生物化學(xué)與分子生物學(xué)：18 重組DNA技術(shù)

重組重組DNADNA技術(shù)技術(shù) RECOMBINANT DNA TECHNOLOGYRECOMBINANT DNA TECHNOLOGY第第 二二 十十 四四 章章n基因重組基因重組 是指是指DNADNA片段在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間，甚至片段在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間，甚至在不同物種之間進行交換，交換后的片段仍然在不同物種之間進行交換，交換后的片段仍然具有復(fù)制和表達(dá)的功能。具有復(fù)制和表達(dá)的功能。n分為三個水平：分為三個水平：整體水平（如整體水平（如 生物有性雜交）生物有性雜交）細(xì)胞水平（如細(xì)胞水平（如 單克隆抗體技術(shù)）單克隆抗體技術(shù)）分子水平（如分子水平（如 構(gòu)建重組體）構(gòu)建重組體）克隆克隆(clone)(clone)來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為獲取同一拷貝的過程稱為克隆化克隆化(cloning)(cloning)，即即無性繁殖無性繁殖。（一）（一）DNADNA克隆克隆技術(shù)水平：技術(shù)水平：分子克隆分子克隆(即即DNA DNA 克隆克隆 )細(xì)胞克隆細(xì)胞克隆個體克?。▌游锘蛑参铮﹤€體克?。▌游锘蛑参铮?yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的的或人工的DNADNA）與載體）與載體DNADNA接合成一具有自我復(fù)接合成一具有自我復(fù)制能力的制能力的DNADNA分子分子復(fù)制子復(fù)制子(replicon)(replicon)，繼而，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進行擴增提取獲得大量同一的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進行擴增提取獲得大量同一D N AD N A 分 子，也 稱分 子，也 稱 基 因 克 隆 或 重 組基 因 克 隆 或 重 組 D N A D N A(recombinant DNA)(recombinant DNA)。定義定義DNADNA克隆克隆乳腺生物反應(yīng)器：乳腺生物反應(yīng)器：n將外源基因?qū)胼d體，將外源基因?qū)胼d體，位于位于乳球蛋白基因乳球蛋白基因啟動子下游，使得該目啟動子下游，使得該目的基因只能在哺乳動物的基因只能在哺乳動物組織中表達(dá)組織中表達(dá)第第 一一 節(jié)節(jié) 常用工具酶常用工具酶Enzymes as tools inDNA Recombination Technique n 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶n DNADNA連接酶連接酶n DNADNA聚合酶聚合酶n 堿性磷酸酶堿性磷酸酶n 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶n 末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶n TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶重組重組DNA技術(shù)中常用的工具酶技術(shù)中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割識別特異序列，切割DNADNA連接酶連接酶催化催化DNA中相鄰的中相鄰的5 磷酸基和磷酸基和3 羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使使DNA切口封合或使兩個切口封合或使兩個DNA分子或片段連接分子或片段連接DNA聚合酶聚合酶合成雙鏈合成雙鏈cDNA分子或片段連接分子或片段連接缺口平移制作高比活探針缺口平移制作高比活探針DNA序列分析序列分析填補填補3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而無外切活性，而無53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，第二鏈合成，雙鏈雙鏈DNA 3 末端標(biāo)記等末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I進行填補，標(biāo)記或進行填補，標(biāo)記或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶在在3 羥基末端進行同質(zhì)多聚物加尾羥基末端進行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶堿性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease,RE)(restriction endonuclease,RE)限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶:是識別是識別DNADNA的特異序列的特異序列,并并在識別位點或其周圍切割雙鏈在識別位點或其周圍切割雙鏈DNADNA的一類內(nèi)切酶。