(dá)系統(tǒng) 生物素調(diào)控型用大腸桿菌生物素操縱子及其調(diào)控區(qū)構(gòu)建表達(dá)載體 菌體生長過程中生物素會不斷消耗 當(dāng)濃度到達(dá)2ng ml以下時啟動子被激活 能夠在沒有外界的物理 化學(xué)信號的介入條件下自動誘導(dǎo)表達(dá)目的基因是這類表達(dá)載體的特點(diǎn) 其缺陷是不容易精確控制自動誘導(dǎo)的時刻 其他表達(dá)系統(tǒng) 強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄終止的必要性外源基因在強(qiáng)啟動子的控制下表達(dá) 容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象 即RNA聚合酶滑過終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的DNA序列 形成長短不一的mRNA混合物過長轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會影響外源基因的表達(dá) 其原因如下 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄一分子mRNA所需的時間就相應(yīng)增加 外源基因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降 如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或DNA功能區(qū)域 如選擇性標(biāo)記基因和復(fù)制子結(jié)構(gòu)等 則RNA聚合酶在此處的轉(zhuǎn)錄可能干擾質(zhì)粒的復(fù)制及其它生物功能 甚至導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性 過長的mRNA往往會產(chǎn)生大量無用的蛋白質(zhì) 增加工程菌無謂的能量消耗 更為嚴(yán)重的是 過長的轉(zhuǎn)錄物往往不能形成理想的二級結(jié)構(gòu) 從而大大降低外源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率 終止子 強(qiáng)終止子的選擇與使用目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子是來自大腸桿菌rRNA操縱子上的rrnT1T2以及T7噬菌體DNA上的Tf 對于一些終止作用較弱的終止子 通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu) 以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄終止作用 終止子 核糖體結(jié)合位點(diǎn)外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動的頻率 而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關(guān) 大腸桿菌細(xì)胞中結(jié)構(gòu)不同的mRNA分子具有不同的翻譯效率 它們之間的差別有時可高達(dá)數(shù)百倍 mRNA翻譯的起始效率主要由其5 端的結(jié)構(gòu)序列所決定 稱為核糖體結(jié)合位點(diǎn) RBS 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 核糖體結(jié)合位點(diǎn)大腸桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)包括下列四個特征結(jié)構(gòu)要素 位于翻譯起始密碼子上游的6 8個核苷酸序列5 UAAGGAGG3 即Shine Dalgarno SD 序列 它通過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的16SrRNA3 端區(qū)域3 AUUCCUCC5 并與之專一性結(jié)合將mRNA定位于核糖體上 從而啟動翻譯 翻譯起始密碼子 大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀框架的起始位點(diǎn) 有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯起始密碼子SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成基因編碼區(qū)5 端若干密碼子的堿基序列 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 核糖體結(jié)合位點(diǎn)對外源基因表達(dá)的影響SD序列的影響一般來說 mRNA與核糖體的結(jié)合程度越強(qiáng) 翻譯的起始效率就越高 