醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)原理：第7章 第4節(jié) 分子雜交和印跡技術(shù) 第5節(jié) 文庫

基因操作基因操作第七章第七章Gene ManipulatingGene Manipulating2022年年7月月21日日11時時16分分12022年年7月月21日日11時時16分分2Molecular Blotting&Hybridization Technology2022年年7月月21日日11時時16分分3 核酸雜交技術(shù)的理論基礎(chǔ)：核酸雜交技術(shù)的理論基礎(chǔ)：DNADNA變性復(fù)性現(xiàn)象變性復(fù)性現(xiàn)象。(heteroduplex)2022年年7月月21日日11時時16分分4一、印跡技術(shù)一、印跡技術(shù)(blotting)u19751975年年Edwen SouthernEdwen Southern建立的建立的DNADNA印跡雜交。印跡雜交。指將電泳凝膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移指將電泳凝膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移(印跡印跡)于固定于固定化介質(zhì)如化介質(zhì)如硝酸纖維素膜硝酸纖維素膜上并加以檢測分析的技術(shù)。上并加以檢測分析的技術(shù)。支持物支持物轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移緩緩沖沖液液紙紙巾巾玻璃板玻璃板500g（1 1）印跡：）印跡：電轉(zhuǎn)移電轉(zhuǎn)移真空負(fù)壓吸引轉(zhuǎn)移真空負(fù)壓吸引轉(zhuǎn)移WhatmanWhatman濾紙濾紙凝膠凝膠WhatmanWhatman濾紙濾紙重物重物NCNC膜或尼龍膜膜或尼龍膜毛細(xì)作用轉(zhuǎn)移毛細(xì)作用轉(zhuǎn)移2022年年7月月21日日11時時16分分5 NCNC膜上載有的膜上載有的DNADNA單鏈分子可以在雜交液中與單鏈分子可以在雜交液中與另一種另一種DNADNA或或RNARNA分子分子(稱為稱為探針探針，可用同位素或非，可用同位素或非同位素同位素標(biāo)記標(biāo)記)進(jìn)行雜交。進(jìn)行雜交。具有互補序列的具有互補序列的RNARNA或或DNADNA標(biāo)記探針結(jié)合到存在標(biāo)記探針結(jié)合到存在于于NCNC膜的膜的單鏈單鏈DNADNA分子上，經(jīng)分子上，經(jīng)放射自顯影放射自顯影或其他檢或其他檢測技術(shù)就可以顯現(xiàn)雜交分子的有無和位置。測技術(shù)就可以顯現(xiàn)雜交分子的有無和位置。（2 2）雜交：）雜交：（3 3）顯示：）顯示：2022年年7月月21日日11時時16分分6（1）特定基因序列的定性和定量分析）特定基因序列的定性和定量分析u核酸分子雜交應(yīng)用核酸分子雜交應(yīng)用（2）基因克隆的篩選）基因克隆的篩選（3）酶切圖譜的制作）酶切圖譜的制作（4）基因突變分析）基因突變分析（5）疾病的診斷）疾病的診斷2022年年7月月21日日11時時16分分7二、探針的種類和制備二、探針的種類和制備探針探針(probe)的概念：的概念：用來檢測某一特定核苷酸序列或基因序列用來檢測某一特定核苷酸序列或基因序列的的DNA或或RNA的的互補標(biāo)記片段：互補標(biāo)記片段：與待測與待測特定核苷酸特定核苷酸的某一段序列相的某一段序列相互互補；補；有明確的標(biāo)志用于后續(xù)的檢測。有明確的標(biāo)志用于后續(xù)的檢測。2022年年7月月21日日11時時16分分8探針的種類探針的種類寡核苷酸探針寡核苷酸探針基因組基因組DNA探針探針cDNA探針探針RNA探針探針（一）常用探針的種類（一）常用探針的種類DNA探針探針2022年年7月月21日日11時時16分分91DNA探針探針雙鏈探針雙鏈探針:單鏈探針單鏈探針 從克隆在質(zhì)粒載體中的特異性基因片段制備；從克隆在質(zhì)粒載體中的特異性基因片段制備；優(yōu)點則是容易制備。優(yōu)點則是容易制備。