的一類內(nèi)切酶。GGATCCGGATCCCCTAGGCCTAGGG GCCTAGCCTAGGATCCGATCC G GBam Bam HH定義定義、基因工程技術(shù)中常用基因工程技術(shù)中常用型，型，特點是特點是識別位點與切割位點一致識別位點與切割位點一致分類分類與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源飾系統(tǒng)，限制外源DNADNA，保護自身保護自身DNADNA。作用作用第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第二、第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名命名Hin d 屬屬 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌d株的第三種酶株的第三種酶類酶識別序列特點類酶識別序列特點 回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)(palindrome)(palindrome)切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口鈍性末端鈍性末端粘性末端粘性末端來源不同的限制酶，但能識別和切割來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱同一位點，這些酶稱同功異源酶同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst同功異源酶同功異源酶有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割相同，但切割DNADNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為稱為同尾酶同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為。這兩個相同的粘性末端稱為配配伍末端伍末端(compatible end)(compatible end)。GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A同尾酶同尾酶切割會受其他因素的影響切割會受其他因素的影響 限制性內(nèi)切酶通常不能切割在識別位點內(nèi)有特限制性內(nèi)切酶通常不能切割在識別位點內(nèi)有特異堿基甲基化的序列。異堿基甲基化的序列。緩沖液或環(huán)境溫度也會影響一些酶的特異性。緩沖液或環(huán)境溫度也會影響一些酶的特異性。例如，例如，EcoR I在正常情況下識別在正常情況下識別“-GAATTC-”序列，但在序列，但在甘油濃度大于甘油濃度大于5%（v/v）或反應(yīng)溫度較低時識別序列可變）或反應(yīng)溫度較低時識別序列可變?yōu)闉椤?AATT-”或或“-嘌呤嘌呤嘌呤嘌呤AT嘧啶嘧啶嘧啶嘧啶-”，這種現(xiàn)象稱為，這種現(xiàn)象稱為星號活性（星號活性（star activity），以），以EcoR I*表示。表示。名稱名稱 識別序列及切割位點識別序列及切割位點名稱識別序列及切割點名稱識別序列及切割點切割后產(chǎn)生切割后產(chǎn)生突出末端突出末端:BamH 5GGATCC.3GATCC.3Bgl 5AGATCT.3GATCT.3EcoR EcoR 5GAATTC.3AATTC.3Hind Hind 5AAGCTT.3AGCTT.3 Hpa Hpa 5CCGG.3CGG.3 Mbo Mbo 5GATC.3GATC.3 Nde Nde 5GATATG.3TATG.3切割后產(chǎn)生切割后產(chǎn)生3突出末端突出末端:Apa 5GGGCCC.3C.3Hae 5PuGCGCPy.3Py.3Kpn 5GGTACC.3C.3Pst 5CTGCAG.3G.3Sph 5GCATGC.3C.3切割后產(chǎn)生平末端切割后產(chǎn)生平末端:Alu 5AGCT.3CT.3EcoR 5GATATC.3ATC.3Hae Hae 5GGCC.3CC.3Pvu Pvu 5CAGCTG.3CTG.3Sma Sma 5CCCGGG.3GGG.3 限制性內(nèi)切核酸酶限制性內(nèi)切核酸酶催化兩個相鄰的催化兩個相鄰的3-OH和和5-磷酸基團形成磷酸基團形成3，5-磷酸二酯鍵，磷酸二酯鍵，從而使從而使DNA片段或單鏈斷裂形成的缺口連接起來。