而這種結(jié)合程度主要取決于SD UAAGGAGG 序列與16SrRNA的堿基互補(bǔ)性 其中以GGAG四個堿基序列尤為重要 對多數(shù)基因而言 上述四個堿基中任何一個換成C或T 均會導(dǎo)致翻譯效率大幅度降低 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 核糖體結(jié)合位點(diǎn)對外源基因表達(dá)的影響SD序列與起始密碼子之間的序列的影響SD序列下游的堿基若為AAAA或UUUU 翻譯效率最高 而CCCC或GGGG的翻譯效率則分別是最高值的50 和25 緊鄰AUG的前三個堿基成份對翻譯起始也有影響 對于大腸桿菌b 半乳糖苷酶的mRNA而言 在這個位置上最佳的堿基組合是UAU或CUU 如果用UUC UCA或AGG取代之 則酶的表達(dá)水平低20倍 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 核糖體結(jié)合位點(diǎn)對外源基因表達(dá)的影響SD序列與起始密碼子之間的距離的影響SD序列與起始密碼子AUG之間的精確距離保證了mRNA在核糖體上定位后 翻譯起始密碼子AUG正好處于核糖體復(fù)合物結(jié)構(gòu)中的P位 這是翻譯啟動的前提條件 在很多情況下 SD序列位于AUG之前大約七個堿基處 在此間隔中少一個堿基或多一個堿基 均會導(dǎo)致翻譯起始效率不同程度的降低 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 核糖體結(jié)合位點(diǎn)對外源基因表達(dá)的影響起始密碼子及其后續(xù)若干密碼子的影響大腸桿菌中的起始tRNA分子可以同時識別AUG GUG和UUG三種起始密碼子 但其識別頻率并不相同 通常GUG為AUG的50 而UUG只及AUG的25 除此之外 從AUG開始的前幾個密碼子堿基序列也至關(guān)重要 至少這一序列不能與mRNA的5 端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu) 否則便會嚴(yán)重干擾mRNA在核糖體上的準(zhǔn)確定位目前廣泛用于外源基因表達(dá)的大腸桿菌表達(dá)型質(zhì)粒上 均含有與啟動子來源相同的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列 序列和間隔是最佳的 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 不同的生物 甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因 對簡并密碼子使用頻率并不相同 具有一定的偏愛性 其決定因素是 生物基因組中的堿基含量在富含AT的生物 如單鏈DNA噬菌體 X174 基因組中 密碼子第三位上的U和A出現(xiàn)的頻率較高 在GC豐富的生物 如鏈霉菌 基因組中 第三位上含有G或C的簡并密碼子占90 以上的絕對優(yōu)勢密碼子與反密碼子相互作用的自由能性中等強(qiáng)度規(guī)律如GGG CCC GCG GGC AAA UUU AUA UAU等使用少如GUG CAC UCG AGC ACA UGU AUC UUG等使用多細(xì)胞內(nèi)tRNA的含量 密碼子 生物體對密碼子的偏愛性 密碼子 密碼子偏愛性對外源基因表達(dá)的影響由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大程大的差異性 因此外源基因尤其是高等哺乳動物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個重要因素是密碼子的正確選擇 一般而言 有兩種策略可以使外源基因上的密碼子在大腸桿菌細(xì)胞中獲得最佳表達(dá) 外源基因全合成同步表達(dá)相關(guān)tRNA編碼基因 質(zhì)?？截悢?shù) 質(zhì)?？截悢?shù)對細(xì)菌生長代謝的影響目前實(shí)驗(yàn)室里廣泛使用的表達(dá)型質(zhì)粒在每個大腸桿菌細(xì)胞中可達(dá)數(shù)百甚至上千個拷貝 質(zhì)粒的擴(kuò)增過程通常發(fā)生在受體細(xì)胞的對數(shù)生長期內(nèi) 而此時正是細(xì)菌生理代謝最旺盛的階段 質(zhì)粒分子的過度增殖以及其后目的基因的高效表達(dá)勢必會影響受體細(xì)胞的生長代謝 進(jìn)而導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀表達(dá)水平的下降解決上述難題的一種有效策略是將重組質(zhì)粒的擴(kuò)增納入可控制的軌道 蛋白質(zhì)的合成是在細(xì)胞之中進(jìn)行的目標(biāo)蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的主要優(yōu)點(diǎn)是 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建比較簡單 