DNA的粗提取與鑒定 實驗報告課件.ppt

DNA在 在 NaCl溶 液 濃 度 低 于0.14 mol/L時 ， DNA的 溶解 度 隨 NaCl溶 液 濃 度 的增 加 而 逐 漸 降 低 ； 在0.14 mol/L時 ， DNA溶 解度 最 小 ； 當(dāng) NaCl溶 液 濃度 繼 續(xù) 增 加 時 ， DNA的 溶解 度 又 逐 漸 增 大 。當(dāng) 氯 化 鈉 的 物 質(zhì) 的 量 濃度 為 2 mol L時 ， DNA的 溶 解 度 最 大 ， 濃 度 為 0 14 mol L時 ， DNA的溶 解 度 最 低 。 利 用 這 一原 理 ， 可 以 使 DNA在 鹽 溶液 中 溶 解 或 析 出 。 DNA的 鑒 定 DNA 的粗提取與鑒定 實 驗 原 理 DNA在 不 同 濃 度 NaCl溶 液 中 溶 解 度 不 同DNA與 其 他 細(xì) 胞 成 分 在 酒 精 中 溶 解 度 不 同DNA和 蛋 白 質(zhì) 對 酶 、 高 溫 和 洗 滌 劑 耐 受 性 不 同DNA與 二 苯 胺 呈 現(xiàn) 藍(lán) 色 反 應(yīng)DNA粗 提 取 選 擇 適 宜 材 料 破 碎 細(xì) 胞DNA的 溶 解 和 析 出DNA的 純 化鑒 定 DNA 與 二 苯 胺 混 合 ， 沸 水 浴 ， 呈 現(xiàn) 藍(lán) 色 反 應(yīng) 方 法 步 驟 加 入 物 質(zhì) 目 的 1.制 備 雞 血 細(xì) 胞 液 檸 檬 酸 鈉 溶 液 2.提 取 雞 血 細(xì) 胞 細(xì) 胞 核 物 質(zhì) 20 m1蒸 餾 水 3.溶 解 細(xì) 胞 核 內(nèi) 的 DNA 2 mo1 L 的 NaCl 溶 液 40 mL 4.析 出 含 DNA的 黏 稠 物 蒸 餾 水 5.濾 取 含 DNA的 黏 稠 物 6.將 DNA的 黏 稠 物 再 溶 解 2 mol L的 NaCl溶 液 20 mL 7.過 濾 含 DNA的 NaCl溶 液 8.提 取 含 有 雜 質(zhì) 較 少 的 DNA 冷 卻 的 95 的 酒 精 50 mL A:(1)向 試 管 中 加 入 2mol L的 NaCl溶 液 5mL (2)加 入 DNA (3)4 mL二 苯 胺 試 劑 9.DNA的 鑒 定 B:(1)向 試 管 中 加 入 2mol L 的 NaCl溶 液 5mL (2)4 mL二 苯 胺 試 劑 加 入 檸 檬 酸 鈉 溶 液 的 目 的 是 防 止 血 凝 固 加 速 血 細(xì) 胞 破 裂 溶 解 DNA 使 2mol/L的 NaCl溶 液 稀 釋 至 0.14mol/L使 得 DNA最 大 限 度 地 釋 出 使 含 DNA的 黏 稠 物 被 留 在 紗 布 上 使 含 DNA的 黏 稠 物 盡 可 能 多 的 溶 解 于 溶 液 中 除 去 含 DNA的 濾 液 中 的 雜 質(zhì) 提 取 DNA A出 現(xiàn) 藍(lán) 色 B無 變 化 DNA的 粗 提 取 與 鑒 定一 、 實 驗 原 理 1.血 細(xì) 胞 在 蒸 餾 水 中 會 滲 透 吸 水 過 度 而 導(dǎo) 致 細(xì) 胞 膜 和 細(xì)胞 核 膜 的 破 裂 。 利 用 此 特 性 可 得 到 含 有 DNA的 溶 液 。