結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室檢測方法

單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,*,結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室檢測方法,分枝桿菌屬,一類細(xì)長略帶彎曲，有時(shí)呈分枝狀的桿菌，本屬細(xì)菌多具有抗酸性，又稱抗酸桿菌（,acid-fast bacillus,），細(xì)菌體內(nèi)含有分枝菌酸，細(xì)胞壁含有大量脂類，這與分枝桿菌的染色性、抵抗力和致病性等密切相關(guān)。,本屬細(xì)菌已經(jīng)被鑒定的有,70,多種，可分為三大類：,結(jié)核分枝桿菌、非典型分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌,；,按生長速度可分為三類，即緩慢生長菌、迅速生長菌和不能培養(yǎng)菌三種類型,結(jié)核分枝桿菌群,結(jié)核分枝桿菌，是人和動物結(jié)核病的病原體，包括人結(jié)核分枝桿菌（,Mycobacterium tuberculosis,）、牛分支桿菌（,M.bovis,）、非洲分支桿菌（,M.africanum,）和田鼠分枝桿菌（,M.microti,），前三種對人類治病，其中人型結(jié)核分枝桿菌感染發(fā)病率最高。,結(jié)核分枝桿菌屬于緩慢生長分支桿菌,非典型分枝桿菌,偶發(fā)分枝桿菌、龜分枝桿菌龜,/,膿腫、胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌、戈登分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、偶然分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、土分枝桿菌、草分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌、海,-,潰瘍分枝桿菌、金色分枝桿菌、蘇爾加分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌等,偶發(fā)分枝桿菌、龜分枝桿菌龜亞種、龜分枝桿菌膿腫亞種屬于迅速生長型，雞蛋培養(yǎng)基上,3-5,天可見菌落,其他非典型分枝桿菌多為緩慢生長型,麻風(fēng)分枝桿菌,麻風(fēng)分枝桿菌（,M.leprae,）是麻風(fēng)病的病原體，也是抗酸桿菌，但較結(jié)核分枝桿菌,短而粗，兩端尖細(xì),，抗酸染色著色均勻，呈,束狀或團(tuán)狀,排列，結(jié)核分枝桿菌多散在，偶有聚集。為典型的胞內(nèi)寄生菌，有麻風(fēng)桿菌存在的細(xì)胞胞漿呈泡沫狀，稱麻風(fēng)細(xì)胞。,體外不能培養(yǎng)。,全球約有,1/3,的人口已經(jīng)感染結(jié)核分枝桿菌，有,2000,萬活動性肺結(jié)核患者，每年新發(fā)病例,900,萬人，每秒鐘有,1,人感染結(jié)核，每年有,300,萬人死于結(jié)核病。,隨著抗結(jié)核藥物的不斷發(fā)展和衛(wèi)生生活狀況的改善，結(jié)核的發(fā)病率和死亡率曾一度大幅下降,20,世紀(jì),80,年代后，由于艾滋病和結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株的出現(xiàn)、免疫抑制劑的應(yīng)用、吸毒、貧困及人口流動等因素，全球范圍內(nèi)結(jié)核病的疫情驟然惡化,結(jié)核分枝桿菌,6,生物學(xué)形狀,結(jié)核分枝桿菌為,細(xì)長略帶彎曲的桿菌,，有時(shí)可見,分枝狀，無芽孢和鞭毛，因衰老或抗結(jié)核藥物的,作用可出現(xiàn)多形態(tài)，如球狀、串珠狀或絲狀，,大小為,1,4X0.4m,。,細(xì)胞壁中含有大量脂質(zhì)而不易著色，特別是有,大量分枝菌酸包圍在肽聚糖層的外面，一般,用抗酸染色。