食品酶學(xué)-酯酶和過氧化物酶.ppt

第八章 酯酶,醇: 一元醇或多元醇、脂肪醇或芳香族醇； 酸 : 有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸； 底物特異性 : 對(duì)酯的酸或醇部分是特異的. 分類: 羧酸酯水解酶 硫酯水解酶根據(jù)底物中醇的部分命名 磷酸二酯水解酶 硫酸酯水解酶,最重要的是羧酸酯水解酶和磷酸酯水解酶,硫酯水解酶,第一節(jié) 羧酸酯水解酶,酯 酶,羧酸酯,羧酸,醇,一、非特異性羧酸酯水解酶 （一）酯酶 三類能被區(qū)分的非特異性羧酸酯酶（羧酸酯水解酶、芳香酯水解酶和乙酸酯水解酶）。 它們的分類是以底物特異性為基礎(chǔ)的，然而其性質(zhì)的差別超過了底物的特異性,（二）脂酶,上述反應(yīng)不是一個(gè)完全的反應(yīng)， 因?yàn)橹复呋姆磻?yīng)可以進(jìn)行到 甘油一酯甚至甘油階段。,人類胰臟脂酶的三維結(jié)構(gòu)飄帶圖,脂肪酶和酯酶的區(qū)別是什么？,酯酶，催化酯水解的酶。脂肪酶催化脂肪水解為甘油和脂肪酸的酶(即三酰基甘油?；饷?，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯)。 作用底物的碳鏈長(zhǎng)短不同(酯酶優(yōu)先水解短鏈脂肪酸，脂肪酶優(yōu)先水解長(zhǎng)鏈脂肪酸) 作用底物的物理狀態(tài)不同(酯酶水解水溶性底物，脂肪酶水解油水界面的底物),二特異性羧酸酯水解酶 （一）磷脂酶 催化水解磷脂酰、溶血磷脂?；衔镏械聂人狨ユI、磷酸酯鍵和磷酸與膽堿之間的酯鍵。,磷脂酶B,磷酸二酯酶,磷脂酶A,（二）葉綠素酶 從葉綠素分子上除去植基 葉綠素酶的作用可能影響蔬菜加工中綠色的穩(wěn)定性,（三） 果膠酯酶 （四）乙酰膽堿酯酶,(CH3)3N+CH2CH2OH +CH3COO + H,第二節(jié) 磷酸酯水解酶 磷酸酯水解酶催化水解由磷酸作為酸的部分酯的酯鍵 磷酸一酯磷酸一酯水解酶 磷酸二酯磷酸二酯水解酶 一、磷酸一酯水解酶 非特異性磷酸一酯水解酶：對(duì)構(gòu)成酯的一磷酸基有要求，對(duì)構(gòu)成酯的醇的部分沒有嚴(yán)格要求 特異性磷酸一酯水解酶：對(duì)一磷酸基和醇兩部分都有要求,二、磷酸二酯水解酶 磷酸二酯水解酶催化原磷酸形成的兩個(gè)酯鍵中的一個(gè)水解,磷酸酯酶和磷酸化酶有什么區(qū)別？,磷酸化酶（phosphorylase）：是一種催化磷酸解的酶。比如說(shuō)，A和B基團(tuán)通過酯鍵相連，磷酸化酶則催化酯鍵水解，并使一個(gè)基團(tuán)帶上磷酸基團(tuán)。 A-O-BPi AOH BPi 最有代表性的磷酸化酶是糖原磷酸化酶，糖原在體內(nèi)降解過程中，該酶是催化糖原還原性末端葡萄糖殘基的-1,4-糖苷鍵斷裂，反應(yīng)，生成1-磷酸葡萄糖和少了一個(gè)葡萄糖基的糖原分子。 磷酸酯酶（phosphatase）：屬于一種水解酶類，它是通過催化磷酸酯鍵水解的酶。,第三節(jié) 脂酶的性質(zhì),一、脂酶作用的底物的物理狀態(tài),豬胰脂酶首先被純化和鑒定，因此，脂酶的許多性質(zhì)的闡明都和豬胰脂酶有關(guān)。 脂酶的天然底物（長(zhǎng)鏈甘油三酯）是不溶于水的。 脂酶不能作用于分散在水中的底物分子，而能作用于乳化的脂肪球，脂肪和水之間的界面是酶作用的部位。