核酸化學-(理化性質(zhì)).ppt

第八章 核酸化學,第一節(jié).核酸概述 第二節(jié).核酸的結(jié)構(gòu) 第三節(jié).核酸的物理化學性質(zhì) 第四節(jié).核酸的研究方法,核 酸 的 理 化 性 質(zhì),第 三 節(jié),目 錄,P503,一、核酸的一般性質(zhì)(了解),核酸和核苷酸既有磷酸基，又有堿性基團，所以是兩性電解質(zhì)，由于磷酸酸性較強常表現(xiàn)酸性。 晶形-DNA為白色纖維狀固體，RNA為白色粉末。 粘度大多數(shù)DNA為線性分子，分子極不對稱，長度可達幾厘米，而直徑只有幾納米，所以即使是極稀的DNA溶液，也有極大的粘度，RNA溶液的粘度要小得多。 溶解性：微溶于水(溶液呈酸性)， 不溶于一般有機溶劑，在70%乙醇中形成沉淀=用70-95%乙醇提純核酸。核苷酸無色、溶于水。 RNA易溶于低鹽(0.14MNaCl)，DNA易溶于高鹽濃度(1M NaCl)。 室溫下，稀堿能水解RNA，而DNA穩(wěn)定。稀酸可水解DNA，而濃酸可水解RNA。 旋光性- 均很強,二、核酸的水解(P503,掌握),核酸堿基與戊糖形成的N-糖苷鍵。磷酸基與兩種糖分別形成核糖磷酸酯和脫氧核糖磷酸酯。這些糖苷鍵和磷酸酯鍵都能被酸或堿和酶水解。,糖苷鍵和磷酸酯鍵都能發(fā)生酸水解，但糖苷鍵比磷酸酯鍵更易被酸水解。 嘌呤堿的糖苷鍵比嘧啶堿的糖苷鍵對酸更不穩(wěn)定。對酸最不穩(wěn)定的是嘌呤與脫氧核糖之間的糖苷鍵。 DNA在pH1.6于37對水透析即可完全除去嘌呤堿。在pH2.8于100加熱1h，也可完全除去嘌呤堿。 水解嘧啶堿需要較高的溫度。用甲酸（98-100）密封加熱至1752h，無論RNA還是DNA都可以完全水解，產(chǎn)生嘌呤和嘧啶堿，缺點是尿嘧啶的回收率較低。改用三氟乙酸在155加熱60min（水解DNA）或80min（水解RNA），嘧啶堿的回收率顯著提高。,1酸水解,RNA的磷酸酯鍵易被堿水解，產(chǎn)生核苷酸；用于水解RNA的堿有NaOH和KOH，以KON較好，堿濃度一般為0.3-1mol/L，在室溫至37下水解1824h即可水解完全。 DNA的磷酸酯鍵則不易被堿水解。DNA一般對堿穩(wěn)定，在1mol/LNaOH中加熱至1004h，可以得到小分子的寡聚脫氧核苷酸。,2堿水解,總結(jié)酸或堿的水解,核酸分子中的磷酸二酯鍵可在酸或堿性條件下水解切斷。 DNA和RNA對酸或堿的耐受程度有很大差別。 例如，在0.1 mol/L NaOH溶液中，RNA幾乎可以完全水解，生成2-或3-磷酸核苷；DNA在同樣條件下則不受影響。這種水解性能上的差別？與RNA核糖基上2-OH的鄰基參與作用有很大的關(guān)系。在RNA水解時，2-OH首先進攻磷酸基，在斷開磷酯鍵的同時形成環(huán)狀磷酸二酯，再在堿的作用形成水解產(chǎn)物。,水解核酸的酶類很多。 非特異性水解磷酸二酯鍵的酶稱為磷酸二酯酶，如蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶。 專一水解核酸的磷酸二酯酶稱為核酸酶。,3.酶水解,按底物專一性分類 兩類：以DNA為底物的DNA水解酶（DNases）和以RNA為底物的RNA水解酶（RNases）。 根據(jù)作用方式分 兩類：核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶。作用位點在多核苷酸鏈內(nèi)部的為核酸內(nèi)切酶。從多核苷酸鏈的末端開始，逐個的將核苷酸切下，從而使核酸進行降解的酶稱為外切酶。 按磷酸二酯鍵斷裂的方式分 兩類：一種是在3-OH 與磷酸基之間斷裂，其產(chǎn)物是5-核苷酸或寡聚核苷酸。另一種是在5-OH與磷酸基之間斷裂，其產(chǎn)物是3-核苷酸或寡聚核苷酸。 其它分類標準還有 對底物二級結(jié)構(gòu)的專一性，作用于雙鏈核酸的叫雙鏈酶，作用于單鏈的叫單鏈酶。核酸外切酶作用的方向性，35或53。對磷酸二酯鍵兩側(cè)的堿基有無選擇性等。,（1）核酸酶的分類,牛胰核糖核酸酶（RNaseI） 只作用于RNA，不作用于DNA。且具有極高專一性的酶，其作用位點是嘧啶核苷-3-磷酸與其他核苷酸之間的鍵（5-磷酸酯鍵）。