片段或單鏈斷裂形成的缺口連接起來。DNA DNA連接酶（連接酶（DNA ligaseDNA ligase）在在末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase)(terminal transferase)的作的作用下，在用下，在DNADNA片段末端加上同聚物序列、制片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。造出粘性末端，再進行粘端連接。末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶5 3 3 5 載體載體DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或機械剪切限制酶或機械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 5 3 A(A)nA A(A)nA3 5-核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體同聚物加尾連接同聚物加尾連接可用32P標(biāo)記的ATP特異地標(biāo)記多核苷酸的5末端。多核苷酸激酶多核苷酸激酶堿性磷酸酶堿性磷酸酶n分子生物學(xué)中主要用作核酸的去磷酸化。因為分子生物學(xué)中主要用作核酸的去磷酸化。因為DNADNA通常會在通常會在55端結(jié)合磷酸基團，用端結(jié)合磷酸基團，用ALPALP去磷去磷酸化能防止酸化能防止DNADNA分子分子55端與端與33端連接。端連接。第二節(jié)第二節(jié) 目的目的DNADNA的獲取的獲取目的基因目的基因n cDNA(complementary DNA)cDNA(complementary DNA)n基因組基因組DNA(genomic DNA)DNA(genomic DNA)目的基因的獲取目的基因的獲取1.1.化學(xué)合成法化學(xué)合成法2.2.基因組基因組DNADNA文庫文庫 (genomic DNA library)(genomic DNA library)3.cDNA3.cDNA文庫文庫 (cDNA library)(cDNA library)4.4.聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(PCR)*化學(xué)合成法獲取目的基因化學(xué)合成法獲取目的基因要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列氨基酸序列 。一般用于小分子基因的合成一般用于小分子基因的合成組織或細(xì)胞染色體組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷基因片斷克隆載體克隆載體重組重組DNA分子分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶受體菌受體菌*從基因組從基因組DNADNA文庫文庫獲取目的基因獲取目的基因限制酶切位點限制酶切位點限制酶消化限制酶消化 除去中間片段除去中間片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色體色體DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA與載體與載體DNA混合混合 連接反應(yīng)連接反應(yīng) 體外包裝體外包裝 用重組噬菌體用重組噬菌體感染大腸桿菌感染大腸桿菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文庫基因文庫基因組基因組DNADNA文庫（文庫（genomic DNA librarygenomic DNA library）將某一基因組將某一基因組DNADNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖袛嘤眠m當(dāng)?shù)南拗泼盖袛嗪?，與載體后，與載體DNADNA重組，再全部轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，重組，再全部轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組基因組DNADNA的集合的集合稱為稱為G G文庫文庫cDNAcDNA文庫文庫(cDNA library)(cDNA library)：以某種細(xì)胞的全部以某種細(xì)胞的全部mRNAmRNA為模板，利用為模板，利用逆轉(zhuǎn)逆轉(zhuǎn)錄酶合成與錄酶合成與mRNAmRNA互補的互補的DNADNA（cDNAcDNA）再復(fù)制成再復(fù)制成雙鏈雙鏈cDNA,cDNA,與適當(dāng)?shù)妮d體連接后與適當(dāng)?shù)妮d體連接后轉(zhuǎn)化入受體菌，轉(zhuǎn)化入受體菌，得到含得到含全部表達(dá)基因全部表達(dá)基因的種群，稱為的種群，稱為C-C-文庫文庫(cDNA library)(cDNA library)。