生物化學(xué)：第20章 重組DNA技術(shù)

第第 二十二十 章章重組重組DNA技術(shù)技術(shù)recombinant DNA technique 第第 一一 節(jié)節(jié) 重組重組DNA技術(shù)的基本過程技術(shù)的基本過程重組重組DNA技術(shù)：又稱技術(shù)：又稱DNA克隆或基因克隆克隆或基因克隆 應(yīng)用酶學(xué)的方法應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將不同來源的在體外將不同來源的特異基因或特異基因或DNA片段插入病毒、質(zhì)?；蚱淦尾迦氩《?、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)建重組它載體分子，構(gòu)建重組DNA分子，然后將分子，然后將重組重組DNA導(dǎo)入到合適的受體細(xì)胞中，使其導(dǎo)入到合適的受體細(xì)胞中，使其在細(xì)胞中擴(kuò)增和繁殖（稱之為在細(xì)胞中擴(kuò)增和繁殖（稱之為“克隆克隆”），），篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量同一行擴(kuò)增、提取獲得大量同一DNA分子。分子。l克隆克隆(clone)：通過無性繁殖得到的來自同一通過無性繁殖得到的來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。始祖的相同副本或拷貝的集合。l克隆化克隆化(cloning)：獲取這類同一的獲取這類同一的DNA分子分子群體、細(xì)胞群體或個體群體的過程，即無性群體、細(xì)胞群體或個體群體的過程，即無性繁殖。繁殖。l重組重組DNA(recombinant DNA,或嵌合或嵌合DNA, chimera DNA)：采用克隆技術(shù)，把來自不采用克隆技術(shù)，把來自不同生物的外源同生物的外源DNA插入載體分子所形成的雜插入載體分子所形成的雜合合DNA分子。分子。重組重組DNA技術(shù)的基本過程技術(shù)的基本過程 第二節(jié)第二節(jié) 重組重組DNA技術(shù)中常用工具酶技術(shù)中常用工具酶 一、一、 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶二、二、 DNA連接酶連接酶三、三、 DNA聚合酶聚合酶四、四、 其它修飾酶其它修飾酶 1. 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease) 基因工程的基因工程的手術(shù)刀手術(shù)刀功能：功能： 識別識別雙鏈雙鏈DNA中特異序列，該序列的特中特異序列，該序列的特征為征為4-6個核苷酸的個核苷酸的回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)，并在識別序，并在識別序列內(nèi)或附近列內(nèi)或附近特異切割特異切割DNA，產(chǎn)生，產(chǎn)生黏性末端黏性末端或或平末端平末端。 根據(jù)需要在特定的位點精確切割雙鏈根據(jù)需要在特定的位點精確切割雙鏈DNA分子。分子。作用：作用：與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA， 保保護(hù)自身護(hù)自身DNA。分類：分類：、（基因工程技術(shù)中常用（基因工程技術(shù)中常用型）型）第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第二、第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名：命名：Hin d 屬屬 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌d株的第三種酶株的第三種酶類酶識別序列特點類酶識別序列特點 回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu) (palindrome) 切口：切口：平端切口、粘端切口平端切口、粘端切口 作用模式圖：作用模式圖：（1）產(chǎn)生產(chǎn)生5 突出突出黏性末端黏性末端 (sticky end)EcoR I*GAATTC*CTTAAG*5353*G*C T T A A 5335OHP A A T T C* G*5335P OH 作用模式圖：作用模式圖：（2）產(chǎn)生產(chǎn)生3 突出突出黏性末端黏性末端Pst I*CTGCAG*GACGTC*5355335335OHP*C T G C A*G5335OHPA C G T C* * * * * * * * * * * *G* * * * * * * * * * * * 作用模式圖：作用模式圖：（3）產(chǎn)生產(chǎn)生平末端平末端 (blunt end)Alu I*AGCT*TCGA*53535335OHP*AG*TC5335 OHPCT*GA*同裂酶同裂酶來源不同但能識別相同序列的酶，又稱來源不同但能識別相同序列的酶，又稱同功異源酶同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst同尾酶同尾酶有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的黏性末端，稱后，產(chǎn)生相同的黏性末端，稱為為同尾酶同尾酶。這兩個相同的黏性末端稱為。這兩個相同的黏性末端稱為配伍未配伍未端端(compatible end)。