,萋尼染色呈紅色,，背景為藍(lán)色,；,熒光染料金胺“,O”,染色，熒光顯微鏡下為橘黃色,培養(yǎng)特性,8,實(shí)驗(yàn)室檢測方法,萋尼染色,+,熒光染色,羅氏培養(yǎng),+,分枝桿菌快速培養(yǎng),抗原抗體檢測,細(xì)胞因子檢測,熒光定量,PCR,芯片雜交,病原學(xué),免疫學(xué),分子生物學(xué),涂片鏡檢,-,抗酸染色,抗酸染色是目前為止最快的結(jié)核檢出方法，可用來檢測病情進(jìn)展，為感染控制提供參考依據(jù)，可確證培養(yǎng)物為陽性,萋尼染色法,紅色,普通顯微鏡（高倍）,熒光染色,黃或橘色,熒光顯微鏡（低倍）,聯(lián)染法：敏感性高，特異性好，速度快！,抗酸染色局限性,抗酸染色對分枝桿菌非特異，其他如,Nocardia,（奴卡）、,Rhodococcus,（紅球菌屬）、,Legionella micdadei,（軍團(tuán)菌）、,cryptosporidium,（隱孢子蟲）、,Isospora,（等孢球蟲）等有抗酸菌特點(diǎn),不能區(qū)分結(jié)核和非結(jié)核分枝桿菌,不能區(qū)分活菌和死菌,敏感性差，一般,1mL,痰中有,5000-10000,條菌時(shí)可檢出，而培養(yǎng)可檢出,>10-100,條菌,.,發(fā)光二極管熒光顯微鏡（,LED,）,熒光顯微鏡成本高、易損壞、耗電量大、光源壽命短、顯微鏡價(jià)格昂貴且需要在暗室內(nèi)工作等，熒光染色法一直沒有在結(jié)核病痰涂片診斷中得到廣泛的應(yīng)用。,只需將二極管替換普通光學(xué)顯微鏡的目鏡就相當(dāng)于一臺熒光顯微鏡，組裝的“熒光顯微鏡”結(jié)合金胺,O,染色在結(jié)核病痰涂片檢查中有一定的應(yīng)用價(jià)值。,田斌等，發(fā)光二極管熒光顯微鏡在基層實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)核分枝桿菌的應(yīng)用評價(jià),.,實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué),2012,年,10,月第,19,卷第,10,期,.,分枝桿菌培養(yǎng)技術(shù),結(jié)核菌培養(yǎng)仍是目前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)尤其是藥敏試驗(yàn)結(jié)果在指導(dǎo)臨床用藥及耐藥性檢測等方面具有重要作用,是鑒定是否為活菌的可靠方法,1,、傳統(tǒng)的固態(tài)培養(yǎng)法,需要,4,6,周才能檢測到結(jié)核菌的生長而且陽性率也只有,30,-40,；特異性差各種分枝桿菌均可生長。要確定是否為結(jié)核菌需結(jié)合分枝桿菌菌種鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)。,2,、,分枝桿菌快速液體培養(yǎng)技術(shù),BD,公司推出的,BACTECMGIT 960,全自動分枝桿菌培養(yǎng)，鑒定藥敏系統(tǒng)，操作簡便，陽性標(biāo)本檢出時(shí)間平均為,9d,：鑒定、藥敏試驗(yàn)時(shí)間平均為,4d,：陽性標(biāo)本檢出率比傳統(tǒng)固體培養(yǎng)提高,10,左右,固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)優(yōu)缺點(diǎn),固體培養(yǎng)：污染少，易于進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，但是培養(yǎng)時(shí)間長,液體培養(yǎng)：菌體與培養(yǎng)基充分接觸，生長迅速，但易受到污染,血清學(xué)試驗(yàn),免疫學(xué)檢測方法,1,、結(jié)核菌素試驗(yàn),凡感染過結(jié)核桿菌的機(jī)體，會產(chǎn)生相應(yīng)的致敏淋巴細(xì)胞，具有對結(jié)核桿菌的識別能力，當(dāng)再次遇到通過皮膚注入的少量的結(jié)核菌素時(shí)，致敏 淋巴細(xì)胞受相同抗原再次刺激會在,48-72,小時(shí)內(nèi)，產(chǎn)生局部炎癥反應(yīng)，出現(xiàn)紅腫硬節(jié)即為陽性反應(yīng)。