能夠達(dá)到很高的目標(biāo)蛋白表達(dá)量 一般可以達(dá)到占細(xì)胞總蛋白的20 40 目標(biāo)蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)的形式有二種 在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)為不溶性的包涵體顆粒包涵體存在于大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)為可溶性的蛋白質(zhì)可溶性的目標(biāo)蛋白質(zhì)除可存在于細(xì)胞質(zhì)中外 還可借助于本身的功能序列和大腸桿菌蛋白質(zhì)加工 運(yùn)輸體系 最終分泌到周質(zhì)空間 或外泌到培養(yǎng)液中 大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建策略包涵體型異源蛋白的表達(dá)分泌型異源蛋白的表達(dá)融合型異源蛋白的表達(dá)寡聚型異源蛋白的表達(dá)整合型異源蛋白的表達(dá)蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 包涵體及其性質(zhì)在某些生長條件下 大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子 它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi) 或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu) 這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體 InclusionBodies IB 富含蛋白質(zhì)的包涵體多見于生長在含有氨基酸類似物培養(yǎng)基的大腸桿菌細(xì)胞中 由這些氨基酸類似物所合成的蛋白質(zhì)往往會喪失其理化特性和生物功能 從而集聚形成包涵體 由高效表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的大腸桿菌工程菌大量合成非天然性的同源或異源蛋白質(zhì) 后者在一般情況下也以包涵體的形式存在于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi) 除此之外 包涵體中還含有少量的DNA RNA和脂多糖等非蛋白分子 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)包涵體表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)在一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定能夠避免細(xì)胞內(nèi)蛋白水解酶的作用 有利于目標(biāo)蛋白的富集簡化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離操作包涵體的水難溶性及其密度遠(yuǎn)大于其它細(xì)胞碎片和細(xì)胞成分 菌體經(jīng)超聲波裂解后 直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細(xì)菌裂解物中分離出來能夠表達(dá)對大腸桿菌宿主有毒或有致死效應(yīng)的目標(biāo)蛋白 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)包涵體表達(dá)形式的缺點(diǎn)以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失了原有的生物活性 必須通過有效的變性復(fù)性操作 才能回收得到具有正確空間構(gòu)象 因而具有生物活性 的目標(biāo)蛋白 因此包涵體變復(fù)性操作的效率對目標(biāo)產(chǎn)物的收率至關(guān)重要 經(jīng)過復(fù)性處理的目標(biāo)蛋白不一定能完全恢復(fù)原來的生物學(xué)活性 有時甚至完全得不到有活性的蛋白蛋 尤其當(dāng)目標(biāo)蛋白分子中的Cys殘基數(shù)目較高時 體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當(dāng)?shù)?