2.DNA在 氯 化 鈉 溶 液 中 的 溶 解 度 ， 是 隨 著 氯 化 鈉 的 濃 度的 變 化 而 改 變 的 。 DNA在 物 質(zhì) 的 量 濃 度 為 0.14 mol L的 氯 化 鈉 溶 液 中 的 溶 解 度 最 低 ， 利 用 這 一 原 理 ， 可 以 使溶 解 在 氯 化 鈉 溶 液 中 的 DNA析 出 。 3.DNA不 溶 于 酒 精 溶 液 ， 但 細(xì) 胞 中 的 某 些 物 質(zhì) 則 可 以 溶于 酒 精 。 利 用 這 一 原 理 ， 可 以 進(jìn) 一 步 提 取 出 含 雜 質(zhì) 較 少的 DNA。 4.DNA遇 二 苯 胺 （ 沸 水 浴 ） 會 變 成 藍(lán) 色 ， 因 此 ， 二 苯 胺可 以 作 為 鑒 定 DNA的 試 劑 。 二 、 方 法 與 過 程 1.制 雞 血 細(xì) 胞 液 （ 活 雞 鮮 血 經(jīng) 分 離 或 沉 淀 獲 得 ）0.1g/mL檸 檬 酸 鈉 100mL活 雞 鮮 血 180mL 500mL燒 杯 中 ， 玻 棒 攪 拌 ，離 心 、 分 離 或 靜 置 沉 淀 。2.提 取 DNA 取 血 細(xì) 胞 5-10mL 20mL蒸 餾 水 ， 用 玻 棒 沿 一 個 方 向快 速 攪 拌 。 紗 布 過 濾 ： 濾 液 中 含 DNA和 其 他 核 物 質(zhì) ， 如 蛋 白 質(zhì) 。 原 理 ： 血 細(xì) 胞 的 細(xì) 胞 膜 、 核 摸 吸 水 脹 破 ， 玻 璃 棒 快 速攪 拌 ， 機(jī) 械 加 速 血 細(xì) 胞 破 裂 。 .提 取 血 細(xì) 胞 核 物 質(zhì) ： .溶 解 核 內(nèi) 的 DNA： 濾 液 2mol/L的 NaCl溶 液 40mL， 玻 棒 沿 一 個 方 向輕 緩 攪 拌 。 .析 出 含 DNA的 粘 稠 物 ： .濾 取 含 DNA的 粘 稠 物 ： . DNA粘 稠 物 的 再 溶 解 ： 在 上 述 溶 液 中 緩 緩 加 入 蒸 餾 水 ， 并 沿 一 個 方 向 輕輕 攪 拌 ， 出 現(xiàn) 絲 狀 物 ； 當(dāng) 絲 狀 物 不 在 增 加 時 ， 停 止 加水 （ 此 時 NaCl溶 液 的 濃 度 相 當(dāng) 于 0.14mol/L） 。 用 多 層 紗 布 過 濾 ， 含 DNA的 粘 稠 物 留 在 紗 布 上 。 20mL 2mol/L的 NaCl溶 液步 驟 含 DNA的 粘 稠 物 在 20mL燒 杯 中 輕 緩 攪 拌3min， 使 盡 可 能 多 的DNA溶 解 在 NaCl溶 液 。 .過 濾 含 有 DNA的 NaCl溶 液 ： 用 放 有 兩 層 紗 布 的 漏 斗 過 濾 步 驟 所 得 的 溶 液 ，濾 液 中 含 有 DNA。 .提 取 含 有 雜 質(zhì) 較 少 的 DNA： 步 驟 所 得 的 濾 液 體 積 分 數(shù) 為 95%的 冷 卻 酒 精50mL， 用 玻 棒 沿 一 個 方 向 輕 緩 攪 拌 ， 溶 液 中 （ 析 出 ）出 現(xiàn) 乳 白 色 絲 狀 物 ， 用 玻 棒 將 絲 狀 物 卷 起 ， 并 用 濾 紙吸 取 上 面 的 水 分 。3.DNA的 鑒 定 ： 加 入 二 苯 胺 試 劑 4mL， 用 玻 棒 攪 拌 使 DNA溶 解 ，沸 水 浴 5min， 觀 察 溶 液 是 否 出 現(xiàn) 藍(lán) 色 。