產(chǎn)生3-嘧啶核苷酸或以3-嘧啶核苷酸結(jié)尾的寡核苷酸。(P503) 核糖核酸酶T1 具有比RnaseI更高的專一性。他作用的位點是3-鳥苷酸與其相鄰核苷酸的5-OH之間的連鍵。產(chǎn)生3-鳥苷酸或以3-鳥苷酸結(jié)尾的寡核苷酸。 核糖核酸酶T2 主要作用點為Ap殘基，可以將tRNA完全降解成3-腺苷酸結(jié)尾的寡核苷酸。,（2）核糖核酸酶類（RNase）,牛胰脫氧核糖核酸酶（DNase I） 切斷雙鏈DNA或單鏈DNA成為以5-磷酸為末端的寡核苷酸，平均長度為4核苷酸。 牛脾脫氧核糖核酸酶（Dnase II） 降解DNA成為3-磷酸為末端的寡核苷酸，平均長度為6核苷酸。 鏈球菌脫氧核糖核酸酶 核酸內(nèi)切酶，作用于DNA，產(chǎn)物為5-磷酸為末端長度不同的碎片。 限制性內(nèi)切酶 在細菌中發(fā)現(xiàn)，主要降解外源DNA。具有嚴格的堿基序列專一性。它能專一識別并切割DNA上特定堿基序列，產(chǎn)物仍為雙鏈DNA片段。限制內(nèi)切酶的識別和切割位點通常是4-6bp組成的回文結(jié)構(gòu)。切開后的產(chǎn)物具有粘性末端。限制性內(nèi)切酶在基因工程中得到廣泛應用。 （4）N-糖苷酶水解糖苷鍵。,（3）脫氧核糖核酸酶（DNase）,注：生物體內(nèi)存在多種核酸水解酶。這些酶可以催化水解多聚核苷酸鏈中的磷酸二酯鍵。 以DNA為底物的DNA水解酶（DNases）和以RNA為底物的RNA水解酶（RNases）。 根據(jù)作用方式又分作兩類：核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶。 核酸外切酶的作用方式是從多聚核苷酸鏈的一端（3-端或5-端）開始，逐個水解切除核苷酸；核酸內(nèi)切酶的作用方式剛好和外切酶相反，它從多聚核苷酸鏈中間開始，在某個位點切斷磷酸二酯鍵。 在分子生物學研究中最有應用價值的是限制性核酸內(nèi)切酶。這種酶可以特異性的水解核酸中某些特定堿基順序部位。,核酸的兩性性質(zhì)及等電點 與蛋白質(zhì)相似，核酸分子中既含有酸性基團（磷酸基）也含有堿性基團（氨基），因而核酸也具有兩性性質(zhì)。 由于核酸分子中的磷酸是一個中等強度的酸，而堿性（氨基）是一個弱堿，所以核酸的等電點比較低。如DNA的等電點為44.5； RNA的等電點為22.5。RNA的等電點比DNA低的原因，是RNA分子中核糖基2-OH通過氫鍵促進了磷酸基上質(zhì)子的解離。DNA沒有這種作用。,三、核酸的酸堿性質(zhì)(P504,了解),堿基的堿性,嘌呤堿基和嘧啶堿基都具有弱堿性。 環(huán)內(nèi)氨基的pKa值約為9.5。 堿基環(huán)外的氨基（存在于A、G和C）的堿性很弱，在生理pH條件下不能被質(zhì)子化。這種情況與苯胺分子中的氨基相似。 因此嘌呤和嘧啶堿基的堿性主要是環(huán)內(nèi)氨基的貢獻。,四.核酸的紫外吸收(P507，了解),在核酸分子中，由于嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵體系，使DNA和RNA在240290nm處有強烈紫外吸收，最大吸收峰在260nm左右，可以作為核酸及其組份定性和定量測定的依據(jù)。 以A260/A280進行定性、定量 DNA和RNA溶液中加入溴化乙錠（EB），在紫外下發(fā)出熒光,1.用A260/A280判斷核酸樣品的純度： 由于核酸的紫外吸收最大吸收值在260nm處。蛋白質(zhì)最大吸收值在280nm處。利用這一特性，可以鑒別核酸樣品中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)，還可以對核酸進行定量測定。 用OD260/OD280比值來判斷樣品純度。一般純DNA比值 1.8，純RNA比值應達到2.0，若含雜蛋白及苯酚，比值會明顯下降。 2. 對于純的DNA或RNA樣品，可用該法作定量測定 50g/ml雙鏈DNA 通常當A260=1.0相當于：40g/ml單鏈DNA（或RNA） 20g/ml寡核苷酸 優(yōu)點：快速、準確、所需樣品量少,OD260的應用,目 錄,五核酸的變性、復性與雜交,問：核酸變性與核酸降解的區(qū)別？ 