,對活動性結(jié)核的診斷靈敏度高達(dá),77,，,局限性：,假陰性：,小兒結(jié)核、老年人結(jié)核、免疫缺陷或免疫功能低下患者（如合并,HIV,感染、接受免疫抑制劑治療的患者,),假陽性：,接種過卡介苗的人也會產(chǎn)生陽性反應(yīng),干擾素釋放試驗(yàn),被認(rèn)為是近十年來結(jié)核診斷史上取得的最重要成就，該檢測方法的原理是：結(jié)核感染后體內(nèi)長期存在抗原特異性的記憶性 細(xì)胞，當(dāng)再次遇到抗原刺激時(shí)，能迅速活化增值，釋放,干擾素。,目前市售兩種，,QFT-G,和,T-SPOT.TB,，比較兩種方法，,T-SPOT.TB,更靈敏但,QFT-G,更特異，但均優(yōu)于結(jié)核菌素試驗(yàn)，同時(shí)也被推薦用于潛伏結(jié)核診斷。,分子生物學(xué)檢測方法,近年來核酸擴(kuò)增技術(shù)和雜交分析技術(shù)的發(fā)展，為分枝桿菌的檢測、鑒定和藥敏實(shí)驗(yàn)提供了極大的方便，可將診斷時(shí)間從幾周降低到幾天。研究、應(yīng)用報(bào)道較多的結(jié)核病基因診斷技術(shù)主要包括聚合酶鏈反應(yīng),(PCR),、核酸探針雜交、,DNA,序列測定、基因芯片、基因分型等。,MDR,早期診斷,分枝桿菌分子診斷系統(tǒng)（協(xié)和醫(yī)院）,菌種鑒定,篩查、鑒別診斷,實(shí)時(shí)熒光,PCR,基因芯片快速檢測平臺,高 效： 一個(gè)樣本可,同時(shí),檢測結(jié)核分枝桿菌和,NTM,快 速：,4,周（菌培）,3,小時(shí),靈 敏：,10,個(gè)菌,/,反應(yīng)（,TB,）；,10,2,個(gè)菌,/,反應(yīng)（,NTM,）,22,分枝桿菌核酸檢測,功能：,TB,快速篩查；,TB/NTM,鑒別診斷,高 效,：,同時(shí)檢測,17,種分枝桿菌（包括,TB,）,快 速：,4,周（菌種鑒定）,6,小時(shí),靈 敏：,10,3,個(gè)菌,/,反應(yīng),檢測范圍,：結(jié)核、胞內(nèi)、鳥、戈登、堪薩斯、偶然、瘰疬、淺黃、土、龜,-,膿腫、草、不產(chǎn)色、海,-,潰瘍、金色、蘇爾加、蟾蜍、恥垢。,23,分枝桿菌菌種鑒定（,DNA,微陣列芯片法）,通 量：,兩個(gè)一線抗結(jié)核藥（,MDR,）,速 度,：,8,周（藥敏）,6,小時(shí),靈敏度：,10,3,個(gè)菌,/,反應(yīng),基于,rpoB,（利福平）和,katG/inhA,（異煙肼）,的基因突變，對,耐多藥結(jié)核病,做出快速診斷。,24,結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒,高會霞等，五種結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢測方法對結(jié)核病診斷價(jià)值的效果評價(jià),.,實(shí)用檢驗(yàn)醫(yī)師雜志，,2012,，,4,（,3,）：,157-160.,五種結(jié)核檢測方法效果評價(jià),結(jié)核組：,1260,例,非結(jié)核組：,100,例,改良羅氏培養(yǎng),熒光,PCR,涂片法,MGIT 960,快速培養(yǎng),結(jié)果比較,斑點(diǎn)層析法,敏感性、特異性比較,羅氏培養(yǎng)和快速培養(yǎng),快速培養(yǎng)和熒光PCR,總結(jié)：,涂片簡單快速但陽性率較低、難以區(qū)分結(jié)核和非結(jié)核分枝桿菌,培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，但需時(shí)較長,血清學(xué)試驗(yàn)檢測結(jié)核抗原或抗體不太理想,干擾素釋放試驗(yàn)?zāi)茌^好地為臨床服務(wù),熒光,PCR,檢測結(jié)核分枝桿菌具有較好的敏感性和特異性，可結(jié)合傳統(tǒng)方法綜合分析,Thank You!,