第十章免疫細(xì)胞的分離和功能檢測

第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 第十章第十章 免疫細(xì)胞的免疫細(xì)胞的分離和分離和功能檢測功能檢測 第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 目錄目錄 1外周血單個核細(xì)胞的分離和純化外周血單個核細(xì)胞的分離和純化2淋巴細(xì)胞及其亞群的分離淋巴細(xì)胞及其亞群的分離3吞噬細(xì)胞的分離和收集吞噬細(xì)胞的分離和收集返回總目錄返回總目錄第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 3免免疫細(xì)胞疫細(xì)胞的分離及檢測的分離及檢測檢測：檢測：各類免疫細(xì)胞及其亞群的數(shù)量和各類免疫細(xì)胞及其亞群的數(shù)量和功能測定功能測定方法方法：體體外法為外法為主主目的：目的：判斷機(jī)體免疫狀態(tài)判斷機(jī)體免疫狀態(tài)意義意義：探討疾病的發(fā)病機(jī)制、發(fā)展、預(yù)后探討疾病的發(fā)病機(jī)制、發(fā)展、預(yù)后、療效、療效免疫細(xì)胞的分離免疫細(xì)胞的分離 是指將各種參與免疫反應(yīng)的是指將各種參與免疫反應(yīng)的 細(xì)胞從血液或組織中分離出來細(xì)胞從血液或組織中分離出來 第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 免疫細(xì)胞種類第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 大大吞噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞:即單核即單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬細(xì)胞系統(tǒng) 小小吞噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞:即中性粒細(xì)胞即中性粒細(xì)胞第一節(jié)第一節(jié) 吞噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞的分離和收集的分離和收集吞噬細(xì)胞的種類吞噬細(xì)胞的種類第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 特征特征性標(biāo)志性標(biāo)志 CD14CD14分離技術(shù)分離技術(shù) PecollPecoll密度梯度分離法密度梯度分離法 流式細(xì)胞儀分離技術(shù)流式細(xì)胞儀分離技術(shù) 免疫磁珠分離法：為目前較常用的方法免疫磁珠分離法：為目前較常用的方法 黏附法黏附法一、吞噬細(xì)胞的分離一、吞噬細(xì)胞的分離（一）單核細(xì)胞的分離第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 免疫磁珠分離法免疫磁珠分離法 第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 斑蝥斑蝥敷貼法分離人巨噬細(xì)胞敷貼法分離人巨噬細(xì)胞 動物動物的巨噬細(xì)胞直接從腹腔滲出液中獲取的巨噬細(xì)胞直接從腹腔滲出液中獲取 （二）巨噬細(xì)胞的分離（二）巨噬細(xì)胞的分離第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 聚合物加速沉降法聚合物加速沉降法 可從外周血中分離出白細(xì)胞可從外周血中分離出白細(xì)胞RBC血漿血漿(抗凝血抗凝血)WBCRBC FicollFicoll分離法分離法 可從白細(xì)胞中分離出純化的中性粒細(xì)胞可從白細(xì)胞中分離出純化的中性粒細(xì)胞（三）中性粒細(xì)胞的分離（三）中性粒細(xì)胞的分離第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 Ficoll-Hypaque密度梯度離心分離中性粒細(xì)胞密度梯度離心分離中性粒細(xì)胞第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 吞噬細(xì)胞的吞噬活動大體分為吞噬細(xì)胞的吞噬活動大體分為趨化趨化、吞噬吞噬和和胞內(nèi)殺胞內(nèi)殺滅滅作用三個階段，據(jù)此建立相應(yīng)的檢測方法。作用三個階段，據(jù)此建立相應(yīng)的檢測方法。