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A 可變酶可變酶 識別識別DNA序列中的一個或幾個堿基序列中的一個或幾個堿基是可變的，并且識別序列往往超過是可變的，并且識別序列往往超過6個個核苷酸。此類酶是核苷酸。此類酶是型限制酶的特例。型限制酶的特例。 如：如：Bstp G GTNACC; Bbl GCC(N)4NGGC2. DNA連接酶連接酶 (DNA ligase) 基因工程的基因工程的縫紉針縫紉針 將兩條雙鏈將兩條雙鏈DNA片段連接起來，實片段連接起來，實現(xiàn)現(xiàn)DNA的的體外重組體外重組。功能：功能： 催化兩條催化兩條雙鏈雙鏈DNA分子的分子的互補(bǔ)黏性互補(bǔ)黏性末端末端或或平末端平末端的的5 磷酸磷酸基團(tuán)與基團(tuán)與3 羥基羥基形形成成磷酸酯鍵磷酸酯鍵。 也可將雙鏈也可將雙鏈DNA分子內(nèi)部分子內(nèi)部的單個切的單個切口口(無核苷酸空缺無核苷酸空缺)連接起來。還可作用連接起來。還可作用于于RNA，但效率很低。，但效率很低。 DNA連接酶催化連接酶催化平末端平末端連接要比連接要比黏性黏性末端末端效率低得多。效率低得多。 DNA連接酶有連接酶有T4 DNA連接酶連接酶和大腸和大腸桿菌桿菌DNA連接酶連接酶 DNA連接酶連接酶 EcoR I*GAATTC*CTTAAG*5353*G*C T T A A 5335OHPA A T T C* G*5335 P OHDNA連接酶連接酶作用模式圖：作用模式圖：（1）連接黏性末端黏性末端 作用模式圖：作用模式圖： （2）連接平末端平末端Alu I*AGCT*TCGA*5353OHP5335 *TC *AG5335 OHPCT*GA*DNA連接酶連接酶 能夠把脫氧核糖核苷酸能夠把脫氧核糖核苷酸連續(xù)地連續(xù)地添加到添加到雙鏈雙鏈DNA分子引物鏈的分子引物鏈的3 -OH末端末端，催，催化核苷酸的聚合作用化核苷酸的聚合作用 類型：類型： 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶 Klenow片段片段 Taq DNA聚合酶聚合酶 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶 三、三、DNA聚合酶聚合酶 四、其它修飾酶四、其它修飾酶 n末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase） n多核苷酸激酶多核苷酸激酶（polynuleotide kinase） n堿性磷酸酶堿性磷酸酶（alkaline phosphatase） 功能：功能： 催化脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移到催化脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移到單鏈單鏈或或雙鏈雙鏈DNA分子的分子的3-OH末端上。末端上。(1) 底物是底物是單鏈單鏈DNA或有或有3突出末端突出末端的的 雙鏈雙鏈 DNA。OH53Mg2+dNTP53( (A、G、C、T) )n nnppi53OHMg2+dNTPnppi53( (A、G、C、T) )n n末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶 (2) 底物是底物是平端平端或或3凹端凹端的雙鏈的雙鏈DNA。53Co2+dNTP53(A、G、C、T)nnppi53Co2+dNTPnppi53OHOH(A、G、C、T)n 用途：用途： （1）主要作用是在載體或目的基因主要作用是在載體或目的基因 3 末端加上同源末端加上同源多聚尾巴多聚尾巴，形成，形成人工人工 黏性末端黏性末端，便于，便于DNA重組。重組。（2）DNA 3末端的末端的同位素標(biāo)記同位素標(biāo)記。 目的基因進(jìn)入原核或真核細(xì)胞并高效復(fù)目的基因進(jìn)入原核或真核細(xì)胞并高效復(fù)制和表達(dá)蛋白質(zhì)，需要裝入制和表達(dá)蛋白質(zhì)，需要裝入載體載體才能實現(xiàn)。才能實現(xiàn)。載體（載體（vector） 指能攜帶外源指能攜帶外源DNA分子進(jìn)入受體細(xì)胞分子進(jìn)入受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的運載工具進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的運載工具第三節(jié)第三節(jié) 重組重組DNA技術(shù)中常用載體技術(shù)中常用載體 作為基因工程載體所需具備的基本條件作為基因工程載體所需具備的基本條件n能自主復(fù)制；能自主復(fù)制；n具有具有兩個以上兩個以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；的篩選和鑒定；n有克隆位點有克隆位點(外源外源DNA插入點插入點)，常具有多，常具有多個個單一酶切位點單一酶切位點，稱為多克隆位點；，稱為多克隆位點；n分子量小分子量小，以容納較大的外源，以容納較大的外源DNA；n拷貝數(shù)高拷貝數(shù)高n具有較高的遺傳穩(wěn)定性具有較高的遺傳穩(wěn)定性克隆載體克隆載體 (cloning vector) 為使插入的外源為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計的載體。設(shè)計的載體。表達(dá)載體表達(dá)載體 (expression vector) 為使插入的外源為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計的載體。