C-C-文庫具有文庫具有組織細(xì)胞特異性組織細(xì)胞特異性。如已知目的基因兩如已知目的基因兩端的序列，則可采端的序列，則可采用 聚 合 酶 鏈 反 應(yīng)用 聚 合 酶 鏈 反 應(yīng)（PCRPCR）技術(shù)，在）技術(shù)，在體外合成目的基因。體外合成目的基因。但此法可能會造成但此法可能會造成克隆的目的基因堿克隆的目的基因堿基序列的改變?；蛄械母淖儭＠美肞CR合成合成：第三節(jié)第三節(jié) 重組重組DNA技術(shù)中的技術(shù)中的DNA載體載體DNA Vectors in Recombinant DNA Technology 載體（載體（vectorvector）是為攜帶感興趣的外源是為攜帶感興趣的外源DNADNA，實現(xiàn)，實現(xiàn)外源外源DNADNA在受體細(xì)胞中的無性繁殖或表達(dá)有意義的在受體細(xì)胞中的無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些蛋白質(zhì)所采用的一些DNADNA分子分子 按功能分按功能分克隆載體（克隆載體（cloning vector）表達(dá)載體（表達(dá)載體（expression vector）按基本元件按基本元件的來源不同的來源不同質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體噬菌體載體噬菌體載體黏粒載體黏粒載體病毒載體病毒載體人工染色體載體等人工染色體載體等載體概述載體概述克隆載體克隆載體(cloning vector)為使插入的外源為使插入的外源DNA序列被擴增而特意序列被擴增而特意設(shè)計的載體稱為設(shè)計的載體稱為克隆載體?？寺≥d體。表達(dá)載體表達(dá)載體(expression vector)為使插入的外源為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄和翻譯序列可轉(zhuǎn)錄和翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為成多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為表達(dá)載體。表達(dá)載體。一、克隆載體用于外源一、克隆載體用于外源DNADNA的克隆和無性繁殖的克隆和無性繁殖（一）克隆載體應(yīng)具備的主要特點（一）克隆載體應(yīng)具備的主要特點n至少有一個至少有一個復(fù)制起點復(fù)制起點（origin of replication,ori）n至少有一個至少有一個選擇性標(biāo)志選擇性標(biāo)志（selection marker）n有適宜的限制性內(nèi)切酶的有適宜的限制性內(nèi)切酶的單一單一切點：稱為切點：稱為多克隆多克隆位點位點（multiple cloning sites，MCS）n應(yīng)有較高的拷貝數(shù)。應(yīng)有較高的拷貝數(shù)。pBR322質(zhì)粒圖譜質(zhì)粒圖譜 1.1.質(zhì)粒質(zhì)粒(plasmid)特點：能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨立自主復(fù)制；帶有某些特點：能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息遺傳信息,會賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。會賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。（二）（二）常用克隆載體有多種常用克隆載體有多種質(zhì)粒的特性質(zhì)粒的特性分子較小分子較小自主復(fù)制自主復(fù)制可轉(zhuǎn)移性可轉(zhuǎn)移性不相容性不相容性選擇性標(biāo)記選擇性標(biāo)記多克隆位點多克隆位點pUC系列質(zhì)粒圖譜系列質(zhì)粒圖譜噬菌體噬菌體DNA改造系統(tǒng)改造系統(tǒng) gt系列（插入型，適用于系列（插入型，適用于cDNA克?。┛寺。〦MBL系列（置換型，適用于基因組系列（置換型，適用于基因組DNA克?。┛寺。ヽos位點位點:噬菌體噬菌體DNA為線性雙鏈分子，兩端各有一條為線性雙鏈分子，兩端各有一條由由12個堿基組成、彼此完全互補且個堿基組成、彼此完全互補且5單鏈突出的序列單鏈突出的序列（即粘性末端），稱（即粘性末端），稱cos位點位點 2.噬菌體噬菌體(phage)M13噬菌體噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含改造系統(tǒng)（含lacZ基因）基因）M13mp系列系列3.穿梭載體（穿梭載體（shuttle vector）人工構(gòu)建，含有不止一個復(fù)制起點，能攜帶外人工構(gòu)建，含有不止一個復(fù)制起點，能攜帶外源源DNA序列在不同種類宿主細(xì)胞中復(fù)制、擴增。