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Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 生物芯片技術 溫州醫(yī)學院檢驗醫(yī)學院生命科學學院 分子生物學檢驗技術 第九章 免疫共沉淀（ Co-IP） Pull down assay 章節(jié)提要 生物芯片始于 上世紀 90年代 ，隨著人類基 因組計劃而誕生的一項新技術。它是由 Southern印跡技術衍生而來，是一門多學 個 交叉 的綜合技術，這項技術涉及到了生 命科學、計算機、微機械、微電子、物理 、化學、數(shù)學等領域。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 定義：通過 微加工 和 微電子 技術，在 固相 基質 表面 集成 了成千上萬密集排列的分子 微陣列 ，以實現(xiàn)對組織，細胞，核酸，蛋 白質及其他生物分子進行有效、準確、 高 通量 的檢測。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 章節(jié)提要 種類： 基因 芯片、 蛋白質 芯片、 組織 芯片 、 液相 芯片、 縮微 芯片實驗室。 各類芯片的定義。 最終 目標 ：把生物和化學等領域所涉及的 樣品制備，生化反應和檢測分析的整個過 程集成化，并縮微到一張芯片上自動完成 ，形成 縮微芯片實驗室 。 章節(jié)提要 章節(jié)提要 芯片技術的優(yōu)點： 多樣品并行 處理、分析 速度快 、所需樣品 量少 、 污染少 。 應有的領域：基礎研究、臨床診斷、藥物 篩選，指導用藥與治療、農(nóng)作物優(yōu)育優(yōu)選 、環(huán)境檢測、衛(wèi)生監(jiān)督、司法鑒定。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 以結構與工作機制可分為 微陣列 芯片與 微 流體 芯片 微陣列芯片：由生物材料 微陣列構成 的芯 片，以分子間的 親和結合 作為核心，以在 固相載體表面 固定 一系列 可尋址 的識別分 子陣列為結構特征，如 堿基配對，抗原抗 體結合 ，包括基因芯片，蛋白質芯片，組 織芯片等。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 章節(jié)提要 微流體芯片：以 微管道網(wǎng)絡 為結構特征 ， 實現(xiàn)對各種生化組分的 微流控操作 和分析 ， 包括 毛細管電泳 芯片 ， PCR反應 芯片等 縮微芯片實驗室優(yōu)勢：將樣品制備 、 生化 反應 、 檢測等過程 集成在一個系統(tǒng) 中 。 它 是未來芯片發(fā)展的 主流方向 之一 ， 也是生 物芯片發(fā)展的 最終目標 。 章節(jié)提要 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 本章節(jié)主要的學習內容 基因芯片 （ gene chip） 蛋白質芯片 （ protein chip） 縮微芯片實驗室 （ laboratory on a chip） Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 第一節(jié) 基因芯片 基因芯片 (gene chip)又稱 DNA芯片（ DNA chip）或 DNA微陣列（ DNA microarray）。 將 大量的 基因片段 有序地 、 高密度地 排列 在玻璃片或纖維膜等 載體上 ，稱之為基因 芯片。 DNA Microarray 的原理 經(jīng)過標記的待測樣品 DNA通過與芯片上特 定位置的探針按 堿基配對 原理雜交后，經(jīng) 激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進行 掃 描 ，通過檢測雜交信號 強度 來獲取樣品分 子的 數(shù)量 與 序列信息 ，用計算機軟件進行 數(shù)據(jù) 比較與分析 ，從而對基因序列及功能 進行大規(guī)模，高通量的 研究 。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 一、基因芯片的原理 基因芯片技術是建立在基因探針和雜交測 序技術上的一種 高效、快速 核酸序列分析手段。 