多肽鏈而特意設(shè)計的載體。 n質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體：最常用的對目的基因最常用的對目的基因克隆克隆 n 噬菌體噬菌體：主要用于主要用于構(gòu)建構(gòu)建基因組基因組DNA或或 cDNA文庫文庫nM13噬菌體噬菌體：專用于專用于Sanger雙脫氧雙脫氧DNA測序測序 n 粘粒：粘粒：用于用于克隆大片段克隆大片段DNAn 酵母質(zhì)粒：酵母質(zhì)粒：用于在用于在酵母酵母中表達(dá)目的蛋白中表達(dá)目的蛋白n病毒：病毒：包括人或哺乳動物病毒、昆蟲及植物包括人或哺乳動物病毒、昆蟲及植物 毒，用于在毒，用于在真核細(xì)胞真核細(xì)胞中表達(dá)目的蛋白中表達(dá)目的蛋白 基因工程載體的種類和用途基因工程載體的種類和用途1. 質(zhì)粒質(zhì)粒 (plasmid)載體載體 細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)菌培養(yǎng)質(zhì)粒擴(kuò)增并表達(dá)蛋白質(zhì)質(zhì)粒擴(kuò)增并表達(dá)蛋白質(zhì)大腸桿菌大腸桿菌染色質(zhì)染色質(zhì)質(zhì)粒質(zhì)粒 細(xì)菌染色質(zhì)以外的雙鏈環(huán)狀細(xì)菌染色質(zhì)以外的雙鏈環(huán)狀DNA，能自我復(fù)制和表達(dá)其攜帶的遺傳信息。能自我復(fù)制和表達(dá)其攜帶的遺傳信息。 AmprORITetrpBR322質(zhì)粒質(zhì)粒：一種克隆質(zhì)粒ORI：復(fù)制起始點，保證高拷貝自我復(fù)制。結(jié)構(gòu)與功能：結(jié)構(gòu)與功能：Ampr, Tetr：兩個抗性基因用于篩選陽性克隆。Pst I, BamH I：兩個單酶切位點用于插入目的基因分子量較小拷貝數(shù)較高pUC18/pUC19pUC192686 bpAmprLac ZP(BLA)PlacOriAva I (413)BamHI (418)EcoRI (397)HindIII (448)Pst I (440)Sma I (415)Xma I (413)Apa LI (178)Apa LI (1121)Apa LI (2367)MCSMCS：Multiple Clonning Site提供多個單酶切位點用于克隆操作提供多個單酶切位點用于克隆操作LacZ: 藍(lán)白斑篩選陽性克隆藍(lán)白斑篩選陽性克隆其它質(zhì)粒載體其它質(zhì)粒載體 n能在體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的質(zhì)粒載體能在體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的質(zhì)粒載體 由由pUC系列質(zhì)粒載體派生而來系列質(zhì)粒載體派生而來 ，帶有來自，帶有來自噬菌體噬菌體T7、SP6的啟動子的啟動子 n穿梭質(zhì)粒載體（穿梭質(zhì)粒載體（shuttle plasmid vector） 可在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的可在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 nTA克隆載體克隆載體 專為克隆專為克隆PCR產(chǎn)物而設(shè)計的產(chǎn)物而設(shè)計的 ，在其，在其MCS兩側(cè)的兩側(cè)的3 末端攜帶有未配對的末端攜帶有未配對的T堿基堿基 2. 噬菌體噬菌體 (phage)載體載體 噬菌體噬菌體 (phage) M13噬菌體噬菌體 粘粒粘粒 (cosmid) 噬菌體噬菌體n噬菌體感染細(xì)菌后，可進(jìn)入噬菌體感染細(xì)菌后，可進(jìn)入溶菌生命周溶菌生命周期期及及溶源生命周期溶源生命周期 n與質(zhì)粒載體相比，其突出優(yōu)點是與質(zhì)粒載體相比，其突出優(yōu)點是可插入可插入較大外源較大外源DNA片段片段n噬菌體的感染效率噬菌體的感染效率遠(yuǎn)高于質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)遠(yuǎn)高于質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)化效率化效率 粘粒粘粒 (cosmid)組成：組成：n 抗性基因；抗性基因；n 質(zhì)粒復(fù)制的起始位點質(zhì)粒復(fù)制的起始位點(ORI)；n 用于插入目的基因的單個酶切位點；用于插入目的基因的單個酶切位點；n 噬菌體的噬菌體的cos位點位點。 可見，可見，cosmid是由質(zhì)粒和是由質(zhì)粒和 噬菌體的噬菌體的cos位點位點構(gòu)建而成。構(gòu)建而成。M13噬菌體載體噬菌體載體nM13是一種是一種絲狀單鏈?zhǔn)删w絲狀單鏈?zhǔn)删w，基因組全，基因組全長長6 407bp，為，為閉環(huán)閉環(huán)單鏈單鏈DNA n由于由于M13噬菌體載體克隆的外源噬菌體載體克隆的外源DNA片片段不宜大于段不宜大于1 500bp ，限制了其應(yīng)用，限制了其應(yīng)用 M13噬菌體噬菌體DNA改造系統(tǒng)改造系統(tǒng) (含含lacZ基因基因)n M13mp系列系列n pUC系列系列3. 