序列在不同種類宿主細(xì)胞中復(fù)制、擴增。u 表達(dá)載體是指用來在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源基因表達(dá)載體是指用來在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體的載體u 依據(jù)其宿主細(xì)胞的不同可分為依據(jù)其宿主細(xì)胞的不同可分為:原核表達(dá)載體（原核表達(dá)載體（prokaryotic expression vectorprokaryotic expression vector）真核表達(dá)載體（真核表達(dá)載體（eukaryotic expression vectoreukaryotic expression vector）二、表達(dá)載體用于外源二、表達(dá)載體用于外源DNA的表達(dá)的表達(dá)（一）（一）原核表達(dá)載體用于在原核細(xì)胞中表達(dá)外原核表達(dá)載體用于在原核細(xì)胞中表達(dá)外源基因源基因 從克隆載體發(fā)展而來，其除了具備克隆載體的一般特點外，從克隆載體發(fā)展而來，其除了具備克隆載體的一般特點外，還需有還需有調(diào)控外源基因有效轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列調(diào)控外源基因有效轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列，如啟動子、核糖，如啟動子、核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄終止序列等。目前應(yīng)用最廣泛的原核表達(dá)載體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄終止序列等。目前應(yīng)用最廣泛的原核表達(dá)載體是大腸桿菌表達(dá)載體。原核表達(dá)載體的基本組成如下：體是大腸桿菌表達(dá)載體。原核表達(dá)載體的基本組成如下：R：調(diào)節(jié)序列；：調(diào)節(jié)序列；P：啟動子；：啟動子；SD：SD序列；序列；TT：轉(zhuǎn)錄終止序列：轉(zhuǎn)錄終止序列大腸桿菌表達(dá)載體大腸桿菌表達(dá)載體（二）真核表達(dá)載體用于在真核細(xì)胞中表（二）真核表達(dá)載體用于在真核細(xì)胞中表達(dá)外源基因達(dá)外源基因 真核表達(dá)載體包括在大腸桿菌中起作用的復(fù)制起始位真核表達(dá)載體包括在大腸桿菌中起作用的復(fù)制起始位點、抗生素抗性基因、多克隆位點等。點、抗生素抗性基因、多克隆位點等。真核表達(dá)載體中還具有：真核表達(dá)載體中還具有：真核表達(dá)調(diào)控元件：包括啟動子、增強子、轉(zhuǎn)錄終真核表達(dá)調(diào)控元件：包括啟動子、增強子、轉(zhuǎn)錄終止序列、止序列、poly A 加尾信號等加尾信號等 真核細(xì)胞復(fù)制起始序列真核細(xì)胞復(fù)制起始序列 真核細(xì)胞藥物抗性基因真核細(xì)胞藥物抗性基因 真核表達(dá)載體的基本組成真核表達(dá)載體的基本組成 OriPro：原核復(fù)制起始序列；P：啟動子；MCS：多克隆位點；TT：轉(zhuǎn)錄終止序列；orieuk：真核復(fù)制起始序列。酵母表達(dá)載體酵母表達(dá)載體昆蟲表達(dá)載體昆蟲表達(dá)載體哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體根據(jù)真核宿主細(xì)胞的不同，真核表達(dá)載體可主要根據(jù)真核宿主細(xì)胞的不同，真核表達(dá)載體可主要分為分為 ：載體上的常用標(biāo)志或標(biāo)簽n載體上的標(biāo)志（載體上的標(biāo)志（marker）：通常用于重組子或陽性克隆的）：通常用于重組子或陽性克隆的篩選、鑒定篩選、鑒定n常見的標(biāo)志有：常見的標(biāo)志有：抗生素抗性基因抗生素抗性基因 a.用于細(xì)菌重組子篩選的抗生素抗性基因用于細(xì)菌重組子篩選的抗生素抗性基因 b.用于哺乳類細(xì)胞陽性克隆篩選的抗生素抗性基因用于哺乳類細(xì)胞陽性克隆篩選的抗生素抗性基因 酶的編碼基因酶的編碼基因 營養(yǎng)缺陷選擇標(biāo)志營養(yǎng)缺陷選擇標(biāo)志第四節(jié)第四節(jié) DNADNA克隆的基本過程克隆的基本過程Procedure of DNA CloningProcedure of DNA Cloning 目的目的DNA的分離獲取（分）的分離獲?。