,酶-底物絡(luò)合物 在均相反應(yīng)體系 在脂肪反應(yīng)體系 酶分子吸附底物 脂酶吸附在底物界面上 飽和狀態(tài) 酶分子被底物分子飽和 界面面積足以容納的所有酶分子 Michaelis常數(shù) 反應(yīng)速度達(dá)到最高速度 反應(yīng)速度達(dá)到最高速度 一半時(shí)的底物濃度 一半時(shí)的界面面積,胰脂酶作用于不溶解的甘油三酯時(shí)，酶活力和乳化液界面面積的關(guān)系 B-甘油三丁酯 O-甘油三油酸酯,當(dāng)脂酶作用于可溶性酯時(shí)，當(dāng)溶液濃度沒有達(dá)到被底物飽和的程度之前，電泳純脂酶不能作用于溶解的丁酸甲酯，它對(duì)于溶解的甘油乙酸酯的作用也是可以忽略的。 酯酶和脂酶的差別主要表現(xiàn)在它們所作用的底物具有不同的狀態(tài)這一點(diǎn)上。脂酶能水解不溶解或多相體系中處在油水界面的酯。,當(dāng)酶分子中用大圓圈表示的部分和底物相接觸時(shí)，這個(gè)催化部位被誘導(dǎo)而構(gòu)象改變(從三角改變到方塊)，使酶具有活力。,二、底物特異性,豬胰脂酶作用于甘油酯時(shí)相對(duì)速度: 甘油三酯甘油二酯甘油一酯,豬胰脂酶水解甘油三酯的進(jìn)程 a-甘油三酯 b-甘油二酯 c-甘油一酯 d-甘油,豬胰脂酶作用于甘油三酯時(shí)的特異性表現(xiàn)為它選擇1位和3位的酯鍵作為作用點(diǎn)。 豬胰脂酶對(duì)于酯的醇部分并沒有絕對(duì)的特異性要求。 由于脂酶作用于處在油-水界面的酯分子，因此，任何能增加底物-水界面的條件都能提高脂酶的活力。,三、pH、溫度、激活劑和抑制劑對(duì)脂酶作用的影響,大多數(shù)脂酶的最適pH在堿性范圍內(nèi)，即pH89 膽酸鹽類等是有乳化作用的鹽能提高脂的活力，重金屬鹽類確切無(wú)疑地抑制脂酶的活力。NaCl對(duì)于豬胰脂酶的活力是必需的，但是當(dāng)NaCl濃度超過7mmol/L時(shí)，酶的活力開始下降。鈣離子的作用比較復(fù)雜，對(duì)于豬胰脂酶，當(dāng)有膽酸鹽存在時(shí)，鈣離子是絕對(duì)必需的；然而，對(duì)于牛胰脂酶的作用，鈣離子并非是必需的。,四、微生物脂酶,根據(jù)位置特異性可將微生物脂酶分為兩類。 第一類是非特異性微生物脂酶，它們能從甘油三酯的所有三個(gè)位置將酯水解，釋出游離脂肪酸。,1,2（2,3）-甘油二酯，1,3-甘油二酯和甘油一酯是水解過程中的中間物。,第二類微生物脂酶僅從甘油三酯的1位和3位將它水解，釋出游離脂肪酸。,由于1,2（2,3）-甘油二酯，特別是2-甘油一酯是不穩(wěn)定的，它們分子中的?；苻D(zhuǎn)位而分別生成1,3-甘油二酯和1-甘油一酯，因此，1,3-特異性脂酶長(zhǎng)時(shí)間地作用于脂肪時(shí)，脂肪中的甘油三酸酯將被完全水解而產(chǎn)生甘油。 微生物脂酶中，大多數(shù)是屬于1,3-特異性脂酶。到目前為止還沒有發(fā)現(xiàn)2-特異性脂酶。 大多數(shù)微生物脂酶以常見的中性油和脂肪為底物時(shí)，表現(xiàn)出很低的脂肪酸特異性。,五、脂酶活力的測(cè)定,不溶解的甘油三酯的乳狀液是被優(yōu)先考慮的。 甘油三油酸酯是最佳底物，純的甘油三油酸酯十分昂貴，可以采用橄欖油取代，因?yàn)樗鼈兒械挠退釟埢伎傊舅釟埢?0。,脂酶水解甘油三酯的速度可通過下列方法測(cè)定：, 在反應(yīng)體系中加入溶劑以終止反應(yīng)，然后滴定在反應(yīng)中釋出的脂肪酸； 采用pH-stat法，在pH8連續(xù)地測(cè)定整個(gè)反應(yīng)過程中游離脂肪酸含量隨時(shí)間而增加的速度； 加入NaHCO3與反應(yīng)中釋出的H+作用釋出的CO2，用量壓法測(cè)定； 測(cè)定因脂肪酸的產(chǎn)生而導(dǎo)致的反應(yīng)體系表面張力的下降； 采用生色底物，例如乙酸-萘酯。