人工染色體載體人工染色體載體 酵母人工染色體酵母人工染色體(YAC)可接受可接受100kb2000kb的外源的外源DNA片段插入，是人類基片段插入，是人類基因組計劃中物理圖譜繪制采用的主要載因組計劃中物理圖譜繪制采用的主要載體體包含的調(diào)控元件包含的調(diào)控元件 ：著絲粒、端粒、復(fù)制著絲粒、端粒、復(fù)制起始點、限制性酶切位點、選擇標(biāo)記、起始點、限制性酶切位點、選擇標(biāo)記、原核序列及調(diào)控元件原核序列及調(diào)控元件 4. 病毒載體病毒載體 目前常用的病毒載體有目前常用的病毒載體有整合型整合型和和游離游離型型兩類兩類 n反轉(zhuǎn)錄病毒載體反轉(zhuǎn)錄病毒載體 （整合型）（整合型）n腺病毒載體腺病毒載體 （游離型）（游離型）第四節(jié)第四節(jié) 目的基因的獲得和體外重組目的基因的獲得和體外重組 一、目的基因的獲得一、目的基因的獲得 -分分二、目的基因的體外重組二、目的基因的體外重組 -切、接切、接目的基因目的基因 (target DNA)n cDNA (complementary DNA)n基因組基因組DNA (genomic DNA)目的目的: :n 分離獲得某一感興趣的基因分離獲得某一感興趣的基因或或DNA序列序列 n 獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）種類種類：（一）（一） 化學(xué)合成法化學(xué)合成法要求：要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn) 物的氨基酸序列物的氨基酸序列（二）聚合酶鏈反應(yīng)（二）聚合酶鏈反應(yīng) (polymerase chain reaction, PCR)（三）從基因文庫中篩選（三）從基因文庫中篩選（一）目的基因的獲取（一）目的基因的獲取分分* 化學(xué)合成法獲取目的基因化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列序列組織或細(xì)胞染色體組織或細(xì)胞染色體DNA基因片段基因片段克隆載體克隆載體重組重組DNA分子分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶受體菌受體菌基因組基因組DNA文庫文庫存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組的所有基因組DNA的的集合集合* 從基因組從基因組DNA文文庫獲取目的基因庫獲取目的基因限制酶切位點限制酶切位點限制酶消化限制酶消化 除去中間片段除去中間片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色體色體DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA與載體與載體DNA混合混合 連接反應(yīng)連接反應(yīng) 體外包裝體外包裝 用重組噬菌體用重組噬菌體感染大腸桿菌感染大腸桿菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文庫基因文庫mRNA cDNA 雙鏈雙鏈cDNA 重組重組DNA分子分子 cDNA文庫文庫 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶 載體載體 受體菌受體菌 復(fù)制復(fù)制* 從從cDNA文庫獲取目的基因文庫獲取目的基因 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶堿水解堿水解 T T T T 基因組文庫：基因組文庫：G-文庫文庫cDNA文庫：文庫：c-文庫文庫 (常用常用)方法：方法：基因文庫基因文庫 用目的基因上的一段用目的基因上的一段DNA做成做成探針探針與文庫中的與文庫中的DNA作作核酸雜交核酸雜交，從基因，從基因文庫中文庫中“釣出釣出”有目的基有目的基因的克隆。因的克隆。目目 錄錄（三）外源基因與載體的連接（三）外源基因與載體的連接接接1. 黏性末端連接黏性末端連接方式方式：(1) 同一限制酶切位點連接同一限制酶切位點連接 (2) 不同限制酶切位點連接不同限制酶切位點連接 配伍末端配伍末端連接連接 非配伍末端連接非配伍末端連接（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建Bam H切割反應(yīng)切割反應(yīng) GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶連接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG載體載體DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重組體重組體GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG目的基因自連目的基因自連載體自連載體自連同一限制酶切位點連接同一限制酶切位點連接不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位點切割位點GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABg l切割位點切割位點AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l雙酶切雙酶切Eco R+ Bg l雙酶切雙酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體配伍末端的配伍末端的連接情況和同一連接情況和同一限制酶切位點連限制酶切位點連接相似。接相似。2. 