過氧化物酶體增殖物激活受體γ在大腸腫瘤中的表

過氧化物酶體增殖物激活受體在大腸腫瘤中的表【摘要】 目的 在蛋白及mrna水平確定過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxiome proliferatoractivated receptor, ppar）在大腸腫瘤中的表達。方法 結(jié)腸鏡下活檢標本，分為正常大腸粘膜組、大腸腺瘤組及大腸癌組，免疫組化及rtpcr方法檢測各組ppar的表達。結(jié)果 正常大腸粘膜中表達ppar蛋白的細胞主要是接近腸腔，分化良好的腺上皮細胞；而在大腸腺瘤中，ppar陽性的細胞呈彌漫分布。ppar蛋白及mrna在大腸癌中的表達顯著增加，明顯高于大腸腺瘤和正常大腸粘膜(p0.05）。ppar mrna在重度異型增生腺瘤中的表達高于正常大腸粘膜(p0.05）。結(jié)論 大腸腺瘤最先發(fā)生ppar表達部位的變化,ppar在重度異型增生的大腸腺瘤及大腸癌中的表達水平較高，表明ppar可能在早期即參與大腸癌的發(fā)生發(fā)展?！娟P(guān)鍵詞】 過氧化物酶體增殖物激活受體 大腸腺瘤 大腸癌 大腸癌多數(shù)由大腸腺瘤演變而來，其發(fā)生的經(jīng)典多步驟模式為“腺瘤腺癌序列”。過氯化物酶體增殖物激活受體(peroxiome proliferatoractivated receptor,ppar)是由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子ppars的一個亞型，與消化道腫瘤關(guān)系密切。wwW.133229.cOM有研究發(fā)現(xiàn)ppar在大腸粘膜細胞中有表達，本研究旨在蛋白水平和mrna水平確定大腸腫瘤中ppar的表達情況。 1 材料與方法 1.1 材料收集、分組 所有組織均取自北醫(yī)三院消化科結(jié)腸鏡下活檢標本，并經(jīng)病理診斷證實。正常大腸粘膜15例、大腸腺瘤16例及大腸癌上皮15例行免疫組織化學染色。正常大腸粘膜24例、大腸腺瘤58例(其中重度異型增生大腸腺瘤14例)及大腸癌上皮38例行rtpcr。 1.2 ppar的免疫組化染色 組織取材后于福爾馬林中固定、脫水、常規(guī)石蠟包埋、切片（厚4m）鋪于多聚賴氨酸涂布的載玻片上常規(guī)脫蠟至水0.1m pbs浸泡5min抗原修復（0.1m枸櫞酸鹽緩沖液預熱至9298，放入玻片，微波爐內(nèi)9298加熱5min，自然冷卻至室溫）0.1m pbs沖洗5min3%過氧化氫孵育10min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性0.1m pbs沖洗5min滴加封閉用正常山羊血清（北京中山生物科技公司），室溫孵育15min，傾去滴加120稀釋的鼠抗人ppar單克隆抗體(一抗，santa cruz 生物技術(shù)公司，美國)，4過夜。0.1m pbs沖洗5min滴加生物素標記羊抗小鼠igg（二抗，北京中山生物科技公司），37孵育15min0.1m pbs沖洗5min滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液（北京中山生物科技公司），37孵育15min0.1m pbs沖洗dab顯色，自來水充分沖洗蘇木素復染后封片。陰性對照用正常山羊血清代替一抗。 ppar陽性反應表現(xiàn)為細胞核和胞漿呈棕褐色。每張切片選取35個視野，用真彩色病理圖像分析系統(tǒng) 4.0（北航圖像中心）對免疫組化染色結(jié)果進行分析，計算面密度(陽性目標總面積/統(tǒng)計場總面積)，并進行統(tǒng)計。 1.3 rt pcr trizol（invitrogen公司）提取組織總rna，適量depc水溶解后，分光光度計（uv1601，shimadzu）測od260 及od280的值及電泳測定rna濃度及純度；各取2g的rna，impromiirt試劑盒（promega公司）將rna逆轉(zhuǎn)錄為cdna；taq dna聚合酶（北京泛基諾科技有限公司）作用下進行pcr反應（pcr儀為geneamp9700， 美國applied biosyetems公司）。反應條件見表1。 陰性對照不加逆轉(zhuǎn)錄酶，代以去離子水，余反應條件同前。 內(nèi)參actin及目的基因ppar的pcr產(chǎn)物各6l于1.5%瓊脂糖凝膠75v/cm恒壓電泳，eb染色后在紫外燈下觀察，清晰見341bp和500bp的條帶，在imagemaster凝膠成像系統(tǒng)儀（quantity 0ne，美國柯達公司）下分析。ppar與actin電泳條帶灰度的比值代表各組ppar的表達水平。 1.4 統(tǒng)計學分析 結(jié)果用s表示。采用spss11.0軟件分析。計量資料的組間比較采用單因素方差分析，p 2 結(jié)果 2.1 ppar 蛋白在人正常大腸粘膜、大腸腺瘤及大腸癌中的表達 免疫組化結(jié)果顯示：在正常大腸粘膜、大腸腺瘤及大腸癌中均有ppar的表達。正常大腸粘膜組織中表達ppar的細胞主要是接近腸腔、分化良好的腺上皮細胞，見圖1a；而在大腸腺瘤組織中，ppar陽性細胞的分布發(fā)生異常，分布的極性消失，呈彌漫分布，見圖1b。ppar蛋白在正常大腸粘膜及腺瘤中的表達差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。 