ǚ郑┹d體的選擇與準(zhǔn)備（擇）載體的選擇與準(zhǔn)備（擇）（目的（目的DNA和載體的酶切（切）和載體的酶切（切）目的目的DNA與載體連接（接）與載體連接（接）重組重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)）轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)）重組體的篩選與鑒定（篩）重組體的篩選與鑒定（篩）DNA克隆的基本過程克隆的基本過程三、外源基因與載體的連接（接）三、外源基因與載體的連接（接）1.1.粘性末端連接粘性末端連接方式：方式：(1)(1)同一限制酶切位點連接同一限制酶切位點連接(2)(2)不同限制酶切位點連接不同限制酶切位點連接配伍末端連接配伍末端連接非配伍末端連接非配伍末端連接二、克隆載體的選擇和構(gòu)建（擇）二、克隆載體的選擇和構(gòu)建（擇）或或者切者切一、分離獲取目的一、分離獲取目的DNADNA有多種方法（分）有多種方法（分）載體載體插入插入DNA片段片段宿主細(xì)胞宿主細(xì)胞質(zhì)粒質(zhì)粒510kb細(xì)菌，酵母細(xì)菌，酵母噬菌體載體噬菌體載體20kb細(xì)菌細(xì)菌黏粒黏粒50 kb細(xì)菌細(xì)菌BAC400kb細(xì)菌細(xì)菌YAC3 Mb酵母酵母不同載體的克隆容量及適宜宿主細(xì)胞不同載體的克隆容量及適宜宿主細(xì)胞 三、外源基因與載體的連接（接）三、外源基因與載體的連接（接）1.1.粘性末端連接粘性末端連接方式：方式：(1)(1)同一限制酶切位點連接同一限制酶切位點連接(2)(2)不同限制酶切位點連接不同限制酶切位點連接配伍末端連接配伍末端連接非配伍末端連接非配伍末端連接Bam H切割反應(yīng)切割反應(yīng) GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶連接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG載體載體DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重組體重組體GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG載體自連載體自連目的基因自連目的基因自連同一限制酶切位點連接同一限制酶切位點連接不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位點切割位點GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABg l切割位點切割位點AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+Bg l雙酶切雙酶切Eco R+Bg l雙酶切雙酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體配伍末端的配伍末端的連接情況和同一連接情況和同一限制酶切位點連限制酶切位點連接相似。接相似。2.2.平端連接平端連接適用于：適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補齊或切平形成的平端粘端補齊或切平形成的平端目的基因目的基因載體載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體載體自連載體自連目的基因目的基因 自連自連3.3.同聚物加尾連接同聚物加尾連接在在末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase)(terminal transferase)的作用下，在的作用下，在DNADNA片段末端加上同聚物序列、片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。制造出粘性末端，再進行粘端連接。5 3 3 5 載體載體DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或機械剪切限制酶或機械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 5 3 A(A)nA A(A)nA3 5-核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體4.4.人工接頭人工接頭(linker)(linker)連接連接由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進行粘端連接。除產(chǎn)生粘性末端，而進行粘端連接。人工接頭及其應(yīng)用人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R受體菌條件受體菌條件安全安全宿主菌宿主菌 限制酶和重組酶缺陷限制酶和重組酶缺陷處于處于感受態(tài)感受態(tài)(competent)(competent)感受態(tài)細(xì)胞：受體細(xì)胞經(jīng)處理后處于最適攝取和容忍感受態(tài)細(xì)胞：受體細(xì)胞經(jīng)處理后處于最適攝取和容忍重組體的狀態(tài)。