用化學(xué)法合成或從克隆在用化學(xué)法合成或從克隆在M13噬菌體的特異性噬菌體的特異性基因片段制備；基因片段制備；優(yōu)點是優(yōu)點是在雜交反應(yīng)中可以排除互補在雜交反應(yīng)中可以排除互補鏈的干擾。鏈的干擾。2022年年7月月21日日11時時16分分102RNA探針探針早期采用細(xì)胞早期采用細(xì)胞mRNAmRNA和病毒和病毒RNARNA作探針作探針 主要用于研究目的，而不是用于檢測。如篩選主要用于研究目的，而不是用于檢測。如篩選HIV的基因組的基因組DNA克隆、進(jìn)行中的克隆、進(jìn)行中的轉(zhuǎn)錄分析轉(zhuǎn)錄分析等式。等式。與與DNA單鏈探針相比，單鏈探針相比，RNA探針具有標(biāo)記效探針具有標(biāo)記效率高、易于純化、成本低和雜交信號強等優(yōu)點率高、易于純化、成本低和雜交信號強等優(yōu)點 標(biāo)記是在細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄或病毒復(fù)制過程，效率標(biāo)記是在細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄或病毒復(fù)制過程，效率往往不高，且受多種因素的制約。往往不高，且受多種因素的制約。2022年年7月月21日日11時時16分分11（二）核酸探針的標(biāo)記（二）核酸探針的標(biāo)記核酸探針的標(biāo)記可分為核酸探針的標(biāo)記可分為放射性標(biāo)記放射性標(biāo)記和和非放射性標(biāo)非放射性標(biāo)記記；根據(jù)標(biāo)記物摻入情況可分為；根據(jù)標(biāo)記物摻入情況可分為均勻標(biāo)記均勻標(biāo)記和和末端標(biāo)記末端標(biāo)記探針。探針。理想標(biāo)記物理想標(biāo)記物應(yīng)備條件應(yīng)備條件不影響堿基對特異性不影響堿基對特異性有較高的化學(xué)穩(wěn)定性有較高的化學(xué)穩(wěn)定性檢測方法高度特異、靈敏檢測方法高度特異、靈敏標(biāo)記及檢測方法簡單標(biāo)記及檢測方法簡單環(huán)保，無損害環(huán)保，無損害價格低廉價格低廉2022年年7月月21日日11時時16分分12優(yōu)點優(yōu)點缺點缺點靈敏度和特異性極高靈敏度和特異性極高半衰期短半衰期短,隨用隨標(biāo)隨用隨標(biāo)1.1.放射性同位素標(biāo)記探針放射性同位素標(biāo)記探針對各種酶促反應(yīng)無任何影響對各種酶促反應(yīng)無任何影響不影響堿基配對的特異性與穩(wěn)定性不影響堿基配對的特異性與穩(wěn)定性放射性污染放射性污染 用于核酸探針標(biāo)記的放射性同位素主要用于核酸探針標(biāo)記的放射性同位素主要有有32P、3H和和35S等；等；32P應(yīng)用最多應(yīng)用最多。2022年年7月月21日日11時時16分分13r-32P ATPa-32P dATP*3H2dATP2022年年7月月21日日11時時16分分14*32P的放射性較強，放射自顯影所需時間較短，的放射性較強，放射自顯影所需時間較短，靈敏度高，可廣泛應(yīng)用于各種印跡雜交。靈敏度高，可廣泛應(yīng)用于各種印跡雜交。缺點是半衰期短缺點是半衰期短(14.3天天)，射線散射嚴(yán)重，放，射線散射嚴(yán)重，放射自顯影后射自顯影后X膠片上的信號有時邊緣不清。膠片上的信號有時邊緣不清。(1)DNA(1)DNA切口平移切口平移 標(biāo)記法標(biāo)記法2022年年7月月21日日11時時16分分15u核酸探針的標(biāo)記方法核酸探針的標(biāo)記方法DNA酶酶：在雙：在雙鏈鏈DNADNA上隨機打開上隨機打開若干個單鏈缺口，若干個單鏈缺口，產(chǎn)生產(chǎn)生3 3-OH-OH端。端。大腸桿菌大腸桿菌DNA聚聚合酶合酶：5 533 DNADNA聚合酶活性；聚合酶活性；5 533 外切核酸外切核酸酶活性。酶活性。DNADNA切口平移標(biāo)記法示意圖切口平移標(biāo)記法示意圖2022年年7月月21日日11時時16分分16(2)DNA(2)DNA隨機引物標(biāo)記法隨機引物標(biāo)記法2022年年7月月21日日11時時16分分17隨機引物隨機引物：含有各種：含有各種可能排列順序的寡核可能排列順序的寡核苷酸片段的混合物。苷酸片段的混合物。