一般不超過30 復(fù)性處理工藝可使目標(biāo)蛋白的制備成本上升 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 包涵體的變性與復(fù)性操作包涵體的溶解與變性包涵體的溶解與變性的主要任務(wù)是拆開錯配的二硫鍵和次級鍵 在人工條件下 使包涵體溶解并重新進(jìn)入復(fù)性途徑中 能有效促進(jìn)包涵體溶解變性的試劑和條件包括 清洗劑SDS 正十二醇肌氨酸 廉價 但影響復(fù)性和純化促溶劑鹽酸胍 尿素 前者昂貴 尿素便宜 但常被自發(fā)形成的氰酸鹽污染 后者能與多肽鏈中的氨基反應(yīng)混合溶劑如尿素與醋酸 二甲基砜等聯(lián)合使用 溶解力增強(qiáng)極端pH廉價 但許多蛋白質(zhì)在極端pH條件下發(fā)生修飾反應(yīng) 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 包涵體的變性與復(fù)性操作包涵體的復(fù)性與重折疊 refolding 包涵體的復(fù)性與重折疊的主要任務(wù) 將多肽鏈中被拆開的游離巰基重新折疊通過次級鍵的形成使蛋白質(zhì)復(fù)性 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)為可溶性的蛋白質(zhì)目標(biāo)蛋白以可溶性蛋白質(zhì)形式表達(dá)雖然可以避免包涵體復(fù)性帶來的問題 但是也有一定的缺陷 主要表現(xiàn)為大腸桿菌本身存在于細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)往往只含有少量的 甚至沒有半胱氨酸殘基 富含半胱氨酸殘基 需要形成二硫鍵的蛋白質(zhì)大部份被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞的其他部位 分泌型異源蛋白的表達(dá) 這是因?yàn)榇竽c桿菌細(xì)胞質(zhì)微環(huán)境的氧化還原態(tài)勢不利于蛋白質(zhì)二硫鍵的形成 而且缺少一種形成二硫鍵所必須的體系 一些需要通過二硫鍵的形成來維持其構(gòu)象的目標(biāo)蛋白在大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)中往往不能正確折疊 解決這一問題的途徑之一是用大腸桿菌氧硫還蛋白還原酶基因trxB缺陷株作為宿主菌表達(dá)目標(biāo)蛋白 研究表明trxB缺陷株細(xì)胞質(zhì)的氧化還原態(tài)勢發(fā)生了變化 蛋白質(zhì)在trxB缺陷株的細(xì)胞質(zhì)中能夠形成二硫鍵 這一菌株對于表達(dá)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)而言是一 個相當(dāng)重要的工具 分泌型異源蛋白的表達(dá) 在細(xì)胞質(zhì)中直接表達(dá)不帶有前導(dǎo)序列的成熟蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中直接表達(dá)不帶有前導(dǎo)序列的成熟蛋白質(zhì)需要起始密碼 通常為編碼甲硫氨酸的ATG 在多數(shù)情況下 N端附加的甲硫氨酸對蛋白質(zhì)的性質(zhì)沒有特別的影響 但是也有附加的甲硫氨酸嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)生物學(xué)活力的報道 另外 附加的甲硫氨酸也可能改變蛋白質(zhì)的免疫性質(zhì)和藥理性質(zhì) 從制備用于醫(yī)療目的的蛋白質(zhì)的角度來看 這是一個需要引起重視的問題 去除附加的甲硫氨酸有二種方法 在表達(dá)系統(tǒng)中共表達(dá)甲硫氨酸氨肽酶基因 在分離純化后在體外用外肽酶處理 但它們都對與甲硫氨酸相鄰的氨萊酸殘基類型有一定要求 因此在使用上有一定的限制 目標(biāo)蛋白與有親合配基的序列融合表達(dá)與純化包涵體相比 細(xì)胞質(zhì)中以可溶性形式表達(dá)蛋白質(zhì)的分離純化過程比較復(fù)雜 一般要通過親合層析才能達(dá)到比較高的純度 目標(biāo)蛋白與有親合配基的序列融合表達(dá)既可以提高分離純化的效率 又能在融合蛋白切離的過程中得到?jīng)]有附加甲硫氨酸目標(biāo)蛋白 金黃色葡萄球菌蛋白G A和衍生物Z 日本血吸蟲谷胱甘肽 S 轉(zhuǎn)移酶 大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白 His tag等是目前常用的與目標(biāo)基因融合表達(dá)的序列 目標(biāo)蛋白在周質(zhì)空間中表達(dá)目標(biāo)蛋白在周質(zhì)空間中表達(dá)的優(yōu)點(diǎn) 大腸桿菌周質(zhì)空間中自身蛋白質(zhì)的數(shù)量約為100種 只占菌體總蛋白數(shù)量的4 蛋白水解酶的含最與在細(xì)胞質(zhì)中相比也少得多 因此目標(biāo)蛋白在周質(zhì)空間中表達(dá)有利于分離純化和減少蛋白水解酶的降解 目標(biāo)蛋白從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)空間過程中信號肽被加工切除 有效地避免了N端附加的甲硫氨酸的產(chǎn)生 周質(zhì)空間中呈氧化型的氧化還原態(tài)勢使目標(biāo)蛋白能夠較好折疊 維持正確的構(gòu)象 