（一）中性粒細(xì)胞功能檢測技術(shù)（一）中性粒細(xì)胞功能檢測技術(shù) （二）巨噬細(xì)胞功能檢測技術(shù)（二）巨噬細(xì)胞功能檢測技術(shù)二、相關(guān)功能檢測二、相關(guān)功能檢測第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 細(xì)胞趨化功能的檢測細(xì)胞趨化功能的檢測吞噬功能的檢測吞噬功能的檢測殺菌功能的檢測殺菌功能的檢測（一）中性粒細(xì)胞功能檢測（一）中性粒細(xì)胞功能檢測第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 體內(nèi)試驗法：皮膚體內(nèi)試驗法：皮膚窗法窗法 體外試驗法：濾膜滲透法體外試驗法：濾膜滲透法 瓊脂糖平板法瓊脂糖平板法 趨化功能檢測趨化功能檢測檢測細(xì)胞運動功能檢測細(xì)胞運動功能皮膚窗法皮膚窗法 在在受檢者前臂屈側(cè)中央受檢者前臂屈側(cè)中央3 3范圍內(nèi)，搔刮范圍內(nèi)，搔刮皮膚后，用蓋玻片壓緊固定，在第皮膚后，用蓋玻片壓緊固定，在第2 2，5 5，8 8，1212，2424，3636小時各取樣一次，染色觀察中性粒細(xì)胞聚集小時各取樣一次，染色觀察中性粒細(xì)胞聚集開始時間、聚集程度等。健康正常人一般開始時間、聚集程度等。健康正常人一般2 23h3h后后開始聚集，達(dá)開始聚集，達(dá)5050100100個，個，6 6小時可達(dá)小時可達(dá)10001000個以上個以上。第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 原理及技術(shù)要點原理及技術(shù)要點 在一特制的分上下兩層的小盒，將趨化因子加在一特制的分上下兩層的小盒，將趨化因子加入下室，待檢細(xì)胞加入上室，兩室用微孔濾膜分入下室，待檢細(xì)胞加入上室，兩室用微孔濾膜分隔，隔，3737溫育數(shù)小時后，上室的中性粒細(xì)胞受下溫育數(shù)小時后，上室的中性粒細(xì)胞受下室趨化因子的吸引，由濾膜微孔進(jìn)入濾膜內(nèi)，取室趨化因子的吸引，由濾膜微孔進(jìn)入濾膜內(nèi)，取濾膜清洗、固定、干燥、染色和透明，在高倍鏡濾膜清洗、固定、干燥、染色和透明，在高倍鏡下觀察細(xì)胞穿越濾膜的移動距離，從而判斷其趨下觀察細(xì)胞穿越濾膜的移動距離，從而判斷其趨化功能?；δ?。濾膜滲透法濾膜滲透法第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 原理及技術(shù)要點原理及技術(shù)要點 在瓊脂糖凝膠平板的中孔加白細(xì)胞懸液，左孔加在瓊脂糖凝膠平板的中孔加白細(xì)胞懸液，左孔加趨化因子，右孔加對照液，溫育趨化因子，右孔加對照液，溫育48小時后，用顯小時后，用顯微鏡測微器測定中性粒細(xì)胞向左孔的移動距離微鏡測微器測定中性粒細(xì)胞向左孔的移動距離A和和向右孔的移動距離向右孔的移動距離B，計算趨化指數(shù)。，計算趨化指數(shù)。趨化指數(shù)趨化指數(shù)=A/B趨化指數(shù)越大，表明中性粒細(xì)胞運動功能越強(qiáng)趨化指數(shù)越大，表明中性粒細(xì)胞運動功能越強(qiáng) 瓊脂糖平板法瓊脂糖平板法第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 顯微鏡檢查法顯微鏡檢查法 100(%)計數(shù)的白細(xì)胞數(shù)吞噬細(xì)菌的白細(xì)胞數(shù)吞噬率吞噬指數(shù)=（一）中性粒細(xì)胞吞噬功能檢測（一）中性粒細(xì)胞吞噬功能檢測第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 NBTNBT還原試驗還原試驗 原理：原理：N-N-C +H+N=N-R-N-NH2C N=NH四氮唑基（淡黃色）四氮唑基（淡黃色）甲甲chan（紫黑色）（紫黑色）殺菌功能檢測殺菌功能檢測第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 方法：方法：1.1.抗抗凝血凝血 +硝基藍(lán)四氮唑（硝基藍(lán)四氮唑（NBTNBT），），3737孵孵育育25min25min。2.2.推推片染色、鏡檢。片染色、鏡檢。正常值：正常值：NBTNBT陽性細(xì)胞率應(yīng)陽性細(xì)胞率應(yīng)95%95%NBT還原試驗還原試驗第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 炭炭粒廓清試驗粒廓清試驗 正常小鼠肝中枯否細(xì)胞可吞噬清除正常小鼠肝中枯否細(xì)胞可吞噬清除9090炭粒，脾炭粒，脾巨噬細(xì)胞約吞噬清除巨噬細(xì)胞約吞噬清除1010炭粒。據(jù)此給小鼠靜脈炭粒。據(jù)此給小鼠靜脈注射定量印度墨汁（炭粒懸液），間隔一定時間注射定量印度墨汁（炭粒懸液），間隔一定時間反復(fù)取靜脈血，測定血中炭粒的濃度，根據(jù)血流反復(fù)取靜脈血，測定血中炭粒的濃度，根據(jù)血流中炭粒被廓清的速度，判斷巨噬細(xì)胞的功能。