46=4096DNA聚合酶聚合酶KlenowKlenow片段片段：保留：保留5 533 DNADNA聚合酶活性聚合酶活性,弱弱3 355外切酶活性，外切酶活性，無無5 533外切酶活性。外切酶活性。DNA隨機引物標(biāo)記法示意圖隨機引物標(biāo)記法示意圖2022年年7月月21日日11時時16分分182022年年7月月21日日11時時16分分19 條件是有條件是有5-OHOH存在，人工合成寡核苷酸最常用；存在，人工合成寡核苷酸最常用；雙鏈雙鏈DNADNA需用堿性磷酸酶切除需用堿性磷酸酶切除5-P P后再標(biāo)記后再標(biāo)記5p-HO-CpGpTpA35HO-CpGpTpA3T4噬菌體多核苷酸激酶噬菌體多核苷酸激酶-32P-ATP532p-O-CpGpTpA337，反應(yīng)，反應(yīng)10min,-32P-ATP 需需150 ci/反應(yīng)反應(yīng)1)DNA的的5末端標(biāo)記末端標(biāo)記堿性磷酸酶堿性磷酸酶2022年年7月月21日日11時時16分分20(3)DNA的末端標(biāo)記的末端標(biāo)記5 3 3 5 完整雙鏈完整雙鏈DNA限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶5 3 3 5-32P-dNTP其他其他3 種種dNTPKlenow DNA聚合酶聚合酶5 3 3 5 變性變性5 3 3 5 5 末端突出末端突出的的DNA3 末端標(biāo)記的末端標(biāo)記的DNA32P-末端標(biāo)記的末端標(biāo)記的單鏈單鏈DNA探針探針2)DNA的的3末端標(biāo)記末端標(biāo)記(3)DNA的末端標(biāo)記的末端標(biāo)記2022年年7月月21日日11時時16分分21標(biāo)記探針的純化標(biāo)記探針的純化凝膠過濾層析凝膠過濾層析 常用的凝膠基質(zhì)：常用的凝膠基質(zhì)：Sephadex G-50Sephadex G-50、Bio-Gel P-60Bio-Gel P-60選擇性沉淀選擇性沉淀 乙醇存在，醋酸銨可起此作用。乙醇存在，醋酸銨可起此作用。2022年年7月月21日日11時時16分分22u核酸探針的標(biāo)記方法核酸探針的標(biāo)記方法(1)DNA切口平移標(biāo)記法切口平移標(biāo)記法(2)DNA隨機引物標(biāo)記法隨機引物標(biāo)記法(7)RNA探針的標(biāo)記探針的標(biāo)記(3)DNA的末端標(biāo)記的末端標(biāo)記(4)cDNA探針的標(biāo)記探針的標(biāo)記(5)寡核苷酸探針的標(biāo)記寡核苷酸探針的標(biāo)記(6)單鏈單鏈DNA探針的標(biāo)記探針的標(biāo)記2022年年7月月21日日11時時16分分232.2.非放射性標(biāo)記物非放射性標(biāo)記物優(yōu)點優(yōu)點缺點缺點靈敏度較靈敏度較放射性同位素標(biāo)記低放射性同位素標(biāo)記低無放射性污染無放射性污染 用于核酸探針標(biāo)記的用于核酸探針標(biāo)記的非放射性標(biāo)記物非放射性標(biāo)記物主主要有要有生物素生物素、地高辛和熒光素地高辛和熒光素(FITC、羅丹、羅丹明明)等。等。穩(wěn)定性好穩(wěn)定性好,可較長時間存放可較長時間存放特異性較特異性較放射性同位素標(biāo)記低放射性同位素標(biāo)記低2022年年7月月21日日11時時16分分242022年年7月月21日日11時時16分分25The method used to produce nonradioactive DNA molecules that carry a specific chemical marker that can be detected with an appropriate antibody.biotin-avidin systemDig-dUTP 電泳電泳,轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜，紫外交聯(lián)固定紫外交聯(lián)固定D DD D2022年年7月月21日日11時時16分分26 用無關(guān)的單鏈用無關(guān)的單鏈DNADNA，如小牛胸腺如小牛胸腺DNADNA或鮭或鮭魚精子魚精子DNADNA預(yù)雜交。預(yù)雜交。