平末端連接平末端連接適用于：適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的粘限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端端補(bǔ)齊或切平形成的平端目的基因目的基因載體載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體載體自連載體自連目的基因目的基因 自連自連3. 人工接頭人工接頭(linker)連接連接 由平端加上新的酶切位點，再用由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生黏性末端，而進(jìn)行粘限制酶切除產(chǎn)生黏性末端，而進(jìn)行粘端連接。端連接。 人工接頭及其應(yīng)用人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R目目 錄錄4. 同聚物加尾連接同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶在末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase)的作用下，在的作用下，在DNA片段片段3末端加上同聚末端加上同聚物序列、制造出黏性末端，再進(jìn)行粘端物序列、制造出黏性末端，再進(jìn)行粘端連接。連接。5 3 3 5 載體載體DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶或機(jī)械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 5 5 3 3 5 5 3 A(A)nA A(A)nA 5 -核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dATP末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體5. T-A克隆克隆是直接將是直接將PCR產(chǎn)物插入到載體中的方產(chǎn)物插入到載體中的方法。法。TaqDNA聚合酶（具有末端轉(zhuǎn)移酶活聚合酶（具有末端轉(zhuǎn)移酶活性）在擴(kuò)增目的基因片段時，可不依賴其性）在擴(kuò)增目的基因片段時，可不依賴其模板，可在模板，可在PCR產(chǎn)物產(chǎn)物3端自動加上堿基端自動加上堿基A。為此，在為此，在T4 DNA連接酶催化下，實現(xiàn)質(zhì)連接酶催化下，實現(xiàn)質(zhì)粒載體（載體酶切切口具有游離粒載體（載體酶切切口具有游離T）和）和PCR產(chǎn)物的直接連接，實現(xiàn)產(chǎn)物的直接連接，實現(xiàn)DNA片段重組片段重組33AATTpMD 19-T VectorEcoR V酶切酶切大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞第五節(jié)第五節(jié) 重組分子的導(dǎo)入和篩選與鑒定重組分子的導(dǎo)入和篩選與鑒定一、重組一、重組DNA分子的導(dǎo)入分子的導(dǎo)入 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)二、重組二、重組DNA分子的篩選與鑒定分子的篩選與鑒定篩篩一、重組一、重組DNA分子的導(dǎo)入分子的導(dǎo)入宿主細(xì)胞應(yīng)具備的條件宿主細(xì)胞應(yīng)具備的條件n處于感受態(tài)處于感受態(tài)n對載體無嚴(yán)格限制對載體無嚴(yán)格限制 n限制酶和重組酶缺陷限制酶和重組酶缺陷n不對外源不對外源DNA進(jìn)行修飾進(jìn)行修飾 n能表達(dá)重組體所提供表型特征能表達(dá)重組體所提供表型特征重組重組DNA分子分子的導(dǎo)入方式的導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 (transformation) 以質(zhì)粒作為為載體將重組以質(zhì)粒作為為載體將重組DNA分子導(dǎo)入細(xì)菌（原核分子導(dǎo)入細(xì)菌（原核細(xì)胞）的過程。細(xì)胞）的過程。轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 (transfection) 以噬菌體、病毒或脂質(zhì)體作為載體將重組以噬菌體、病毒或脂質(zhì)體作為載體將重組DNA分子分子導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程。導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程。感染感染 (infection) 以噬菌體或病毒作為載體構(gòu)建的重組以噬菌體或病毒作為載體構(gòu)建的重組DNA，經(jīng)體外，經(jīng)體外包裝成具有感染性的噬菌體顆?；虿《绢w粒后導(dǎo)入包裝成具有感染性的噬菌體顆粒或病毒顆粒后導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)菌或或真核細(xì)胞的過程。真核細(xì)胞的過程。