1.共 有 “ 三 次 過 濾 ， 兩 次 析 出 ， 七 次 攪 拌 ”2.加 入 “ 兩 次 蒸 餾 水 ， 三 次 NaCl溶 液 ， 一 次 酒 精 ”三 、 實 驗 小 結(jié) 練 習(xí)1、 請 解 釋 提 取 DNA的 實 驗 操 作 中 主 要 的 步 驟 的 目 的 。 答 ： 提 取 DNA的 第 一 步 是 材 料 的 選 取 ， 其 目 的是 一 定 要 選 取 DNA含 量 較 高 的 生 物 材 料 ， 否 則 會由 于 實 驗 過 程 中 或 多 或 少 的 損 失 而 造 成 檢 測 的 困 難 ；第 二 步 是 DNA的 釋 放 和 溶 解 ， 這 一 步 是 實 驗 成 功與 否 的 關(guān) 鍵 ， 要 盡 可 能 使 細(xì) 胞 內(nèi) 的 DNA全 部 溶 解 ；第 三 步 是 DNA的 純 化 ， 即 根 據(jù) DNA的 溶 解 特 性 、對 酶 及 高 溫 的 耐 受 性 的 不 同 等 特 性 ， 最 大 限 度 地 將DNA與 雜 質(zhì) 分 開 ； 最 后 一 步 是 對 DNA進(jìn) 行 鑒 定 ，這 是 對 整 個 實 驗 的 結(jié) 果 的 檢 測 。 2、 你 認(rèn) 為 從 細(xì) 胞 中 提 取 某 種 特 定 的 蛋 白 質(zhì)與 提 取 DNA一 樣 容 易 嗎 ？答 ： 提 取 蛋 白 質(zhì) 比 提 取 DNA的 難 度 大 。 這是 因 為 ， 與 DNA相 比 ， 蛋 白 質(zhì) 對 溫 度 、 鹽濃 度 、 pH 等 條 件 要 敏 感 得 多 ， 很 容 易 失 活 ；并 且 蛋 白 質(zhì) 的 空 間 結(jié) 構(gòu) 多 種 多 樣 ， 理 化 性質(zhì) 各 不 相 同 ， 使 得 蛋 白 質(zhì) 的 提 取 沒 有 一 種統(tǒng) 一 的 方 法 ， 只 能 根 據(jù) 特 定 蛋 白 質(zhì) 的 特 性摸 索 提 取 的 條 件 ， 設(shè) 計 特 定 的 方 法 。 2.實 驗 中 NaCl的 物 質(zhì) 的 量 濃 度 為 2 mol L和0.14 mol L對 DNA有 何 影 響 ?1.在 DNA的 粗 提 取 實 驗 過 程 中 ， 兩 次 向 燒 杯中 加 入 蒸 餾 水 的 作 用 是 ( )。A.稀 釋 血 液 、 沖 洗 樣 品B.使 血 細(xì) 胞 破 裂 、 降 低 NaCl濃 度 使 DNA析 出C.使 血 細(xì) 胞 破 裂 、 增 大 DNA溶 解 量 D.使 血 細(xì) 胞 破 裂 、 提 取 含 雜 質(zhì) 較 少 的 DNAB答 ： 前 者 是 溶 解 DNA， 后 者 是 使 DNA析 出 3.DNA遇 二 苯 胺 (沸 水 浴 )會 染 成 ( ) A.磚 紅 色 B.橘 黃 色 C.紫 色 D.藍(lán) 色4.提 取 雞 血 中 的 DNA時 ， 為 什 么 要 除 去 血 液中 的 上 清 液 ?答 ： DNA的 提 取 ， 關(guān) 鍵 是 對 雜 質(zhì) 的 去 除 ， 由 于上 清 液 是 血 液 中 的 血 漿 部 分 ， 不 含 DNA， 所 以要 除 去 上 清 液 (含 有 蛋 白 質(zhì) )。 D