OHNHHNSHHOO關(guān)于生物素關(guān)于生物素2022年年7月月21日日11時時16分分27雜交：生物雜交：生物素標(biāo)記的探針?biāo)貥?biāo)記的探針與靶與靶DNADNA結(jié)合結(jié)合底物在底物在HRPHRP催催化下化下,反應(yīng)發(fā)光反應(yīng)發(fā)光洗膜封閉洗膜封閉電泳電泳,轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜，紫外交聯(lián)固定紫外交聯(lián)固定SASAHRPHRP底物底物B BB BHRPHRP標(biāo)記的鏈標(biāo)記的鏈親和素與探針上親和素與探針上的生物素結(jié)合的生物素結(jié)合2022年年7月月21日日11時時16分分281.1.曝光：曝光：用濾紙吸去雜交膜上多余底物，作好標(biāo)記，用濾紙吸去雜交膜上多余底物，作好標(biāo)記，保鮮膜包裹，放在暗夾里，放上保鮮膜包裹，放在暗夾里，放上X X光片，曝光光片，曝光1-51-5 分鐘；分鐘；2.2.顯影：顯影：取出取出X X光片，按使用說明書顯影和定影。光片，按使用說明書顯影和定影。化學(xué)發(fā)光檢測化學(xué)發(fā)光檢測 Luminol化學(xué)發(fā)光原理化學(xué)發(fā)光原理 2022年年7月月21日日11時時16分分29思考題思考題：三、印跡技術(shù)的種類和用途三、印跡技術(shù)的種類和用途（一）（一）DNADNA印跡雜交技術(shù)印跡雜交技術(shù)（二）（二）RNARNA印跡雜交技術(shù)印跡雜交技術(shù)（四）蛋白質(zhì)印跡雜交技術(shù)（四）蛋白質(zhì)印跡雜交技術(shù)（三）其它核酸印跡雜交技術(shù)（三）其它核酸印跡雜交技術(shù)2022年年7月月21日日11時時16分分302022年年7月月21日日11時時16分分312022年年7月月21日日11時時16分分32探針雜交帶曝光顯影探針雜交帶曝光顯影支支持持物物轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移緩緩沖沖液液WhatWhatmanman濾紙濾紙凝膠凝膠WhatmWhatmanan濾濾紙紙紙紙巾巾玻璃玻璃板板重物重物500gNCNC膜膜或尼或尼龍膜龍膜2022年年7月月21日日11時時16分分342022年年7月月21日日11時時16分分35 將菌落或噬菌斑影印在尼龍膜上將菌落或噬菌斑影印在尼龍膜上(以前用硝酸纖以前用硝酸纖維膜維膜)，這種膜只吸附單鏈，這種膜只吸附單鏈DNADNA；用用NaOHNaOH處理，這樣不僅可以殺死細(xì)菌，同時可處理，這樣不僅可以殺死細(xì)菌，同時可使使DNADNA變性吸附在膜上；變性吸附在膜上；用無關(guān)的單鏈用無關(guān)的單鏈DNADNA，如小牛胸腺，如小牛胸腺DNADNA和鮭魚精子和鮭魚精子DNADNA預(yù)雜交。預(yù)雜交。膜經(jīng)中和后再將標(biāo)記探針和膜放在緩沖溶液中膜經(jīng)中和后再將標(biāo)記探針和膜放在緩沖溶液中緩緩復(fù)性，經(jīng)放射自顯影來確定陽性菌落。緩緩復(fù)性，經(jīng)放射自顯影來確定陽性菌落。2022年年7月月21日日11時時16分分362022年年7月月21日日11時時16分分372022年年7月月21日日11時時16分分38Screening a genomic library by colony hybridization.2022年年7月月21日日11時時16分分39限制酶切位點限制酶切位點限制酶消化限制酶消化 除去中間片段除去中間片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色體色體DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA與載體與載體DNA混合混合 連接反應(yīng)連接反應(yīng) 體外包裝體外包裝 感染大腸桿菌感染大腸桿菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 gDNA文庫文庫7/21/2022 11:16 AM40重組噬菌體重組噬菌體2022年年7月月21日日11時時16分分412022年年7月月21日日11時時16分分42(1)(1)蛋白樣品的制備蛋白樣品的制備(2)(2)SDS-PAGESDS-PAGE(3)(3)轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜(4)(4)封閉封閉(5)(5)抗體雜交及抗體雜交及 