目標(biāo)蛋白外泌表達(dá)把所表達(dá)的目標(biāo)蛋白外泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中可以進(jìn)一步減少蛋白水解酶的降解 也有利于分離純化 目前成功的例子主要是采用以下方案 1 與大腸桿菌本身的外泌蛋白基因融合表達(dá) 2 與一些能提高細(xì)胞外膜通透性的因子融合或共表達(dá) 3 改變培養(yǎng)基的成分歸納現(xiàn)有的研究結(jié)果顯示這些方法僅對外泌分子量較小的蛋白有效 而且外泌效率一般都比較低 四 高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計共表達(dá)大腸桿菌稀有密碼子tRNA基因提高目標(biāo)基因mRNA和目標(biāo)基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性高密度發(fā)酵和工程化宿主細(xì)胞 四 高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計在各種表達(dá)載體中 啟動子和SD序列的下游都設(shè)計了一段含有各種限制性酶切位點(diǎn)的序列 用于目標(biāo)基因的插入 這一插入位點(diǎn)附近的序列將成為核糖體結(jié)合位點(diǎn)的一部分 因此它對于構(gòu)建高效表達(dá)質(zhì)粒是至關(guān)重要的 由于每一個基因都具有各自獨(dú)特的5 端結(jié)構(gòu) 最終構(gòu)建成的各種表達(dá)質(zhì)粒所具有的核糖體結(jié)合位點(diǎn)是一個變量 四 高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時首先要考慮使目標(biāo)基因的翻譯起始密碼ATG與SD序列之間的距離和堿基組成處于一個適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi) 核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列的變化對mRNA的翻譯效率有顯著影響 具體表現(xiàn)為 SD序列UAAGGAGG的翻譯效率要比AAGGA高3 6倍翻譯起始密碼ATG與UAAGGAGG的最適距離是6 8個堿基長度 與AAGAA的最適距離是5 7個堿基長度ATG與UAAGGAGG至少相隔3 4個堿基 與AAGAA至少相隔5個堿基 mRNA的翻譯才能進(jìn)行ATG與SD序列之間的堿基組成為A T堿基豐富時 mRNA翻譯效率較高 核糖體結(jié)合位點(diǎn)本身和附近的序列決定了目標(biāo)基因mRNA5 端的二級結(jié)構(gòu) 研究表明討mRNA5 端形成的 莖環(huán) 結(jié)構(gòu)阻礙了mRNA與核糖體30S亞基的結(jié)合 從而抑制了翻譯的起始 盡量提高核糖體結(jié)合位點(diǎn)本身和附近的序列中A T堿基的含量 降低mRNA5 端形成的 莖環(huán) 結(jié)構(gòu)的可能性 也是構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時需要注意的事項(xiàng) 在必要的情況下 還可通過定點(diǎn)突變 PCR等技術(shù)改變個別關(guān)鍵的堿基來破壞mRNA5 端的 莖環(huán) 結(jié)構(gòu) 把目標(biāo)基因設(shè)計成多順反子結(jié)構(gòu) 在大腸桿菌本身的高效翻譯起始元件后加上第二個SD序列和目標(biāo)基因 一起插入表達(dá)載體 這一方法通常適用于目標(biāo)基因5 端序列容易形成二級結(jié)構(gòu) 而又不宜改變其序列的情形下 表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計在構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時 充分利用各個基因的結(jié)構(gòu)特征和特點(diǎn) 注意引入翻譯增強(qiáng)子序列能提高mRNA翻譯效率的特殊核苷酸序列 稱為翻譯增強(qiáng)子 四 高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 共表達(dá)大腸桿菌稀有密碼子tRNA基因表達(dá)水平高的基因呈現(xiàn)的密碼子偏愛性高于表達(dá)水平低的基因 現(xiàn)已闡明的在大腸桿菌中的稀有密碼子有 編碼Arg的密碼子AGA AGG CGA CGG編碼Pro的密碼子CCC CCU CCA編碼Cys的密碼子UGU UGC 編碼Gly的密碼子GGA GGG編碼Leu的密碼子CUA CUC編碼Ile的密碼子AUA編碼Ser的密碼子UCA AUG UCG UCC編碼Thr的密碼子ACA 四 高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 