非轉(zhuǎn)化子非轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子非重組子非重組子重組子重組子鑒定鑒定單抗生素篩選單抗生素篩選非轉(zhuǎn)化子非轉(zhuǎn)化子( (不能生長）不能生長）轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子陽性重組子陽性重組子自身環(huán)化載體自身環(huán)化載體未酶解完全載體未酶解完全載體非目的基因插入載體非目的基因插入載體二、重組二、重組DNA分子的篩選與鑒定分子的篩選與鑒定 直接選擇法直接選擇法n 抗藥性標(biāo)記選擇抗藥性標(biāo)記選擇n 標(biāo)志補(bǔ)救標(biāo)志補(bǔ)救 (marker rescue)n 分子雜交法分子雜交法 原位雜交原位雜交 Southern印跡印跡 免疫學(xué)方法免疫學(xué)方法 如免疫化學(xué)方法及酶免檢測分析等如免疫化學(xué)方法及酶免檢測分析等重組子的篩選與鑒定方法重組子的篩選與鑒定方法 AmprTerr1. 插入失活插入失活: 例例1：在：在Tetr中插入目的基因中插入目的基因在質(zhì)粒固有的功能基因內(nèi)插入目的基因，則該基因不能表達(dá)有功能的蛋白質(zhì)。 AmpTet1 2 34 5 63和5 是陽性克隆1 2 34 5 6例例1：( (插入失活法插入失活法) )抗藥性標(biāo)記選擇抗藥性標(biāo)記選擇例例2：ApmrMCSLacZ例例3: 在在Laz中插入目的基因中插入目的基因 X-gal藍(lán)色化合物-半乳糖苷酶Lac-Z基因例例3：藍(lán)白斑篩選：藍(lán)白斑篩選 2. 菌落原位雜交菌落原位雜交覆蓋濾膜取下沾有菌落的濾膜 裂解、 變性、固定等與探針雜交放射性自顯影1 2 34 5 63和和5是陽性克隆是陽性克隆重組重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為技術(shù)操作過程可形象歸納為 小小 結(jié)結(jié)分分分離目的基因分離目的基因 切切限制酶切目的基因與載體限制酶切目的基因與載體接接拼接重組體拼接重組體 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌轉(zhuǎn)入受體菌 篩篩篩選重組體篩選重組體 重組重組DNA技術(shù)操作的主要步驟技術(shù)操作的主要步驟載體載體質(zhì)粒質(zhì)粒噬菌體噬菌體病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因組基因組DNA cDNA 人工合成人工合成PCR產(chǎn)物產(chǎn)物限制酶消化限制酶消化開環(huán)載體開環(huán)載體DNA目的基目的基因因連接酶連接酶重組體重組體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主帶重組體的宿主篩選篩選表型篩選表型篩選酶切電泳鑒定酶切電泳鑒定菌落原位雜交菌落原位雜交第六節(jié)第六節(jié) 外源基因的表達(dá)外源基因的表達(dá)表達(dá)體系的建立表達(dá)體系的建立表達(dá)載體的構(gòu)建表達(dá)載體的構(gòu)建受體細(xì)胞的建立受體細(xì)胞的建立表達(dá)產(chǎn)物的分離純化表達(dá)產(chǎn)物的分離純化 外源基因的表達(dá)涉及目的基因外源基因的表達(dá)涉及目的基因的克隆、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白的克隆、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)產(chǎn)物的加工及分離純化等過程質(zhì)產(chǎn)物的加工及分離純化等過程 一、外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)一、外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá) 原核表達(dá)系統(tǒng)主要有大腸桿菌、芽原核表達(dá)系統(tǒng)主要有大腸桿菌、芽孢桿菌及鏈霉菌系統(tǒng)等孢桿菌及鏈霉菌系統(tǒng)等 ，其中，其中大腸桿大腸桿菌（菌（E.coli）表達(dá)體系最為常用，其優(yōu)表達(dá)體系最為常用，其優(yōu)點是培養(yǎng)方法簡單、迅速、經(jīng)濟(jì)而又點是培養(yǎng)方法簡單、迅速、經(jīng)濟(jì)而又適合大規(guī)模生產(chǎn)適合大規(guī)模生產(chǎn) （一）對外源目的基因的要求（一）對外源目的基因的要求1外源真核基因不能帶有外源真核基因不能帶有5 端非編碼區(qū)和內(nèi)端非編碼區(qū)和內(nèi) 含子結(jié)構(gòu)，必須用含子結(jié)構(gòu)，必須用cDNA或化學(xué)合成基因或化學(xué)合成基因2外源基因必須置于原核細(xì)胞的強(qiáng)啟動子和外源基因必須置于原核細(xì)胞的強(qiáng)啟動子和 SD序列等元件控制下序列等元件控制下3重組載體必須形成正確的開放閱讀框架重組載體必須形成正確的開放閱讀框架4外源基因轉(zhuǎn)錄生成的外源基因轉(zhuǎn)錄生成的mRNA必須相對穩(wěn)定并必須相對穩(wěn)定并 能被有效翻譯，所表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物穩(wěn)定，能被有效翻譯，所表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物穩(wěn)定， 不能對宿主菌有毒害作用不能對宿主菌有毒害作用（二）對原核表達(dá)載體的要求（二）對原核表達(dá)載體的要求1具有強(qiáng)啟動子及其兩側(cè)的調(diào)控序列具有強(qiáng)啟動子及其兩側(cè)的調(diào)控序列2含有含有SD序列，而且序列，而且SD序列與起始序列與起始 密碼子密碼子AUG之間要有合適的距離之間要有合適的距離 3帶有轉(zhuǎn)錄終止序列帶有轉(zhuǎn)錄終止序列 4含多接頭克隆位點含多接頭克隆位點 （三）外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)方式（三）外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)方式1. 