底物顯色底物顯色蛋白樣品的制備蛋白樣品的制備2022年年7月月21日日11時時16分分441M Tris-HCl(pH6.8)10 ml1M DTT20 mlSDS4 g甘油甘油20 ml溴酚藍(lán)溴酚藍(lán)0.2 g總體積總體積100ml100mM Tris-HCl(pH6.8)200mM DTT4%SDS20%甘油甘油0.2%溴酚蘭溴酚蘭ddH2O2SDS-PAGE上樣緩沖液：上樣緩沖液：按按1:1與蛋白質(zhì)樣品混合，與蛋白質(zhì)樣品混合，95-100加熱加熱5-15min，冰上冷卻后，上樣冰上冷卻后，上樣20-25l，總蛋白量，總蛋白量20-50g。2022年年7月月21日日11時時16分分46Staking gelSeparating gel（2 2）SDSSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳2022年年7月月21日日11時時16分分47濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)（3 3）轉(zhuǎn)膜）轉(zhuǎn)膜2022年年7月月21日日11時時16分分48半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)2022年年7月月21日日11時時16分分49常用的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移膜常用的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移膜種類種類 微孔大小微孔大小 結(jié)合能力結(jié)合能力 特點特點NCNC膜膜0.45 um 80-100 ug/cm2應(yīng)用廣泛 20kD易丟失PVDFPVDF膜膜0.22 um0.22 um 80-100 ug/cm2170-200 ug/cm2 20kD不易丟失容量大、強度高尼龍膜尼龍膜 480 ug/cm2 蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，換水幾次。轉(zhuǎn)膜后檢測（此步可以省略）轉(zhuǎn)膜后檢測（此步可以省略）只用于放射性標(biāo)記抗體或放射性標(biāo)記A蛋白探針的Western印跡過程。2022年年7月月21日日11時時16分分51（4 4）封閉）封閉2022年年7月月21日日11時時16分分52（5）抗體結(jié)合及底物顯色）抗體結(jié)合及底物顯色2022年年7月月21日日11時時16分分532022年年7月月21日日11時時16分分542022年年7月月21日日11時時16分分552022年年7月月21日日11時時16分分56 Southern Northern Western樣品樣品DNARNA蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)限制性內(nèi)限制性內(nèi)切酶消化切酶消化需要需要 不需要不需要 不需要不需要 電泳電泳瓊脂糖凝瓊脂糖凝膠電泳膠電泳瓊脂糖凝瓊脂糖凝膠電泳膠電泳SDS-PAGE電泳電泳變性變性堿變性堿變性甲醛或戊甲醛或戊二醛變性二醛變性高溫變性高溫變性轉(zhuǎn)移膜轉(zhuǎn)移膜NC膜或膜或尼龍膜尼龍膜NC膜或膜或尼龍膜尼龍膜NC膜或膜或PVDF膜膜紫外交聯(lián)紫外交聯(lián)儀等固定儀等固定需要需要 需要需要 不需要不需要雜交標(biāo)記物雜交標(biāo)記物標(biāo)記探針標(biāo)記探針 標(biāo)記探針標(biāo)記探針 抗體抗體三種印跡技術(shù)的比較三種印跡技術(shù)的比較2022年年7月月21日日11時時16分分572022年年7月月21日日11時時16分分58 3.3.思考題：思考題：1.1.用于核酸探針標(biāo)記的用于核酸探針標(biāo)記的有幾有幾種，種，切口平移標(biāo)記法、隨機引物標(biāo)記法和切口平移標(biāo)記法、隨機引物標(biāo)記法和末端標(biāo)記分別應(yīng)該用哪種？為什么？末端標(biāo)記分別應(yīng)該用哪種？為什么？2.2.