,第四節(jié) 脂酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用, 脂酶作用于食品材料中的脂類底物，從而影響食品的風(fēng)味； 催化油脂水解和油脂間的酯交換以得到新的產(chǎn)品； 一、脂酶的作用對(duì)食品風(fēng)味的影響,思考題,脂肪酶的催化反應(yīng)特性是什么？ 脂肪酶的定義 脂肪酶作用的底物的物理狀態(tài) 脂肪酶作用的底物的特異性,脂肪酶是一類具有多種催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯類的水解、醇解、酯化、轉(zhuǎn)酯化及酯類的逆向合成反應(yīng)，除此之外還表現(xiàn)出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、膽固醇酯酶、酰肽水解酶活性等。脂肪酶不同活性的發(fā)揮依賴于反應(yīng)體系的特點(diǎn)，如在油水界面促進(jìn)酯水解，而在有機(jī)相中可以酶促合成和酯交換。 脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大。溶于水的酶作用于不溶于水的底物，反應(yīng)是在2個(gè)彼此分離的完全不同的相的界面上進(jìn)行。這是脂肪酶區(qū)別于酯酶的一個(gè)特征。酯酶(E C3.1.1.1)作用的底物是水溶性的，并且其最適底物是由短鏈脂肪酸(C8)形成的酯。,第九章 過氧化物酶,過氧化物酶(利用過氧化氫作為電子受體來(lái)催化底物氧化作用的酶。) H2O2 + AH2 2 H2O + A 過氧化氫酶 2 H2O2 2 H2O + O2,雖然過氧化物酶和過氧化氫酶在作用機(jī)制上有一些共同點(diǎn)，但是它們?cè)诿傅鞍捉Y(jié)構(gòu)上有顯著的差別。,過氧化物酶,含鐵過氧化物酶,正鐵血紅素過氧化物酶 含正鐵血紅素（羥高鐵血紅素）,綠過氧化物酶 含鐵原子卟啉基團(tuán), 但其結(jié)構(gòu)不同于正鐵血紅素,黃蛋白過氧化物酶 黃素腺嘌呤二核苷酸作為輔基,第一節(jié) 過氧化物酶在自然界的分布,在植物細(xì)胞中以二種形式存在： (1) 以可溶形式存在于細(xì)胞漿 (2) 以結(jié)合形式與細(xì)胞中細(xì)胞壁或細(xì)胞器相結(jié)合 結(jié)合態(tài)酶可分成兩種形式：離子結(jié)合和共價(jià)結(jié)合,第二節(jié) 過氧化物酶在食品加工中的作用,過氧化物酶是果蔬成熟和衰老的指標(biāo) 蘋果氣調(diào)保藏，過氧化物酶兩個(gè)峰值相應(yīng)于呼吸轉(zhuǎn)折和衰老開始。 過氧化物酶活力可能與果蔬成熟時(shí)葉綠素降解有關(guān)。(過氧化物酶可催化相應(yīng)的底物氧化，其間產(chǎn)生的物質(zhì)會(huì)引起葉綠素的氧化分解 ) 過氧化物酶與胡蘿卜素褪色有關(guān)。,果實(shí)后熟衰老是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過程，自由基衰老學(xué)說(shuō)認(rèn)為：衰老與活性氧代謝平衡密切相關(guān)，這個(gè)平衡即活性氧物質(zhì)產(chǎn)生與清除的動(dòng)態(tài)平衡?；钚匝鯇?dǎo)致的膜脂過氧化對(duì)細(xì)胞膜具嚴(yán)重的傷害作用，導(dǎo)致衰老。 好氧生物能夠通過多種途徑產(chǎn)生各種自由基和活性氧，同時(shí)生物體內(nèi)又存在著清除這些自由基和活性氧的機(jī)制，在正常條件下這兩種機(jī)制處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，生物生長(zhǎng)正常。 