同時也是 最先發(fā)展 ， 最為成熟 ， 最先商品 化 的生物芯片 芯片分類 載體不同：玻璃芯片、膜芯片、硅芯片、 陶瓷芯片 方法不同：原位合成、直接點樣 探針不同：寡核苷酸、 cDNA、基因組芯片 用途不同：表達譜、測序芯片、診斷芯片 、 SNP分型 分析步驟為： 生物芯片的 制作 、樣品 處理及標記 、雜交或 反 應 、雜交 檢測 及 數(shù)據(jù) 處理等。 芯片設計 芯片制作 PCR擴增 靶基因標記 原位合成 點樣方法 實際應用 樣品處理 芯片雜交 數(shù)據(jù)分析 雜交檢測 放射顯影光 化學電化學 酶促反應 芯片技術發(fā)展的關鍵 無孔的 固相載體 ，如玻璃 高密度寡核苷酸片段的 原位合成 技術 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 載體的定義與種類 定義：用于 連接、吸附或包埋 各類生物分 子使其以 水不溶性狀態(tài) 行使功能的 固相材 料 。 玻片 固體片狀 硅片 瓷片 硝酸纖維素膜 膜性材料 尼龍膜 聚丙烯膜 具有可以進行化學反應的 活性基團 ，便于 與生物分子進行 偶聯(lián) 。 要有 惰性與穩(wěn)定性 ：惰性（非特異吸附和 其他性能不干擾生物分子的動能）穩(wěn)定性 （能承受一定的壓力與酸堿條件的變化） 良好的 兼容性 (便于制作其他類型的芯片 ) 載體材料的要求 載體的表面處理 原因 ：核苷酸片段 無法直接 連接到載體表 面，故 需要活化 ，便于固定生物分子。 試劑 ：碳二亞氨， N-羥基琥珀酰亞胺酯。 活性基團 ：氨基、羥基、巰基、醛基 處理依據(jù) ：載體表面性質、生物分子的化 學特征 常見載體 薄膜狀載體 優(yōu)點：與核酸親和力強、技術成熟。 膜結合玻璃片 優(yōu)點：親和性、剛性 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 處理載體的基本要求 修飾后表面要 均勻且硬質 有效固定 各種類型 生物材料 在激發(fā)光下，熒光 背景低 高密度 ， 大量 ， 均勻 的點陣， 變異系數(shù)小 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 探針固定到固相支持物上，方法有兩種： 光去保護并行合成法 原位合成 分子印章原位合成法 噴印合成法（壓電打印法） 合成點樣 通過特定的高速點樣機器人直接將探針點 在芯片上的技術。 合成 cDNA探針的原則 設計于目的 cDNA的 3端。 避免長片段重復序列 長度為 0.1-2.5kb Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 寡核苷酸探針 長度 16-26bp， G+C在 40-60% 探針內不用大于 4bp的堿基互補配對序列， 同一個堿基連續(xù)出現(xiàn)小于 4個 與非靶序列的同源性低于 70%，小于 8個堿 基相同。 設置多個序列相近的參考寡核苷酸探針。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 點突變檢測核苷酸探針 設計方法：等長移位設計法 按靶序列從頭到尾依次去一定長度的互 補的核苷酸序列組成的一套探針組合。這 套探針是野生型探針，然后對每一野生型 探針中間的某一堿基用其他三種堿基替代 。 主要目的：進行點突變掃描 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 探針在載體表面的固定（一） 合成點樣法：通過 PCR擴增或人工 合成 序 列，通過計算機控制的三坐標工作平臺， 用針頭和微噴頭分別把探針溶液 分配 在固 相載體表的位點上，通過物理或化學法 固 定 探針。 優(yōu)點：技術成熟，靈活性大，適用于單位 自行合成 。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 在硬質表面上直接合成寡核苷酸探針序列 原位光刻合成法、壓電打印合成法，分子 原位合成法。 技術瓶頸：高空間分辨率的模板點位技術 、高合成效率的 DNA化學合成技術 優(yōu)點：標準化，規(guī)模化 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 探針在載體表面的固定（二） Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 原位合成的原理 基因芯片的原位合成法是基于 組合化學 的 合成原理。 它通過一組 定位模板 來決定基片表面上不 同化學單體的 偶聯(lián)位點和次序 ，如要合成 AGCT四種堿基所有序列組合的四聚體 (44 種 )。