中炭粒被廓清的速度，判斷巨噬細(xì)胞的功能。（二）巨噬細(xì)胞功能檢測（二）巨噬細(xì)胞功能檢測第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 M+CRBCM+CRBC孵育孵育涂片、染色、鏡檢涂片、染色、鏡檢計算、吞噬率、吞噬指計算、吞噬率、吞噬指數(shù)數(shù)吞噬率（吞噬吞噬率（吞噬CRBCCRBC的的M 數(shù)數(shù)/計數(shù)的計數(shù)的M 數(shù)數(shù)）100100吞噬指數(shù)吞噬指數(shù) M吞噬的CRBCCRBC總數(shù)總數(shù)/計數(shù)的計數(shù)的M 數(shù)數(shù)吞噬功能檢測吞噬功能檢測返回章目錄返回章目錄第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 PBMCPBMC包括：淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞包括：淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞 各種血細(xì)胞比重不同各種血細(xì)胞比重不同,利用密度梯度離心進(jìn)行分離利用密度梯度離心進(jìn)行分離 常用分層液：常用分層液：ficollhypaque，percoll第二節(jié)第二節(jié) 外周血單個核細(xì)胞的分離和純化外周血單個核細(xì)胞的分離和純化第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 細(xì)胞細(xì)胞比重比重血小板血小板1.0301.035PBMC1.0751.090多核白細(xì)胞多核白細(xì)胞1.092紅細(xì)胞紅細(xì)胞1.093外周血各細(xì)胞成分的密度第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 Ficoll分離液法分離液法是一種單次差速密度梯度離心是一種單次差速密度梯度離心的分離法，主要用于分離外周血中的單個核細(xì)胞。的分離法，主要用于分離外周血中的單個核細(xì)胞。原原理：理：Ficoll分層液：密度分層液：密度1.0771.0770.0010.001 離心：密度梯度離心離心：密度梯度離心 分離：各類細(xì)胞按其相應(yīng)密度重新分布分離：各類細(xì)胞按其相應(yīng)密度重新分布一、一、Ficoll分離法分離法第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 Ficoll分層液分離單個核細(xì)胞示意圖第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 7898Percoll分離單個核細(xì)胞示意圖返回章目錄返回章目錄第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 紅細(xì)胞紅細(xì)胞的去除：低滲裂解法、氯化銨裂解法的去除：低滲裂解法、氯化銨裂解法 血小板血小板的去除的去除 ：胎牛血清：胎牛血清梯度離心法梯度離心法單核細(xì)胞單核細(xì)胞的去除的去除：黏附法：黏附法 羰基鐵吞噬法（磁鐵吸引法）羰基鐵吞噬法（磁鐵吸引法）苯丙氨酸苯丙氨酸甲酯去除法甲酯去除法 第三節(jié)第三節(jié) 淋巴細(xì)胞及其亞群的分離淋巴細(xì)胞及其亞群的分離一、淋巴細(xì)胞的純化一、淋巴細(xì)胞的純化第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 免疫磁珠分離法免疫磁珠分離法流式細(xì)胞術(shù)分離法流式細(xì)胞術(shù)分離法 其他方法其他方法二、淋巴細(xì)胞亞群的分離二、淋巴細(xì)胞亞群的分離第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 原理原理 將針對淋巴細(xì)胞特殊表面標(biāo)志的某種特異性將針對淋巴細(xì)胞特殊表面標(biāo)志的某種特異性單克隆抗體與磁珠結(jié)合形成單克隆抗體與磁珠結(jié)合形成免疫磁珠（免疫磁珠（IMBIMB），當(dāng)特異性單克隆抗體與表達(dá)相應(yīng)抗原的靶細(xì)胞結(jié)當(dāng)特異性單克隆抗體與表達(dá)相應(yīng)抗原的靶細(xì)胞結(jié)合，利用磁場可以將合，利用磁場可以將IMBIMB所結(jié)合細(xì)胞與其他細(xì)胞所結(jié)合細(xì)胞與其他細(xì)胞分離。包被磁珠的抗體可以是第一抗體或第二抗分離。包被磁珠的抗體可以是第一抗體或第二抗體。體。