融合型表達(dá)融合型表達(dá)是指將外源目的基因與另一基因（可以是是指將外源目的基因與另一基因（可以是原核原核DNA或其他或其他DNA序列）相拼接構(gòu)建成序列）相拼接構(gòu)建成融合基因進(jìn)行表達(dá)。融合基因進(jìn)行表達(dá)。這種由外源目的蛋白與原核生物多肽或具這種由外源目的蛋白與原核生物多肽或具有其他功能的多肽結(jié)合在一起的蛋白，即有其他功能的多肽結(jié)合在一起的蛋白，即為融合蛋白。為融合蛋白?？赏ㄟ^酶解法或化學(xué)降解法切除融合蛋白可通過酶解法或化學(xué)降解法切除融合蛋白中的其他多肽成分而獲得外源目的蛋白。中的其他多肽成分而獲得外源目的蛋白。特點：表達(dá)效率高，較穩(wěn)定，可抵御細(xì)菌特點：表達(dá)效率高，較穩(wěn)定，可抵御細(xì)菌蛋白酶的水解，帶有特殊標(biāo)記，易于進(jìn)行蛋白酶的水解，帶有特殊標(biāo)記，易于進(jìn)行親和純化。親和純化。（三）外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)（三）外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)2. 非融合型表達(dá)非融合型表達(dá)指外源目的基因不與其他基因融合，直接指外源目的基因不與其他基因融合，直接從起始密碼從起始密碼AUG開始在原核調(diào)控元件控制開始在原核調(diào)控元件控制下表達(dá)蛋白質(zhì)。下表達(dá)蛋白質(zhì)。特點：具有類似天然蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，其生特點：具有類似天然蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，其生物學(xué)功能與天然蛋白更為接近，但其缺點物學(xué)功能與天然蛋白更為接近，但其缺點是容易被細(xì)菌蛋白酶水解。是容易被細(xì)菌蛋白酶水解。（三）外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)（三）外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)3. 分泌型表達(dá)分泌型表達(dá)是利用分泌型表達(dá)載體將表達(dá)的蛋白質(zhì)由是利用分泌型表達(dá)載體將表達(dá)的蛋白質(zhì)由細(xì)胞質(zhì)跨膜分泌到細(xì)胞周質(zhì)中，需要在信細(xì)胞質(zhì)跨膜分泌到細(xì)胞周質(zhì)中，需要在信號肽的幫助下進(jìn)行號肽的幫助下進(jìn)行。分泌型表達(dá)載體必須在分泌型表達(dá)載體必須在SD序列下游攜帶有序列下游攜帶有一段信號肽序列。分泌型蛋白可以是融合一段信號肽序列。分泌型蛋白可以是融合蛋白或非融合蛋白。蛋白或非融合蛋白。特點：可防止宿主蛋白酶對外源蛋白的水特點：可防止宿主蛋白酶對外源蛋白的水解，減輕大腸桿菌代謝負(fù)荷，便于蛋白質(zhì)解，減輕大腸桿菌代謝負(fù)荷，便于蛋白質(zhì)在細(xì)胞外正確折疊和提純，但分泌型蛋白在細(xì)胞外正確折疊和提純，但分泌型蛋白的表達(dá)量往往較低，且有時信號肽不能被的表達(dá)量往往較低，且有時信號肽不能被切除或在錯誤的位置上被切除。切除或在錯誤的位置上被切除。（三）外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)（三）外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)4. 包涵體包涵體 當(dāng)大腸桿菌高效表達(dá)外源基因時，所表達(dá)當(dāng)大腸桿菌高效表達(dá)外源基因時，所表達(dá)的蛋白質(zhì)致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包的蛋白質(zhì)致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體結(jié)構(gòu)稱為包涵體。特點：利于表達(dá)產(chǎn)物的分離純化，可在一特點：利于表達(dá)產(chǎn)物的分離純化，可在一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定，也能使宿定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定，也能使宿主細(xì)胞表達(dá)對其有毒或有致死效應(yīng)的目的主細(xì)胞表達(dá)對其有毒或有致死效應(yīng)的目的蛋白，但喪失了原有的生物學(xué)活性，因此蛋白，但喪失了原有的生物學(xué)活性，因此必須通過有效的變性復(fù)性操作以恢復(fù)其生必須通過有效的變性復(fù)性操作以恢復(fù)其生物活性。物活性。（四）原核表達(dá)系統(tǒng)的不足（四）原核表達(dá)系統(tǒng)的不足 只適合表達(dá)克隆的只適合表達(dá)克隆的cDNA，不宜表達(dá)真核基因，不宜表達(dá)真核基因組組DNA 表達(dá)的真核蛋白不能形成正確的折疊和進(jìn)行表達(dá)的真核蛋白不能形成正確的折疊和進(jìn)行糖基化、磷酸化、乙?