共表達(dá)大腸桿菌稀有密碼子tRNA基因由于同義密碼子的使用頻率與細(xì)胞內(nèi)對應(yīng)的tRNA的豐度有正比關(guān)系稀有密碼子對應(yīng)的tRNA的豐度很低 有可能在翻譯過程中發(fā)生中止和移碼突變 解決這一問題的辦法 通過基因突變把稀有密碼子改變?yōu)槠渌褂妙l率高的同義密碼子 在表達(dá)系統(tǒng)中共表達(dá)稀有密碼子tRNA基因 以提高大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)稀有密碼子tRNA的豐度 四 高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 在所有的大腸桿菌稀有密碼子tRNA中 tRNAArg AGG AGA 含量最少 而AGG和AGA密碼子在真核基因中經(jīng)常出現(xiàn) 人尿激酶原ProUK 新型組織纖溶酶原激活劑NTA等基因中都含有較多的AGG和AGA密碼子 在大腸桿菌中直接表達(dá)的水平很低 但在大腸桿菌中共表達(dá)tRNAArg AGG AGA 基因argU后 這些基因的表達(dá)水平能明顯得到提高 現(xiàn)在還沒有一個固定規(guī)則來判定稀有密碼子的存在是否確實(shí)會對翻譯過程產(chǎn)生明顯的不利影響 因?yàn)橄∮忻艽a子存在的位置 分布的均勻性 mRNA的二級結(jié)構(gòu)的不同決定了它對翻譯過程的影響是有差別的 所有的結(jié)論要通過實(shí)驗(yàn)才能得出 四 高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 提高目標(biāo)基因mRNA和目標(biāo)基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性由于大腸桿菌防御體系的自身保護(hù)作用 大腸桿菌中的核酸酶和蛋白水解酶能夠降解目標(biāo)基因mRNA和目標(biāo)基因產(chǎn)物 這種降解作用程度對不同的基因或蛋白質(zhì)而言是不同的 具有一定的專一性和選擇性 四 高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 蛋白水解酶的特點(diǎn)細(xì)胞質(zhì)是蛋白水解酶含量最多的區(qū)域 目標(biāo)蛋白在細(xì)胞質(zhì)中最容易受到蛋白水解酶的作用 通過對已知大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)半衰期的蛋臼質(zhì)的統(tǒng)計學(xué)分析 發(fā)現(xiàn)N末端為Arg Lys Leu Phe Tyr Trp殘基的蛋白質(zhì) 含有ProGlu Ser Thr豐富區(qū)的蛋白質(zhì)容易降解 穩(wěn)定性較差 在細(xì)胞內(nèi)有多肽碎片 突變的異常蛋白和外界物理因素的刺激的條件下 大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的蛋白水解酶活力往往能達(dá)到比較高的水平 四 高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 提高目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性的措施主要有 利用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)把目標(biāo)蛋白最終累積在周質(zhì)空間 或分泌到培養(yǎng)基中采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作為宿主菌 對分子量較小的目標(biāo)基因進(jìn)行融合表達(dá)或串聯(lián)聚合表達(dá) 共表達(dá)能提高特定目標(biāo)蛋白穩(wěn)定性的輔助因子 如分子伴侶基因 對蛋白質(zhì)序列中的蛋白水解酶敏感區(qū)域和識別位點(diǎn)進(jìn)行改造 在較低的溫度下培養(yǎng)菌體和優(yōu)化發(fā)酵條件 四 高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 但必須指出的是 由于目標(biāo)蛋白本身的性質(zhì)和用途的不同 上述幾種方法在使用上是受到一定的限制的 主要表現(xiàn)為 大腸桿菌對分子量較大的目標(biāo)蛋白的較運(yùn)和分泌效率一般比較低 不能滿足大規(guī)饃制備的需要 蛋白水解酶含量低的菌株往往代謝不旺盛 生長速率慢 使高密度發(fā)酵比較困難 融合表達(dá)使目標(biāo)蛋白的構(gòu)象與天然狀態(tài)不一樣 導(dǎo)致生物比活力降低 甚至沒有活性 融合蛋白和串聯(lián)聚合蛋白需要用酶或化學(xué)的方法切割出單體目標(biāo)蛋白 酶法成本比較高且加入的酶蛋白還必須分離去除 化學(xué)法比酶法成本低 但不少裂解試劑有毒性 