免疫磁珠分離法免疫磁珠分離法第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 免疫磁珠分離法免疫磁珠分離法第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 488 nm 激光激光+-前向散射光前向散射光檢測器檢測器 熒光檢測器熒光檢測器電磁場電磁場單個細(xì)胞被分類單個細(xì)胞被分類進(jìn)入檢測管進(jìn)入檢測管流流式式細(xì)細(xì)胞胞術(shù)術(shù)分分離離原原理理示示意意圖圖第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 E花環(huán)沉降法花環(huán)沉降法第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 T T細(xì)胞功能檢測細(xì)胞功能檢測 B B細(xì)胞功能檢測細(xì)胞功能檢測 NKNK細(xì)胞功能檢測細(xì)胞功能檢測三、相關(guān)功能檢測三、相關(guān)功能檢測第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 T T細(xì)胞增殖試驗細(xì)胞增殖試驗 T T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗 MHC-MHC-肽四聚體技術(shù)肽四聚體技術(shù) 淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測 T細(xì)胞功能檢測細(xì)胞功能檢測第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞DNADNA合成合成分化分化母細(xì)胞母細(xì)胞刺激物刺激物細(xì)胞細(xì)胞變大變大細(xì)胞漿擴(kuò)大細(xì)胞漿擴(kuò)大空泡空泡核仁明顯核仁明顯核染色質(zhì)疏松核染色質(zhì)疏松T淋巴細(xì)胞增殖試驗淋巴細(xì)胞增殖試驗第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 非特異性刺激物：非特異性刺激物：PHA -TPHA -T細(xì)胞細(xì)胞 ConA-TConA-T細(xì)胞細(xì)胞 PWM -TPWM -T、B B細(xì)胞細(xì)胞 LPS -BLPS -B細(xì)胞細(xì)胞特異性刺激物：特異性刺激物：異種抗原異種抗原 同種組織抗原同種組織抗原淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的刺激物淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的刺激物第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 形態(tài)學(xué)檢查法形態(tài)學(xué)檢查法 3H-TdR3H-TdR摻入法摻入法 MTTMTT比色法比色法 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的檢測方法淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的檢測方法第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 形態(tài)學(xué)檢查法形態(tài)學(xué)檢查法第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞淋巴母細(xì)胞淋巴母細(xì)胞 過渡型過渡型細(xì)胞大小細(xì)胞大小(直徑直徑m)m)12122020121216166 68 8核大小、染色質(zhì)核大小、染色質(zhì)增大、疏松增大、疏松增大、疏松增大、疏松不增大、密集不增大、密集核仁核仁清晰、清晰、1 14 4個個有或無有或無無無有絲分裂有絲分裂有或無有或無無無無無胞質(zhì)、著色胞質(zhì)、著色增多、嗜堿增多、嗜堿增多、嗜堿增多、嗜堿極少、天青色極少、天青色漿內(nèi)空泡漿內(nèi)空泡有或無有或無有或無有或無無無偽足偽足有或無有或無有或無有或無無無未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞的形態(tài)特征未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞的形態(tài)特征第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 原理：原理：刺激物刺激物3756hG1期期 S1期期 合成合成DNADNA 3H-TdR3716hDNA-3H-TdR測淋巴細(xì)胞內(nèi)放射量（測淋巴細(xì)胞內(nèi)放射量（cpmcpm）計算計算SISI判斷淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度判斷淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度外周血（外周血（T T）G G0 0期期3H-TdR摻入法摻入法第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 評價：該方法敏感性高、客觀性強(qiáng)、重復(fù)評價：該方法敏感性高、客觀性強(qiáng)、重復(fù)性好、可自動操作；設(shè)備昂貴、放射污染性好、可自動操作；設(shè)備昂貴、放射污染。