核酸的變性只涉及雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，并不涉及磷酸二酯鍵的斷裂，所以它的一級結(jié)構(gòu)(堿基順序)保持不變。 問：核酸變性后物化性質(zhì)也會發(fā)生哪些變化呢？ 答案：粘度下降；紫外吸收值A(chǔ)急劇增加；浮力密度升高；酸堿滴定曲線改變；生物活性喪失等。,(1) 核酸的變性(P508,掌握) 1.定義：指高溫、酸堿以及某些變性劑能破壞核酸中的氫鍵，使有規(guī)律的雙螺旋型結(jié)構(gòu)變成單鏈的、無規(guī)律的“線團”，這種作用就稱為核酸的變性。,DNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂,2.引起核酸變性的因素： 很多 由溫度升高引起的變性稱為熱變性； 由酸堿度改變引起的變性稱酸堿變性； 變性試劑如尿素、甲醛、胍類、酰胺以及某些有機溶劑如乙醇、丙酮等均可引起核酸的變性。,DNA的熔點,其中DNA的熱變性一般在較窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)生，很像固體結(jié)晶物質(zhì)在其熔點突然熔化的情況。因此通常把加熱變性使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時的溫度稱為熔點或溶解溫度，用Tm表示。 一般DNA的Tm值在82-95C之間。,DNA變性是個突變過程，類似結(jié)晶的熔解。的溫度稱熔解溫度。通常將紫外吸收的增加量達到最大增量一半（即加熱變性使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半）時的溫度稱為該DNA的熔點或熔解溫度(melting temperature, Tm)。,Tm,Tm,熱變性,解鏈曲線：如果在連續(xù)加熱DNA的過程中以溫度對A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm處的吸光率）值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。,目 錄,Tm：變性是在一個相當窄的溫度范圍內(nèi)完成，在這一范圍內(nèi)，紫外光吸收值達到最大值的50%時的溫度稱為DNA的解鏈溫度，又稱融解溫度(melting temperature, Tm)。其大小與G+C含量成正比。,目 錄,DNA的均一性 均一性越高，DNA的解鏈溫度越窄。均質(zhì)DNA熔解過程發(fā)生在一個較小的溫度范圍內(nèi)；異質(zhì)DNA的熔解過程發(fā)生在一個較寬的溫度范圍內(nèi)。Tm值可作為衡量DNA樣品均一性的標準。 G-C的相對含量 越多，Tm值越高。G和C的含量高，Tm值高。因而測定Tm值，可反映DNA分子中G, C含量，可通過經(jīng)驗公式推算Tm值或G-C含量： （G+C)%=（Tm-69.3）2.44,問：DNA的Tm值與哪些因素有關(guān)呢？,介質(zhì)中的離子強度 離子強度較低，DNA溶解溫度較低，且溶解溫度范圍較寬。離子強度較高，DNA溶解溫度較高，且溶解溫度范圍較窄。故DNA不應保存在極烯的溶液中。 pH值的影響 高pH下堿基廣泛去質(zhì)子而喪失形成氫鍵的能力。 變性劑的影響 如甲酰胺、尿素、甲醛等破壞氫鍵，妨礙堿基堆積，使Tm下降。,由于RNA本身只有局部的雙螺旋區(qū)，所以變性行為所引起的性質(zhì)變化沒有DNA那樣明顯。 具體：變性曲線不那么陡，Tm值也較低。 利用紫外吸收的變化，可以檢測核酸變性的情況。 例如，天然狀態(tài)的DNA在完全變性后，紫外吸收(260 nm)值增加2540%. 而RNA變性后，約增加1.1%。這種現(xiàn)象稱為增色效應.,3.RNA的變性,變性后的核酸在260nm處的紫外吸收明顯升高，稱增色效應。核酸復性后，光吸收值又回復到原有水平（減色效應）。 這是檢測核酸變性的一個最簡便的方法。 思考：增色效應的原因？ 當核苷酸摩爾數(shù)相同時，A260值大小如下關(guān)系：單核苷酸單鏈DNA雙鏈DNA,4. 