對蛋白質(zhì)序列進(jìn)行改造需要有基本的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù) 而目前這方面的數(shù)據(jù)庫還不完整 四 高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 高密度發(fā)酵和工程化宿主細(xì)胞大腸桿菌高密度發(fā)酵是大規(guī)模制備重組蛋白質(zhì)過程中不可缺少的工藝步驟 其目的是在單個菌體對目標(biāo)基因的表達(dá)水平基本不變的前提下 通過單位體積的菌體數(shù)量的成倍增加來實(shí)現(xiàn)總表達(dá)量的提高 目前常用的發(fā)酵方式有 恒定培養(yǎng) 流加補(bǔ)料培養(yǎng) 連續(xù)培養(yǎng)三種 構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌高密度發(fā)酵后期由于菌體的生長密度較高 培養(yǎng)基中的溶氧飽和度往往比較低 氧氣的不足導(dǎo)致菌體生長速率降低和乙酸的累積 乙酸的存在對目標(biāo)基因的高效表達(dá)有明顯的阻抑作用 這是高密度發(fā)酵工藝研究中最迫切需要解決的問題 雖然在發(fā)酵過程中可采取通氧氣 提高攪拌速度 控制補(bǔ)料速度等措施來控制溶氧飽和度 減少乙酸的產(chǎn)生 但從實(shí)際應(yīng)用上看 這些措施都有一定的滯后效應(yīng) 難以做到比較精確的控制 因此構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌 是從恨本上解決問題的途徑之一 四 高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 利用透明顫菌血紅蛋白能提高大腸桿菌在貧氧條件下對氧的利用率的生物學(xué)性質(zhì) 把透明顫菌血紅蛋白基因vgb導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)以增加其對溶氧的寬容度 從而降低菌體產(chǎn)生乙酸所要求的溶氧飽和度閥值 用基因敲除技術(shù)缺失大腸桿菌的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因pta1和乙酸激酶基因ackA 使從丙酮酸到乙酸的合成途徑被阻斷 改變代謝流的方向 通過共轉(zhuǎn)化把枯草桿菌 釀酒酵母的乙酰乳酸合成酶基因alsS 單胞菌的丙酮酸脫羧酶基因pdc1和乙醇脫氫酶基因adh2導(dǎo)入大腸桿菌 使丙酮酸的代謝有選擇地向生成3 羥基丁酮或乙醇的方向進(jìn)行 四 高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌對于以可溶性或分泌形式表達(dá)的目標(biāo)蛋日而言 隨著發(fā)酵后期各種蛋白水解酶的累積 目標(biāo)蛋白會遭到蛋白水解酶的作用而被降解 為了使對蛋白水解酶比較敏感的目標(biāo)蛋白也能獲得較高水平的表達(dá) 需要構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌 rpoH基因編碼大腸桿菌RNA聚合酶的r32亞基 r32亞基對大腸桿菌中多種蛋白水解酶的活力有正調(diào)控作用 rpoH基因缺陷的突變株己經(jīng)被構(gòu)建 研究結(jié)果表明它能明顯提高目標(biāo)基因的表達(dá)水平 到目前為止 已知的大腸桿菌蛋白水解酶基因缺陷的突變株都巳被獲得 其中一部分具有實(shí)際應(yīng)用的潛力 四 高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 五 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢 構(gòu)建各種表達(dá)載體建立新的表達(dá)系統(tǒng)目前研究的重點(diǎn)完善現(xiàn)有的表達(dá)系統(tǒng) 解決表達(dá)系統(tǒng)中還存在的缺陷等方面 這些研究工作主要包括 重組蛋白質(zhì)的正確折疊 構(gòu)象形成和分泌菌體表面表達(dá)技術(shù)及其應(yīng)用重組蛋白質(zhì)修飾加工研究 共表達(dá)與蛋白質(zhì)折疊過程密切相關(guān)的分子伴侶包涵體是由于在新合成的大量目標(biāo)蛋白質(zhì)的折疊過程中 大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)參與折疊的蛋白因子的量不能滿足需要 無法形成正確的構(gòu)象而產(chǎn)生的 因此在大腸桿菌內(nèi)共表達(dá)與蛋白質(zhì)折疊過程密切相關(guān)的分子伴侶 折疊酶或硫氧還蛋白基因可以使目標(biāo)基因可溶性表達(dá)的比例明顯上升 研究表明這種作用是具有專一性的 不同的目標(biāo)蛋白需要不同類型的蛋白因子共表達(dá) 在有些情況下需要有多個蛋白因子共表達(dá)才能達(dá)到預(yù)期的目標(biāo) 