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 原位光刻合成法 主要步驟為： 1.首先用光敏保護支持物活化基團 2.選擇合適的蔽光膜保護不需要聚合的地方，暴露 需要聚合的位點 3.在激光點光源的照射下，去除光敏感保護基團， 使該位點顯露出活性的羥基或者氨基 4.加入的單核苷酸，與活化端發(fā)生化學反應 5.然后更換蔽光膜，重復上步驟，完成核苷酸的固 定連接（見圖）。 優(yōu)點： 在 較小的區(qū)域制造大量不同的探針 。 圖 9-2基因芯片原位合成原理示意圖 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 噴印合成法（壓電打印法） 原理： 墨盒內所用的 ATCG四種堿基而非碳粉。 步驟： 將特定的 DNA堿基合成試劑噴灑到特定 位置上，以固相合成的原理與支持物發(fā)生偶 聯(lián)，然后固定，沖洗，去保護，偶聯(lián)，直至 合成完所需長度的探針。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 分子印章原位合成法 分子印章的制備和壓印過程如見圖 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics （三）合成點樣 由具有多個微細加樣孔的陣列復制器 (arraying and replicating device， ARD)或陣列器及由電 腦控制的機器人來完成。 機器人準確、快速地將不同探針樣品定量 (0.25 1.0l)點樣于預處理好的基板相應位置上，在基板 上產(chǎn)生直徑為 100 150m斑點，再由紫外線交 聯(lián)固定后即得到 DNA微陣列或芯片。 合成點樣法分類 接觸式點樣 噴墨式打印 定位準確，重復性好 斑點大，大小分布不均，密度低。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 二、樣品的制備 及標記 （一）樣品的制備 樣品的 擴增 在標記和分析前對樣品進行適當程度的擴 增，以提高閱讀靈敏度。 待測樣品的 標記 多采用熒光標記（ cy3、 cy5和 FAM）方法， 對于陣列 密度較小 的基因芯片可以用 同位 素 檢測法。 熒光標記的優(yōu)點 激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的 STOCKs位移 大，故分辨率強，靈敏度高 可以進行定量檢測 避免放射性同位素好的污染。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 三 樣品與基因芯片的雜交 本質 ： DNA探針與靶基因堿基雜交形成 DNA雙鏈或 DNA/RNA雜合鏈。 影響因素 ： 靶分子濃度 探針濃度 序列組成 鹽濃度 雜交溫度 反應時間 基因表達 檢測 低溫，高鹽，長時間 突變 檢測 高溫，低鹽，短時間 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 四、雜交結果的檢測 檢測方法很多，如 熒光顯影法 、質譜法、化學發(fā) 光和光導纖維等。 熒光檢測器 激光共聚焦 快速傳輸 高質量圖像，靈敏度高， 分辨率好 價格昂貴 偶聯(lián)裝置照相機 掃描速度快，價格便宜 靈敏度低 熒光顯影法 完全匹配產(chǎn)生的熒光強度比存在一兩個錯 配的 高 5-35倍 熒光 強度 與待測分子的 含量呈線性 關系 問題 只要結合就會有陽性信號， 無法 確認是否 完全匹配 解決方法 使用多色熒光技術 不同靶基因使用不 同激發(fā)波長的熒光標記物。 芯片 激光光源 電子束分裂器 聚焦小孔 檢 測 器 濾光鏡 聚光鏡 物鏡 使用最廣泛的是熒光顯影法 光纖 DNA生物傳感器微陣列 原理： 將合成的 氰尿酰氯 活化的 探針固定在光 纖 的末端， 集成 含有不同探針的光纖，形成 傳感裝 置，探針伸入樣品中，信號由另一端 的 CCD檢測 。 優(yōu)勢 方便，可在沒有 confocal的實驗室中開展 實驗。 五、雜交結果的分析 標準化 ：消除不同芯片，不同標記物的差 異 數(shù)據(jù)精簡 ：去掉無顯要意義的數(shù)據(jù) 統(tǒng)計學分析 ：對數(shù)據(jù)進行分析歸類，并進 行統(tǒng)計學檢驗，保證器準確性 生物學意義分析 ：基于統(tǒng)計結果，研究其 代表的生物學意義，得出相應結論 數(shù)據(jù)庫 ： Genesist， AMADA， TIGR。