ppar蛋白在大腸癌細胞中高表達，見圖1c, 明顯高于在大腸腺瘤及大腸粘膜中的表達 (p2.2 ppar mrna 在正常大腸粘膜、大腸腺瘤及大腸癌上皮中的表達 rtpcr結(jié)果顯示：大腸癌中的ppar mrna的表達水平最高，明顯高于正常大腸粘膜和大腸腺瘤，與兩者相比，差異均有統(tǒng)計學意義（p均0.05），見表3，圖2。 2.3 ppar mrna在正常大腸粘膜、重度異型增生大腸腺瘤及大腸癌中的表達 rtpcr結(jié)果顯示：重度異型增生腺瘤中ppar mrna的表達高于正常大腸粘膜，兩者間差異有統(tǒng)計學意義(p0.05），見表4。表1 ppar pcr擴增反應條件 擴增基因反應體系cdna模板引物序列退火溫度循環(huán)次數(shù)產(chǎn)物大小ppar25l2l上游: 5atgacagcgacttggcaata350c40341bp下游: 5gcaactggaagaagggaaat3actin25l1.5l上游: 5gtggggcgccccaggcacca35525500bp下游: 5ctccttaatgtcacgcacgat3 圖1 ppar蛋白在正常大腸粘膜(a)、大腸腺瘤(b)及大腸癌中的表達(c) m:marker;control:陰性對照;n:正常大腸粘膜;a:大腸腺瘤;c:大腸癌表3 ppar在正常大腸粘膜、大腸腺瘤 3 討論 ppar是由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子ppars的一個亞型，亞油酸、花生四烯酸，15脫氧12，14前列腺素j2(15dpgj2) 是其天然配體，噻唑烷二酮類藥物（tzd）、某些非甾體類抗炎藥（nsaids），如舒林酸為其合成配體。ppar的生物學功能復雜，在調(diào)控脂肪和糖代謝、脂肪細胞及單核細胞分化成熟、炎癥反應、誘導腸細胞分化及腫瘤細胞的分化和凋亡中起重要作用。 已證實，ppar在脂肪細胞中高表達，近期數(shù)據(jù)表明大腸中ppar的表達水平與脂肪細胞中相似1,2。mansen1等免疫組化及western實驗發(fā)現(xiàn)鼠大腸和小腸粘膜均表達ppar。而且，ppar在朝向管腔分化好的大腸粘膜細胞中表達水平較高，大腸中ppar mrna的表達也高于小腸。lefebvre3等的研究發(fā)現(xiàn)嚙齒動物和人類大腸中ppar mrna及蛋白的表達水平高于小腸，而且ppar都分布在分化較好的大腸粘膜細胞中。在 caco2和ht29人大腸腺癌細胞系中，ppar的表達隨分化級別的增高而增加，說明ppar表達水平與大腸上皮細胞的分化表型有關(guān)。此外，在多種小腸腫瘤的小鼠中，ppar在大腸中的表達也高于小腸4,5。這些結(jié)果表明腸道粘膜中存在ppar，但它同大腸腫瘤的關(guān)系尚不明了。 最近的研究顯示，ppar的代表性配體噻唑烷二酮具有抑制ppar陽性的大腸癌細胞系ht29的生長和轉(zhuǎn)移的作用6。而且，ppar的配體可以促進多種細胞，包括大腸癌細胞的凋亡，并促進其分化及生長抑制7?？梢?，ppar與大腸腫瘤的關(guān)系密切。 我們的研究顯示：ppar主要在朝向大腸管腔的分化好上皮細胞中表達，同國外的研究結(jié)果相同1,3。ppar蛋白及mrna在正常大腸粘膜與大腸腺瘤無明顯差別。然而，ppar蛋白在大腸腺瘤中彌漫分布，可見于腺窩底部分化不好的上皮細胞中。同時，ppar蛋白及mrna在大腸癌中高表達，明顯高于正常大腸粘膜及大腸腺瘤中的表達。這些數(shù)據(jù)表明ppar表達異?？赡苁谴竽c癌發(fā)生的早期事件，首先發(fā)生ppar表達部位的異常，隨后出現(xiàn)表達量的異常。我們研究顯示重度異型增生腺瘤中ppar mrna表達接近于大腸癌中的表達也支持這一假設。我們的結(jié)果同houseknecht7、dubois8和su9的結(jié)果一致。 然而，大腸腫瘤中ppar升高的原因尚不明確。chen10等考慮大腸腫瘤中ppar的高水平表達為代償性的。已證實大腸癌中抗凋亡基因bcl2的表達升高，使大腸癌細胞凋亡減少而起到促進腫瘤生長的作用。同時，越來越多的證據(jù)說明激活ppar后促進癌細胞的凋亡1113，即ppar和bcl2在大腸癌中的作用相反，兩者在維持細胞的增殖、分化和凋亡的平衡中存在相互制約的關(guān)系。chen的研究11提示大腸腫瘤中ppar內(nèi)源性配體存在缺陷，在無外源性配體存在的情況下，ppar不能被充分激活。大腸腫瘤中高表達的ppar不能充分發(fā)揮其促凋亡作用，而高水平表達的bcl2卻可以抑制大腸腫瘤的凋亡，為了與升高的bcl2維持制約平衡，大腸腫瘤中ppar進一步代償性升高。另外，park等14認為，在腺瘤樣大腸息肉易感基因（apc）突變的大腸癌細胞中，ppars的另一個亞型ppar的表達也增加，而ppar和ppar競爭性結(jié)合維甲酸x受體（rxr）進而發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄作用。因此，為了充分發(fā)揮作用，大腸癌細胞中ppar水平升高。 總之，ppar表達部位的變化首先見于大腸腺瘤，重度異型增生的腺瘤及大腸癌中ppar的表達水平較高。這些數(shù)據(jù)表明ppar可能在大腸癌發(fā)生的早期起作用，ppar表達水平的升高有可能成為大腸腫瘤的表型標志。 