但當(dāng)遇到脅迫等逆境及衰老時(shí)，這種平衡破壞或?yàn)樽杂苫钚匝醍a(chǎn)生增多或?yàn)榍宄到y(tǒng)水平下降，或二者兼有，總的效應(yīng)為產(chǎn)生自由基、活性氧損傷，引起組織衰老死亡。 果蔬中活性氧物質(zhì)主要包括H2O2、羥自由基（OH）和超氧自由基（O-2）等，果蔬在成熟衰老時(shí)，活性氧物質(zhì)增加。同時(shí)作為保護(hù)酶系統(tǒng)的活性氧清除劑：超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）等和非酶保護(hù)系統(tǒng)的抗壞血酸（ASA）、維生素E（VE）類胡蘿卜素（Car）等的活性氧清除系統(tǒng)在果蔬成熟衰老中有著重要的作用。,參考知識(shí)點(diǎn),過氧化物酶在果蔬加工和保藏中的重要作用包括兩個(gè)方面： （1）過氧化物酶的活力與果蔬產(chǎn)品，特別是非酸性蔬菜，在保藏期間形成后的不良風(fēng)味有關(guān)。 （2）過氧化物酶屬于耐熱的酶類，它在果蔬加工中常被用作熱處理是否充分的指標(biāo)。當(dāng)果蔬中過氧化物酶在熱加工中失活時(shí)，其他酶以活性形式存在可能性很小。,過氧化物酶 ()與脂肪氧合酶 ()是果蔬加工中影響果蔬制品風(fēng)味的 2種主要的食品品質(zhì)酶。過氧化物酶主要催化過氧化氫分解,同時(shí)伴隨一些氫過氧化物的產(chǎn)生。脂肪氧合酶則催化多聚不飽和脂肪酸的分解也產(chǎn)生氫過氧化物。這些氫過氧化物通常是果蔬加工制品不良風(fēng)味的來(lái)源。,第三節(jié) 過氧化物酶催化的反應(yīng),過氧化物酶能催化四類反應(yīng)： (1) 有氫供體存在的條件下催化過氧化氫或氫過氧化物分解，即過氧化活力 ROOH + AH2 H20ROHA R=H、CH3或C2H5， AH2=氫供體(還原形式)和A=氫供體(氧化形式),愈創(chuàng)木酚,聯(lián)苯胺,鄰聯(lián)茴香胺,鄰苯二胺,芳香族胺,酚類化合物,（2）在沒有過氧化氫存在時(shí)的氧化作用，反應(yīng)需要O2和輔助因素：Mn2+和酚 反應(yīng)底物：草酸、草酸乙酸、二羥基富馬酸和吲哚乙酸,二羥基富馬酸,二酮琥珀酸,（3）在沒有氫供體存在的條件下催化過氧化氫分解,（4）從一元酚和氧生成鄰二羥基酚，反應(yīng)必須要有氫供體參加，例如二羥基富馬酸。 四類反應(yīng)中第一和第二類是重要的,第四節(jié) 過氧化物酶的底物,主要指第一類反應(yīng)中的過氧化物和氫供體 一、過氧化物底物 過氧化物底物主要是指過氧化氫 高濃度的H2O2可使過氧化物酶失活 不同來(lái)源的過氧化物酶其活力達(dá)到最高值時(shí)所需過氧化氫濃度時(shí)不同的。,二、氫供體底物 過氧化物酶對(duì)于氫供體的特異性要求不高。 雖然植物來(lái)源的過氧化物同功酶對(duì)氫供體表現(xiàn)出不同的特異性，然而在它們沒有被分離時(shí)，過氧化物酶能作用于多種氫供體底物。 氫供體底物的性質(zhì)影響著從過氧化物酶試樣中能檢出的同功酶的數(shù)目、酶的熱穩(wěn)定性和它的再生特征，這一點(diǎn)對(duì)于使用過氧化物酶作為果蔬熱處理是否充分的指標(biāo)時(shí)是重要的。 可溶態(tài)和結(jié)合態(tài)過氧化物酶具有不同的底物特異性。,愈創(chuàng)木酚,聯(lián)苯胺,鄰聯(lián)茴香胺,鄰苯二胺,芳香族胺,酚類化合物,第五節(jié) 過氧化物酶的最適pH和最適溫度,一、過氧化物酶的最適pH 影響過氧化物酶最適pH的因素：酶的來(lái)源、同功酶的組成、氫供體底物和緩沖液。 由于果蔬中過氧化物酶含有多種同功酶，而各同功酶的最適pH存在著差異，因此，試劑測(cè)定的最適pH往往具有較寬的范圍。 