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 三、基因芯片技術在醫(yī)學領域的應用 基因芯片技術的基本應用可以分為兩個主 要方面： 定量分析 （主要指測序和突變檢測） 定性分析 （主要指對基因表達的研究）。 基因功能研究 基因表達及調控的研究 基因突變和多態(tài)性的檢測 DNA序列的測定 基因組及基因研究 基因表達及調控的研究 基因芯片應用 最廣泛的領域 從 整體上 分析細胞基因表達狀況，為了解 與某些生命現(xiàn)象相關的基因表達提供有力 的 證據(jù) ，對于 基因調控 以及基 因相互作用 機理的探討有重要的意義 基因突變和多態(tài)性的檢測 利用基因芯片技術對一些突變點的 定位 、 確認及分類 是診斷基因疾病的基礎。 寡核苷酸芯片能夠檢出變異位點，被代替 的核苷酸以及變異的特性。 例如： HIV病毒 RT與 PRO的突變檢測。 DNA序列測定 原理：任何線性 DNA或 RNA單鏈都可以被 分解為一系列堿基數(shù)固定，錯落重疊的寡 核苷酸片段，或稱為 亞序列 ，只要測出莫 伊核苷酸的全部亞序列，就可以還原原序 列。 優(yōu)點 快速、成本低、易于自動化 缺點 雜交條件 不統(tǒng)一 、易出現(xiàn) 假性 結果、 重復序列 無法測定 。 優(yōu)勢 測定已知序列、研究突變與 SNP檢 測。 基因組及基因研究 研究酵母基因組的復制活動：發(fā)現(xiàn)其復制 起點、復制叉在基因組的移動與 S期復制和 轉錄活動的關系 優(yōu)勢： 用量少、自動化、便于大量篩選新 基因 基因芯片應用于疾病診斷的 優(yōu)勢 靈敏、準確、快速、簡單、高通量（同時 檢測多種疾?。?應用： 感染性 疾病診斷 出生缺陷檢測 遺傳性 疾病的診斷 HLA配型檢測 腫瘤 診斷及分型 神經(jīng)系統(tǒng)疾病檢測 耐藥 性檢測 疾病診斷 感染性疾病診斷 流程 將待測病原體的 特征基因 片段或寡核苷 酸探針固定于玻片上制成芯片 ， 從患者的 血清中提取的 病原 DNA或 RNA經(jīng)擴增標記 熒光后與芯片進行 雜交 ， 掃描 雜交信號 ， 計算機 分析 ， 得出 定性或定量 的結果 。 由于病原微生物的不同 亞型 ，不同的 突變 株 會導致患者的 發(fā)病 程度，患者對藥物的 敏感 程度等的差異，故對病原微生物的分 型，可以幫助醫(yī)生了解患者的病情，確定 最佳治療 方案。 如 HPV亞型 123種，其中 20種高危，提前診 斷 HPV感染，有利于防止宮頸癌變，降低 死亡率?；蛐酒贤瑫r對 21種不同類型 的 HPV診斷， 3.5小時完成。 感染性疾病診斷 遺傳性疾病的診斷 現(xiàn)行診斷遺傳學疾病方法（ PCR，測序、 RFLP）的 共同缺點通量低 。 遺傳性疾病中可能是由眾多位點中的一個 或多個位點突變引起的，因此對多位點檢 測尤為重要。 如 beta-地中海貧血，突變 100種以上。 應用于血友病，杜氏肌營養(yǎng)不良癥、苯丙 酮尿癥，血紅蛋白異常病。 腫瘤診斷及分型 獲取腫瘤細胞生長各期與腫瘤生長相關 基 因的表達模式 篩選出哪些分子起關鍵性的調控作用的基 因 腫瘤分型 （乳腺癌） 應用如 p53基因突變檢測 耐藥性檢測 病原微生物的 表達譜 檢測 突變 分析 多態(tài)性 分析 目的 指導 抑制靶分子的新藥合成、臨 床用藥 基因芯片在藥物研究中的應用 可直接在基因水平上 尋找藥物靶標 ， 解釋 作用機理 ， 檢測 藥物的 毒副作用 ，為藥物 開發(fā)與設計 提供理論依據(jù) 。 作用體現(xiàn) ： 代替人體的靶組織 分析代謝途徑與信號通路 確定藥物作用的靶組織 引導藥物開發(fā) 縮短周期，便捷 基因芯片存在的問題 探針合成中會 插入雜質 ， 降低特異性 制備標記 過程比較 復雜 。 數(shù)據(jù) 缺乏可比性 ，不利于芯片 數(shù)據(jù)的共享 產(chǎn)生原因： 蛋白質的表達與其上游的 mRNA的表達 未顯 示出直接關系 。 蛋白質結構或構象的 微小變化 均能導致其活 性與 功能的改變 定義：是指固定于支持介質上的 多肽或蛋白 質 構成的微陣列 第二節(jié) 蛋白質芯片 第二節(jié) 蛋白質芯片 第二節(jié) 蛋白質芯片 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 第二節(jié) 蛋白質芯片 蛋白質芯片技術是一種 快捷、高效、并行、 高通量、微型化和自動化 的蛋白質分析技 術。 蛋白質芯片適用于 蛋白質 -蛋白質、蛋白質 - DNA、蛋白質 -RNA、蛋白質 -小分子物質 間 相互作用的分析。 是功能基因組、蛋白質組研究領域中一種 新型的 重要工具。 