【參考文獻】 1 mansen a, guardioladiaz h, rafter j,et al. expression of the peroxisome proliferatoractivated receptor (ppar) in the mouse colonic mucosaj. biochem biophys res commun，1996,222(3):844851.2 auboeuf d，rieusset j, fajas l,et al. tissue distribution and quantification of the expression of mrnas of peroxisome proliferatoractivated receptors and liver x receptoralpha in humans: no alteration in adipose tissue of obese and niddm patientsj. diabetes，1997,46(8):13191327.3 lefebvre m, paulweber b, fajas l,et al. peroxisome proliferatorsactivated receptor gamma is induced during differentiation of colon epithelium cellj. j endocrinol，1999,162(3):331340.4 saez e, tontonoz p, nelson mc,et al. activators of the nuclear receptor ppargamma enhance colon polyp formationj. nat med 1998,4(9):10581061.5 lefebvre am, chen i, desreumaux p,et al. activation of the peroxisome proliferatorsactivated receptor gamma promotes the development of colon tumors in c57bl/6japcmin/+ micej. nat med，1998,4(9):10531057.6 yoshizumi t, ohta t, ninomiya i,et al. thiazolidinedione, a peroxisome proliferatoractivated receptorgamma ligand, inhibits growth and metastasis of ht29 human colon cancer cells through differentiationpromoting effectsj. int j oncol, 2004,25(3):631639.7 houseknecht kl, coleb m, steele pj. peroxisome proliferatorsactivated receptor gamma and review j. domest anim endocrinol, 2002, 22(1):123.8 dubois rn, gupta r, brockman j,et al. the nuclear eicosanoid receptor, ppargamma, is aberrantly expressed in colonic cancersj. carcinogenesis，1998,19(1):4953.9 su cg, wen x, bailey st,et al. a novel therapy for colitis utilizing ppar ligands to inhibit the epithelial inflammatory responsej. j clin invest，1999,104(4):383389.10chen gg, lee jf, wang sh,et al. apoptosis induced by activation of peroxisome proliferator activated receptorgamma is associated with bcl2 and nfkappab in human colon cancer j. life sci，2002, 70(22):26312646.11brockman ja ,gupta ra，dubois rn. activation of ppar leads to inhibition of anchorageindependent growth of human colorectal cancer cellsj. gastroenterology，1998,115(5) :10491055.12kitamura s, miyazaki y, shinomura y, et al. peroxisome proliferatoracticated receptor gamma induces growth arrest and differentiation markers of human colon cancer cells j. jpn j cancer res，1999，90(1) :7580.13sarraf p, mueller e ,jones d, et al. differentiation and reversal of malignant changes in colon cancer through pparj. nature med，1998，4(9) :10461052.14park bh, breyer b, he th. peroxisome proliferatoractivated receptors :roles in tumorigenesis and chemoprevention in human cancerj. curr opin oncol，2001,13(1):7883.