增色效應的原因(P508),DNA復性的定義 在適當條件下，變性DNA的兩條互補鏈可恢復天然的雙螺旋構(gòu)象，這一現(xiàn)象稱為復性。,減色效應： DNA復性時，其溶液OD260降低。,熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復性，這一過程稱為退火(annealing) 。退火溫度Tm25,目 錄,(2) 核酸的復性(P508,掌握),DNA復性的程度、速率與復性過程的條件有關(guān)。 將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時，DNA不可能復性。但是將變性的DNA緩慢冷卻時，可以復性。 復性影響因素：分子量越大復性越難。濃度越大，復性越容易。此外，DNA的復性也與它本身的組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)。,影響復性速度的因素： （1）溶液溫度的高低 （Tm 25） （2）單鏈片段的大小 （3）單鏈片段濃度 （4）片段內(nèi)重復序列的多少 （5）溶液離子強度的大小,附：DNA的復性一般只適用于均一的病毒和細菌的DNA，至于哺乳動物細胞中的非均一DNA，很難恢復到原來的結(jié)構(gòu)狀態(tài)。這是因為各片斷之間只要有一定數(shù)量的堿基彼此互補，就可以重新組合成雙螺旋結(jié)構(gòu)，堿基不互補的區(qū)域則形成突環(huán)。 復性速度的因素影響：順序簡單的DNA分子比復雜的分子復性要快； DNA濃度越高，越易復性；此外， DNA片斷大小、溶液的離子強度等對復性速度都有影響。 復性后DNA的表現(xiàn)：物理化學性質(zhì)能得到恢復，如紫外光吸收值下降，粘度增高，比旋增加，生物活性也得到部分恢復。,DNA復性,A.概念:在DNA變性后的復性過程中，如果將不同種類的DNA單鏈分子或RNA分子放在同一溶液中，只要兩種單鏈分子之間存在著一定程度的堿基配對關(guān)系，在適宜的條件（溫度及離子強度）下，就可以在不同的分子間形成雜化雙鏈(heteroduplex) 這種雜化雙鏈可以在不同的DNA與DNA之間形成，也可以在DNA和RNA分子間或RNA與RNA分子間形成。這種現(xiàn)象稱為核酸分子雜交,1.核酸分子雜交的概念和原理(了解),(3) 核酸的分子雜交(hybridization),簡單來說：在退火條件下，不同來源的DNA互補區(qū)形成氫鍵，或DNA單鏈和RNA鏈的互補區(qū)形成DNA-RNA雜合雙鏈的過程。 可形成DNADNA雙鏈分子； DNARNA雙鏈分子； RNARNA雙鏈分子。,B.原理:是只要兩種單鏈分子之間存在著一定程度的同源性，在適宜的條件（溫度及離子強度）下，就可以按照堿基互補配對原則，在不同的分子間退火形成雜化雙鏈。,DNA-DNA 雜交雙鏈分子,不同來源的DNA分子,核酸的雜交,探針：如果雜交的一條鏈是人工特定（已知核苷酸順序）的DNA或RNA的序列，并經(jīng)放射性同位素或其它方法標記，稱為探針（probe)。,探針：用放射性同位素標記的DNA或RNA片段。,利用雜交方法，使“探針”與特定未知的序列發(fā)生“退火”形成雜合體，即可達到尋找和鑒定特定序列的目的。用“探針”來尋找某些DNA或RNA片斷，已成為目前基因克隆、鑒定分析中十分重要的手段。 核酸的雜交在分子生物學和遺傳學的研究中具有重要意義。,雜交可以在液相或固相上進行。 固相雜交 Southern 雜交（Southern bolting） Northern 雜交（Northern bolting） Western 雜交 （Western bolting）,原位雜交技術(shù)：直接用探針與菌落或組織細胞中的核酸雜交，未改變核酸所在的位置。,Southern印跡法：將電泳分離后的DNA片段從凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，再進行雜交。,Northern印跡法：將電泳分離后的RNA（變性后）吸印到纖維素膜上再進行分子雜交。,核酸分子雜交的應用 研究DNA分子中某一種基因的位置 定兩種核酸分子間的序列相似性 檢測某些專一序列在待檢樣品中存在與否 是基因芯片技術(shù)的基礎(chǔ),