重組體的狀態(tài)。四、重組四、重組DNADNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)）轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)）轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)化（transformation）質(zhì)粒質(zhì)粒酵母菌（真核細(xì)胞）酵母菌（真核細(xì)胞）轉(zhuǎn)染（轉(zhuǎn)染（transfection）外源外源DNA真核細(xì)胞（酵母除外）真核細(xì)胞（酵母除外）噬菌體噬菌體DNA感受態(tài)細(xì)菌感受態(tài)細(xì)菌 感染（感染（infection）噬菌體顆粒噬菌體顆粒細(xì)菌細(xì)菌 病毒顆粒病毒顆粒哺乳細(xì)胞哺乳細(xì)胞導(dǎo)入方式導(dǎo)入方式將重組將重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞的常用方法轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞的常用方法n化學(xué)法：化學(xué)法：氯化鈣化學(xué)轉(zhuǎn)化氯化鈣化學(xué)轉(zhuǎn)化 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染n物理法：物理法：電擊法電擊法 顯微注射法顯微注射法 等等n生物法：生物法：病毒介導(dǎo)的感染病毒介導(dǎo)的感染 電擊法（電穿孔法）顯微注射法（五）重組體的篩選（五）重組體的篩選 1.1.直接選擇法直接選擇法針對基因設(shè)計的篩選方法針對基因設(shè)計的篩選方法(1)(1)抗藥性標(biāo)記選擇抗藥性標(biāo)記選擇(2)(2)標(biāo)志補救標(biāo)志補救(marker rescue)(marker rescue)(3)(3)分子雜交法分子雜交法 原位雜交原位雜交 SouthernSouthern印跡印跡2.2.免疫學(xué)方法免疫學(xué)方法針對表達(dá)的產(chǎn)物設(shè)計的方法針對表達(dá)的產(chǎn)物設(shè)計的方法如：免疫化學(xué)方法及酶免檢測分析等如：免疫化學(xué)方法及酶免檢測分析等(插入失活法插入失活法)抗藥性標(biāo)記選擇抗藥性標(biāo)記選擇組氨酸缺陷組氨酸缺陷型大腸桿菌型大腸桿菌無組氨酸無組氨酸的培養(yǎng)基的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因酸脫水酶基因促進組氨酸合成促進組氨酸合成 DNADNA重組體重組體標(biāo)志補救標(biāo)志補救藍(lán)白選擇藍(lán)白選擇 互補的檢測互補的檢測標(biāo)志補救標(biāo)志補救MCS有插入片段MCS無插入片段-半乳糖苷酶X-Gal 藍(lán)色Lac Z基因MCS載體上有載體上有-半乳糖苷酶半乳糖苷酶N端編碼序列端編碼序列，細(xì)菌染色體細(xì)菌染色體DNA有有-半乳糖苷酶半乳糖苷酶C端編碼序列端編碼序列-互補（藍(lán)互補（藍(lán)-白篩選）白篩選）原原位位雜雜交交Southern印跡印跡雞的雞的肌球蛋白的克隆和檢出肌球蛋白的克隆和檢出序列特異性篩選序列特異性篩選(1)RERE酶切法酶切法(2)PCR法法(3)核酸雜交法核酸雜交法(4)DNA測序法測序法 重組重組DNA技術(shù)操作的主要步驟技術(shù)操作的主要步驟載體載體質(zhì)粒質(zhì)粒噬菌體噬菌體病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因組基因組DNA cDNA 人工合成人工合成PCR產(chǎn)物產(chǎn)物限制酶消化限制酶消化開環(huán)載體開環(huán)載體DNA目的基目的基因因連接酶連接酶重組體重組體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主帶重組體的宿主篩選篩選表型篩選表型篩選酶切電泳鑒定酶切電泳鑒定菌落原位雜交菌落原位雜交表達(dá)體系的建立表達(dá)體系的建立表達(dá)載體的構(gòu)建表達(dá)載體的構(gòu)建受體細(xì)胞的建立受體細(xì)胞的建立表達(dá)產(chǎn)物的分離純化表達(dá)產(chǎn)物的分離純化（六）克隆基因的表達(dá)（六）克隆基因的表達(dá)優(yōu)點：優(yōu)點：選擇標(biāo)志選擇標(biāo)志強啟動子強啟動子 翻譯調(diào)控序列翻譯調(diào)控序列多接頭克隆位點多接頭克隆位點缺點：缺點：不宜表達(dá)真核基因組不宜表達(dá)真核基因組DNADNA不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體 (inclusion body)(inclusion body)很難表達(dá)大量可溶性蛋白很難表達(dá)大量可溶性蛋白1.1.