可溶態(tài)和結(jié)合態(tài)過氧化物具有不同的最適pH。 在酸性條件下，過氧化物酶的熱穩(wěn)定性較低。因?yàn)?，在酸性條件下，血紅素和蛋白質(zhì)分離而導(dǎo)致過氧化物酶的酶蛋白質(zhì)變性。,二、過氧化物酶的最適溫度 不同來(lái)源的過氧化物酶的最適溫度差別很大 馬鈴薯55 花菜3540,第六節(jié) 過氧化物酶的熱穩(wěn)定性,過氧化物酶熱失活的特點(diǎn)：雙相過程，即含有不同的耐熱性質(zhì)部分，不耐熱部分在熱處理時(shí)很快失活，而耐熱部分在同樣的熱處理溫度下緩慢地失活； 部分可逆過程，即經(jīng)熱處理的酶液在室溫或較低溫度下保藏時(shí)，酶的部分活力可以再生。,過氧化物酶作為果蔬熱處理是否充分的指標(biāo)。 在實(shí)際工作中，多少殘余活力和再生活力被允許留在被保藏的產(chǎn)品中還難以確定一個(gè)普遍適合的標(biāo)準(zhǔn)。 保留低水平的殘余活力不一定有損于產(chǎn)品的質(zhì)量； 要完全防止產(chǎn)品中的過氧化物酶的活力再生，需要很大的熱處理量。,一、熱處理中（過氧化物酶的失活）,過氧化物酶失活具有雙相特征 陡峭直線部分酶的熱不穩(wěn)定部分 中間曲線部分過渡區(qū) 平緩直線部分酶的耐熱部分,在88熱處理整粒甜玉米中過氧化物酶的失活曲線,和兩項(xiàng)都遵循一級(jí)動(dòng)力學(xué) 將平緩部分外推可計(jì)算酶的耐熱部分 溫度越高，耐熱部分所占的比例越低，熱處理溫度超過100，這兩部分就難以區(qū)別。,二、過氧化物酶同功酶的作用和性質(zhì) 同功酶在耐熱性質(zhì)上有著很大的差別。 過氧化物酶血紅素的結(jié)構(gòu)具有催化脂肪氧化的功能，因此在酶失活后，仍會(huì)影響果蔬產(chǎn)品的風(fēng)味。,三、影響過氧化物酶熱失活的因素 酶的來(lái)源 熱處理參數(shù) 溫度、時(shí)間、水分含量、pH 四、結(jié)合處理使過氧化物酶失活 微波、離子照射和加熱處理相結(jié)合,五、過氧化物酶活力的再生 將辣根過氧化物酶在70加熱1hr，然后在30下連續(xù)測(cè)定酶的活力,At酶活力 A最高酶活力，在熱處理后2030小時(shí)測(cè)定 A0熱處理后立即測(cè)定樣品的酶活力,辣根過氧化物酶再生同樣具有兩相一級(jí)動(dòng)力學(xué)特征。再生酶活力最高可達(dá)到未經(jīng)熱處理酶液活力的3040%。 在同樣熱處理?xiàng)l件下，失活的辣根過氧化物酶在50不能再生。如果將酶液的溫度從50降低到40，酶活力又開始提高。然而酶再生的速度常數(shù)隨著熱處理（70/h）后在50保持時(shí)間的增加而降低。事實(shí)上，當(dāng)在此溫度保持時(shí)間達(dá)到24h時(shí)，即幾乎不再有酶活再生的現(xiàn)象出現(xiàn)。,第七節(jié) 過氧化物酶活力的測(cè)定方法,分光光度法 H2O2和氫供體底物的濃度以及緩沖液的pH是確保反應(yīng)的最高速度進(jìn)行的重要因素。 不同的氫化態(tài)供體在不同的波長(zhǎng)下具有最高的吸光度，因此，測(cè)定過氧化物酶活力時(shí)，必須根據(jù)選用的氫供體底物選擇波長(zhǎng)。 不同來(lái)源的過氧化物酶具有不同的底物（對(duì)氫供體)特異性，因此，酶活力數(shù)值也隨著氫供體底物的不同而變化。,經(jīng)常使用的氫供體底物是愈創(chuàng)木酚。470nm 鄰苯二胺在過氧化物酶活力測(cè)定和同功酶檢測(cè)上比愈創(chuàng)木酚更為靈敏。,思考題,簡(jiǎn)述過氧化物酶的性質(zhì)及在果蔬加工中的重要性。,