蛋白質芯片 原理：采用 機械點樣或共價結合 等方法將 多肽、蛋白質、酶、抗原或抗體 固定于 固 相載體上形成 分子點陣 ，并將待測蛋白質 與該芯片進行 孵育反應 ，再將 熒光標記 的 蛋白質與芯片 蛋白質復合物反應。通 過掃描系統(tǒng)檢測個點的 熒光強度 ，分析蛋 白質與蛋白質之間的相互作用，由此達到 測定蛋白功能 的目的。 蛋白質芯片的分類 蛋白質功能芯片 天然蛋白質 點在基片上，用于蛋白 活性 及分子 親和性 的高通量平行分析。 蛋白質檢測芯片 將高度親和特異性的探針分子（ mAb） 點在基片上，用以檢測復雜樣品中 目的蛋白 。 蛋白質芯片的分類 1. 支持物表面高度密集排列探針蛋白 點陣 微陣列 微孔板 測定時，特異性地捕獲樣品中的靶蛋白， 然后通過檢測系統(tǒng)對靶蛋白進行定性及定量 分析?？贵w為常用的探針蛋白。 2. 三維凝膠 塊芯片 實質是在基片上點布以 10000個微小 PAGE膠塊，主要用于篩選抗體抗原，酶動 力學反應的研究。 優(yōu)點： 靈敏、蛋白結構天然 蛋白質芯片的制備與分析 載體 探針蛋白的制備 探針的固定 檢測 載體 要求： 穩(wěn)定性，兼容性 種類： 化學 膜 尼龍膜、硝酸纖維素膜、聚苯乙烯膜 無需復雜的表面處理 背景高，靈敏度低 PAGE膠 儲水環(huán)境 保持探針活性，除反應液困 難 微孔 板 性能良好，探針分隔良好 交叉污染程度 低，液相 保持探針活性 玻 片 為最佳載體 需表面修飾（醛基、 BSA、 poly- lysine） 高通量 自動化 效率高 探針的制備 種類：抗體、抗原、蛋白質、配體、受體 、酶、核酸、多肽 要求：親和性強、特異性高。 應用最廣泛的探針：抗體，抗原，尤其是 mAb Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 探針蛋白的制備 蛋白質芯片上的探針蛋白可選用抗體、 抗原、受體、酶等具有生物活性的蛋白 質。單克隆抗體是比較好的一種探針蛋 白。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 探針的固定 體外合成 的劣勢 多肽長度不易控制、探針活性位置 點加法 ： 手工點樣 接觸式點樣 噴墨點樣法 固定后，需用 BSA溶液封閉 提高特異性 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics （四）蛋白質芯片的檢測 1.直接檢測法 表面等離子體共振 分辨熒光光譜技術 表面增強激光解吸及電離飛行時間質 譜 2.蛋白質標記法 預先標記待測物，常用標記物有熒光染料 cy3,cy5，也可標記蛋白質的二抗 優(yōu)勢：原理簡單，使用安全，分辨率高 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 四、蛋白質芯片的應用 優(yōu)勢 高通量 靈敏度高 用量少 應用 （一）疾病診斷與療效判定 （二）新藥的研制與開發(fā) （三）蛋白質研究方面的應用 疾病診斷與療效判定 表型指紋 同時測定樣品中 全部蛋白含量 的變化 優(yōu)勢 不受單個 標志物的特異性與靈敏度的 限制 應用 腫瘤 C12診斷系統(tǒng) 自免疫疾病 抗原檢測 新藥的研制與開發(fā) 用芯片找到病理狀態(tài)下 表達異?；蛱禺愋?表達 的蛋白質及通路中 關鍵蛋白 ，以這些 蛋白為 靶分子 ，合成芯片，研究藥物對這 些蛋白的作用。 優(yōu)勢 節(jié)約時間，減少動物實驗，降低盲目性 生物分子間的相互作用 抗原 -抗體相互作用 蛋白質 -蛋白質相互作用 小分子 -蛋白質相互作用 蛋白質 -核酸相互作用 酶 -底物相互作用 蛋白質芯片 應用 蛋白芯片的缺陷 制作 繁瑣 ，檢測需 專門的儀器 ， 成本高 載體表面修飾技術，探針固定 技術需改進 不能捕獲 全部 蛋白質信息 實驗 要求高 ，不易控制， 重復性不足 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 第三節(jié) 縮微芯片實驗室 縮微芯片實驗室就是將生命科學和醫(yī)學研 究中的 許多不連續(xù)的分析過程 ，如樣品制 備、核酸標記、生化反應、分離檢測及數(shù) 據(jù)處理等，通過采用半導體光刻加工等縮 微技術， 集成到一塊生物芯片 上所形成的 一種便攜式 生物化學分析系統(tǒng) 。 特點 集成實驗單元 時間短 速度快 信息量 大 縮微芯片實驗室 高度集成化 體積小 自動化 重量輕 高通量 便于攜帶 分析速度快 污染小 樣品量少 成本低 Lab on a chip Lab on a chip