刺激指數(shù)（刺激指數(shù)（stimulating indexstimulating index，SI SI）SI=SI=試驗管試驗管cpmcpm均值均值/對照管對照管cpmcpm均值均值3H-TdR摻入法摻入法第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 原理原理：外周血外周血T T細(xì)胞細(xì)胞 PHA發(fā)生增殖發(fā)生增殖 MTT含藍(lán)色甲顆粒含藍(lán)色甲顆粒 的的T T細(xì)胞細(xì)胞 MTT PHA 有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑測吸光度（測吸光度（A A）值）值 計算計算SISI判定細(xì)胞增殖結(jié)果判定細(xì)胞增殖結(jié)果SI=值對照孔值試驗孔AA(SI2(SI2具有意義具有意義)MTT比色法比色法第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 原理原理:靶細(xì)胞抗原靶細(xì)胞抗原T T細(xì)胞細(xì)胞觀察殺傷活力觀察殺傷活力致敏致敏CTLCTL靶細(xì)胞靶細(xì)胞（三）（三）T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 試驗方法試驗方法:同位素法同位素法 淋巴細(xì)胞（淋巴細(xì)胞（CTLCTL）+含含51Cr 51Cr 的腫瘤細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞 腫瘤細(xì)胞破壞腫瘤細(xì)胞破壞 51Cr 51Cr 釋放釋放 測定測定射線射線51Cr特異釋放率=均值對照孔均值最大釋放孔均值對照孔均值試驗孔cpmcpmcpmcpm100%（三）（三）T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 （三）（三）T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗背景無效應(yīng)細(xì)胞背景無效應(yīng)細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞靶細(xì)胞 1:1效應(yīng)細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞靶細(xì)胞 5:1效應(yīng)細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞靶細(xì)胞 20:1細(xì)胞溶解細(xì)胞溶解第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 MHC-肽四聚體技術(shù)肽四聚體技術(shù)原理原理 根據(jù)根據(jù)T細(xì)胞活化的雙識別原理，用生物工細(xì)胞活化的雙識別原理，用生物工程技術(shù)將程技術(shù)將MHC分子在體外組裝，并結(jié)合抗原表分子在體外組裝，并結(jié)合抗原表位肽，形成抗原肽位肽，形成抗原肽-MHC分子復(fù)合物，結(jié)合流式分子復(fù)合物，結(jié)合流式細(xì)胞儀定量檢測抗原特異性細(xì)胞儀定量檢測抗原特異性T細(xì)胞。細(xì)胞。T第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 技術(shù)要點技術(shù)要點:1.1.在體外將特異性抗原肽段、可溶性在體外將特異性抗原肽段、可溶性MHCIMHCI類分子類分子重鏈及重鏈及2 2微球蛋白正確折疊，形成微球蛋白正確折疊，形成MHC-MHC-抗原肽抗原肽復(fù)合物，并純化該復(fù)合物。復(fù)合物，并純化該復(fù)合物。2.2.用生物素標(biāo)記用生物素標(biāo)記MHC-MHC-抗原肽復(fù)合物?？乖膹?fù)合物。3.3.