；刃揎椞腔?、磷酸化、乙酰化等修飾 真核蛋白常以無生物活性的包涵體形式存在真核蛋白常以無生物活性的包涵體形式存在 難以實現(xiàn)大量表達(dá)分泌性蛋白難以實現(xiàn)大量表達(dá)分泌性蛋白 真核蛋白不穩(wěn)定，易被細(xì)菌蛋白酶降解真核蛋白不穩(wěn)定，易被細(xì)菌蛋白酶降解 原核細(xì)胞周質(zhì)中常含有種類繁多的內(nèi)毒素原核細(xì)胞周質(zhì)中常含有種類繁多的內(nèi)毒素 真核表達(dá)系統(tǒng)真核表達(dá)系統(tǒng)是指在真核細(xì)胞中表是指在真核細(xì)胞中表達(dá)外源基因的體系達(dá)外源基因的體系主要有：主要有：酵母、哺乳動物、昆蟲細(xì)胞酵母、哺乳動物、昆蟲細(xì)胞（桿狀病毒）系統(tǒng)和高等植物系統(tǒng)（桿狀病毒）系統(tǒng)和高等植物系統(tǒng)二、外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)二、外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)（一）真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點（一）真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點優(yōu)點：優(yōu)點：可表達(dá)克隆的可表達(dá)克隆的cDNA或真核基因組或真核基因組DNA 可進(jìn)行糖基化、磷酸化、乙?；刃揎?，可進(jìn)行糖基化、磷酸化、乙?；刃揎棧贡磉_(dá)蛋白形成正確的天然構(gòu)象使表達(dá)蛋白形成正確的天然構(gòu)象 某些真核細(xì)胞可將外源基因表達(dá)產(chǎn)物直某些真核細(xì)胞可將外源基因表達(dá)產(chǎn)物直接分泌至細(xì)胞培養(yǎng)基中接分泌至細(xì)胞培養(yǎng)基中 缺點：缺點：操作技術(shù)難、費時、費錢操作技術(shù)難、費時、費錢（二）真核表達(dá)載體（二）真核表達(dá)載體 真核表達(dá)載體大多是真核表達(dá)載體大多是穿梭載體穿梭載體，既含，既含有原核克隆載體的有原核克隆載體的復(fù)制子、抗性篩選基因復(fù)制子、抗性篩選基因和和MCS等序列，利于在原核細(xì)胞中進(jìn)行目等序列，利于在原核細(xì)胞中進(jìn)行目的基因的重組和載體的擴(kuò)增；又含有真核的基因的重組和載體的擴(kuò)增；又含有真核細(xì)胞的細(xì)胞的啟動子、增強(qiáng)子、剪接信號、轉(zhuǎn)錄啟動子、增強(qiáng)子、剪接信號、轉(zhuǎn)錄終止信號和終止信號和PolyA化信號及遺傳選擇標(biāo)記化信號及遺傳選擇標(biāo)記等組件，便于在真核細(xì)胞中高效、正確表等組件，便于在真核細(xì)胞中高效、正確表達(dá)目的基因達(dá)目的基因 （三）外源基因?qū)胝婧思?xì)胞（三）外源基因?qū)胝婧思?xì)胞外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的方法外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的方法 病毒感染（天然方法病毒感染（天然方法 ） 載體轉(zhuǎn)染載體轉(zhuǎn)染 （化學(xué)或物理方法（化學(xué)或物理方法 ）（四）轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選（四）轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選常用的篩選方法有常用的篩選方法有1. 新霉素抗性新霉素抗性(neor)選擇系統(tǒng)選擇系統(tǒng) 2. 胸苷激酶基因胸苷激酶基因(tk)選擇系統(tǒng)選擇系統(tǒng) 3. 二氫葉酸還原酶基因二氫葉酸還原酶基因(dhfr)選擇系統(tǒng)選擇系統(tǒng) （四）外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)（四）外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)表達(dá)方式主要有兩大類表達(dá)方式主要有兩大類n瞬時表達(dá)（不與宿主染色體整合瞬時表達(dá)（不與宿主染色體整合 ） 常用的瞬時表達(dá)宿主是常用的瞬時表達(dá)宿主是源自非洲綠猴細(xì)胞源自非洲綠猴細(xì)胞株株CV-1的的COS細(xì)胞細(xì)胞n穩(wěn)定表達(dá)穩(wěn)定表達(dá) （整合至宿主染色體中（整合至宿主染色體中 ） 常用的穩(wěn)定表達(dá)宿主細(xì)胞是常用的穩(wěn)定表達(dá)宿主細(xì)胞是中國倉鼠卵巢中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞細(xì)胞本章要求掌握的內(nèi)容本章要求掌握的內(nèi)容1. 重組重組DNA技術(shù)與基因工程的概念、基本原理、技術(shù)與基因工程的概念、基本原理、 基本步驟基本步驟2. 限制性內(nèi)切酶的概念、性質(zhì)和分類方法限制性內(nèi)切酶的概念、性質(zhì)和分類方法3. 質(zhì)粒載體的概念和特點質(zhì)粒載體的概念和特點4. 重組重組DNA分子的構(gòu)建、導(dǎo)入、篩選及鑒定分子的構(gòu)建、導(dǎo)入、篩選及鑒定