原核表達(dá)體系原核表達(dá)體系 （E.coliE.coli表達(dá)體系最為常用）表達(dá)體系最為常用）mRNA阻遏蛋白阻遏蛋白無誘導(dǎo)物（無誘導(dǎo)物（IPTG）時）時在天然狀態(tài)下，呈低限轉(zhuǎn)錄水平在天然狀態(tài)下，呈低限轉(zhuǎn)錄水平（以乳糖操縱子的啟動子（以乳糖操縱子的啟動子Plac為例）為例）IDNAOPpol阻遏基因阻遏基因外源基因外源基因mRNA阻遏蛋白阻遏蛋白有誘導(dǎo)物（有誘導(dǎo)物（IPTG）時）時IDNAOPpol啟動轉(zhuǎn)錄啟動轉(zhuǎn)錄mRNAIPTG外源基因外源基因可通過可通過IPTG誘導(dǎo)增強其轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)增強其轉(zhuǎn)錄水平IPTG誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白的表達(dá)優(yōu)點：優(yōu)點：可表達(dá)克隆的可表達(dá)克隆的cDNAcDNA及真核基因組及真核基因組DNADNA可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì)可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累缺點：缺點：操作技術(shù)難、費時、經(jīng)濟操作技術(shù)難、費時、經(jīng)濟轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程 磷酸鈣轉(zhuǎn)染磷酸鈣轉(zhuǎn)染DEAEDEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染電穿孔電穿孔 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 顯微注射顯微注射 2.2.真核表達(dá)體系真核表達(dá)體系 酵母、昆蟲、乳類動物細(xì)胞酵母、昆蟲、乳類動物細(xì)胞 方法的選擇決定方法的選擇決定于細(xì)胞的種類、特性于細(xì)胞的種類、特性及表達(dá)載體的性質(zhì)及表達(dá)載體的性質(zhì)表達(dá)載體表達(dá)載體pFASTBACI 的物理圖譜的物理圖譜（一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克?。ㄒ唬┘膊』虻陌l(fā)現(xiàn)與克隆根據(jù)基因定位克隆之并研究其性質(zhì)，而認(rèn)根據(jù)基因定位克隆之并研究其性質(zhì)，而認(rèn)識疾病的分子機制。識疾病的分子機制。三、重組技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系三、重組技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系（二）生物制藥（二）生物制藥 美國美國Eli Lilly公司于公司于1982年首先利用重組年首先利用重組DNA技術(shù)合技術(shù)合成人胰島素并投放市場，標(biāo)志著生物工程藥物時代的成人胰島素并投放市場，標(biāo)志著生物工程藥物時代的開始。迄今為止，已有開始。迄今為止，已有50多種基因工程藥物上市，近多種基因工程藥物上市，近千種處于研發(fā)狀態(tài)，形成一個巨大的高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)，千種處于研發(fā)狀態(tài)，形成一個巨大的高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)，產(chǎn)生了不可估量的社會效益和經(jīng)濟效益。產(chǎn)生了不可估量的社會效益和經(jīng)濟效益。重組重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn) 品功 能組織胞漿素原激活劑抗凝血液因子VIII促進凝血顆粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子剌激白細(xì)胞生成促紅細(xì)胞生成素剌激白細(xì)胞生成生長因子(bFGF,EGF)刺激細(xì)胞生長與分化生長素治療侏儒癥胰島素治療糖尿病干擾素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些腫瘤白細(xì)胞介素激活、剌激各類白細(xì)胞超氧化物歧化酶抗組織損傷單克隆抗體利用其結(jié)合特異性進行診斷試驗、腫瘤導(dǎo)向治療乙肝疫苗(CHO,酵母)預(yù)防乙肝口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗預(yù)防霍亂