生物素標(biāo)記的生物素標(biāo)記的MHC-MHC-抗原肽復(fù)合物與熒光標(biāo)記的抗原肽復(fù)合物與熒光標(biāo)記的親和素以親和素以4:14:1的比例相混合，即得到熒光標(biāo)記的的比例相混合，即得到熒光標(biāo)記的四聚體四聚體 MHC-肽四聚體技術(shù)肽四聚體技術(shù)第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 MHC-MHC-肽四聚體技術(shù)肽四聚體技術(shù)第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 原理原理:用用刺激劑體外激活淋巴細(xì)胞，用蛋白轉(zhuǎn)運抑刺激劑體外激活淋巴細(xì)胞，用蛋白轉(zhuǎn)運抑制如莫能霉素阻止細(xì)胞因子分泌到細(xì)胞外，細(xì)胞制如莫能霉素阻止細(xì)胞因子分泌到細(xì)胞外，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運方式被打亂，引起細(xì)胞因子向高爾內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運方式被打亂，引起細(xì)胞因子向高爾基體積聚，用流式細(xì)胞儀便可測出淋巴細(xì)胞內(nèi)的基體積聚，用流式細(xì)胞儀便可測出淋巴細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子種類，從而確定細(xì)胞因子種類，從而確定TH1/TH2TH1/TH2細(xì)胞的百分率。細(xì)胞的百分率。淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 分泌的細(xì)胞因子分泌的細(xì)胞因子 Thl Th2Thl Th2 IL-2 +-IFN-+-TNF-+IL-3 +GM-CSF +TNF-+IL-4 -+IL-5 -+IL-6 -+IL-10 -+Thl和和Th2分泌的細(xì)胞因子分泌的細(xì)胞因子第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 特異性抗原皮膚試驗特異性抗原皮膚試驗PHAPHA皮膚試驗皮膚試驗體內(nèi)試驗體內(nèi)試驗第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 溶血空斑試驗溶血空斑試驗酶聯(lián)免疫斑點試驗酶聯(lián)免疫斑點試驗體內(nèi)試驗體內(nèi)試驗B細(xì)胞功能檢測細(xì)胞功能檢測第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 溶血空斑試驗溶血空斑試驗溶血斑溶血斑補體抗血清包被抗血清包被綿羊紅細(xì)胞綿羊紅細(xì)胞第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 酶聯(lián)免疫斑點法酶聯(lián)免疫斑點法抗體產(chǎn)生抗體產(chǎn)生B細(xì)胞細(xì)胞抗原抗原包被包被酶聯(lián)抗酶聯(lián)抗抗體抗體凝膠底物凝膠底物顯色顯色第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 刺激體內(nèi)刺激體內(nèi)抗體產(chǎn)生的特異性抗原有抗體產(chǎn)生的特異性抗原有白喉類毒素白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素破傷風(fēng)類毒素、多價肺炎多價肺炎鏈球菌鏈球菌等等。將適量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前將適量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后及免疫后1 1周、周、2 2周、周、3 3周分別采血，分離血清，周分別采血，分離血清，測定受檢者免疫前后相應(yīng)抗體的效價，判斷受測定受檢者免疫前后相應(yīng)抗體的效價，判斷受檢者體內(nèi)檢者體內(nèi)B B細(xì)胞的細(xì)胞的功能。功能。體內(nèi)試驗體內(nèi)試驗第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 染色計數(shù)染色計數(shù)離心取上清離心取上清測測LDHLDH或或AKPAKP測發(fā)光強(qiáng)度測發(fā)光強(qiáng)度測測CPMCPM值值形態(tài)法形態(tài)法酶釋法酶釋法放射性核素釋放射性核素釋放法放法流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)靶靶細(xì)細(xì)胞胞溶溶解解常用靶細(xì)胞常用靶細(xì)胞:K562:K562細(xì)胞株細(xì)胞株NK細(xì)胞活性檢測細(xì)胞活性檢測返回章目錄返回章目錄第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測的分離和功能檢測 THANK YOU FOR YOUR ATTENTION!返回總目錄返回總目錄