五 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢 共表達(dá)人或小鼠的二硫鍵異構(gòu)酶 促進(jìn)二硫鍵形成和正確折疊大腸桿菌周質(zhì)空間通過二硫鍵形成酶DsbA和DsbB二個蛋白維持適當(dāng)?shù)难趸€原態(tài)勢使蛋白質(zhì)的二硫鍵形成 共表達(dá)人或小鼠的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶 PDl PDl能互補(bǔ)dsbA缺陷株 但在dsbB缺陷株中PDl失去原有的功能 PDl對目標(biāo)蛋白的二硫鍵形成和正確折疊的促進(jìn)作用可以受到谷胱甘肽的調(diào)節(jié) PDI具有的二硫鍵異構(gòu) 交換功能有效地彌補(bǔ)了DsbA和DsbB功能上的不足 從而提高了目標(biāo)蛋白正確折疊的比例 五 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢 降低蛋白質(zhì)合成的速率 從而增加正確折疊重組蛋白質(zhì)從phoA基因合成速率低的突變株中發(fā)現(xiàn)其分泌在周質(zhì)空間的phoA基因的產(chǎn)物 堿性磷酸酯酶比野生型菌株有顯著增加 由于只有構(gòu)象正確的酶原才能被大腸桿菌蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)識別和分泌 這一結(jié)果表明了目標(biāo)蛋白合成的速率能對其構(gòu)象形成正確與否產(chǎn)生影響 采用較弱的啟動子或部分誘導(dǎo)強(qiáng)啟動子的方法可降低蛋白質(zhì)合成的速率 從而達(dá)到增加正確折疊重組蛋白質(zhì)的目的 五 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢 改造信號肽的序列和結(jié)構(gòu) 提高分泌效率改造信號肽的序列和結(jié)構(gòu) 提高分泌效率比較成功的例子是發(fā)現(xiàn)了把堿性磷酸酯酶基因phoA信號肽的疏水區(qū)置換為多聚Leu殘基能明顯提高分泌效率 表明信號肽核心部位疏水性的增強(qiáng)有利于它與細(xì)胞膜的相互作用 這一結(jié)果為天然信號肽優(yōu)化改造的設(shè)計提供了很好的參考依據(jù) 五 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢 大腸桿菌表面表達(dá)技術(shù)的建立膜蛋白基因在大腸桿菌中表達(dá)的技術(shù)逐漸成為研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域 膜蛋白表達(dá)技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了大腸桿菌表面表達(dá)技術(shù)的建立 外源蛋白質(zhì)在菌體表面表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)是大腸桿菌可直接用于制備疫苗 進(jìn)行生物催化和作為探針篩選藥物 在一定程度上能與噬菌體展示系統(tǒng)相媲美 五 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢 大腸桿菌表面表達(dá)技術(shù)的建立主要通過三條途徑使目標(biāo)蛋白呈現(xiàn)在菌體表面 把外源序列插入LamB OmpA PhoE等外膜蛋白的膜外區(qū)把外源蛋白導(dǎo)入大腸桿菌鞭毛或傘毛的結(jié)構(gòu)中這二種方法適合表達(dá)一段長度小于100個氨基酸殘基的外源序列 因?yàn)檩^大的外源序列的插入往往會使外膜蛋白不能形成原來的三維結(jié)構(gòu) 影響它轉(zhuǎn)運(yùn)過程和在膜上的定位 在脂蛋白 IgA蛋白酶 ompA基因的N端或C端融合外源基因這種融合表達(dá)的方法對外源基因的限制條件就比較小 其序列可在50到500氨基酸殘基長度的范圍內(nèi) 五 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢 重組蛋白質(zhì)修飾加工研究蛋白質(zhì)C末端酰胺化和側(cè)鏈糖基化是常見的翻譯后修飾加工類型目前C末端酰胺化一般都是在體外通過肽酰甘氨酸酰胺酶把C末端甘氨酸轉(zhuǎn)換為胺基把其他微生物的肽酰甘氨酸酰胺化酶 真核生物糖基化過程所涉及的酶系導(dǎo)入大腸桿菌的設(shè)想很早就被提出 但這些工作都還在探索之中 其中需要研究的主要問題有 如何使肽酰甘氨酸酰胺化酶在大腸仟菌內(nèi)有較高的活力和專一性 如何通過基因工程技術(shù)改道真核生物的糖基化多酶體系使其能整合到大腸桿菌的染色體中和對耱基化位置 糖基種類和長度進(jìn)行控制等 五 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