醋酸纖維薄膜電泳實驗總結(jié)

單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,*,血 清 蛋 白 的 醋 酸 纖 維 薄 膜 電 泳,生 物 化 學 實 驗,一、實驗目的,學習醋酸纖維薄膜電泳的操作，了解電泳技術(shù)的一般原理,二、實驗原理,電泳是指帶電質(zhì)點在電場中向本身所帶電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。在一定,pH,條件下，不同的質(zhì)點由于具有不同的等電點而帶不同性質(zhì)的電荷，因而在一定的電場中它們的移動方向和移動速度也不同，即它們的電泳遷移率不同，因此，可使它們分離,影響電泳遷移率的外界因素：電場強度、溶液的,pH,值、溶液的離子強度和電滲現(xiàn)象,影響電泳遷移率的內(nèi)在因素：質(zhì)點所帶凈電荷的量、質(zhì)點的大小和形狀,采用醋酸纖維薄膜作為支持物的電泳方法稱為醋酸纖維素薄膜電泳。醋酸纖維素薄膜電泳具有微量、快速、簡便、分辨力高，對樣品無拖尾和吸附現(xiàn)象等優(yōu)點,醋酸纖維素是纖維素的羥基乙?；纬傻睦w維素醋酸酯，將它溶于有機溶劑（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均勻的薄膜則成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀的結(jié)構(gòu)，厚度約為120,m,，有很強的通透性，對分子移動阻力很小,三、實驗儀器,1、DYY-8C型常壓電泳儀：北京六一儀器廠生產(chǎn)，1套/2組,2.醋酸纖維薄膜（2 cm8cm）：2片/人。,3.培養(yǎng)皿：一排桌子（即4組）公用5套，包括平衡、染色各用一套，漂洗用3套。,4.點樣器：一個/組。,5.濾紙：公用。,6.玻璃板：一塊/組。,7.鑷子：一個/組。,8.玻棒：公用。,四、實驗試劑,1巴比妥緩沖液（pH8.6，離子強度0.07）：巴比妥2.76g，巴比妥鈉15.45g，用蒸餾水定容至1000mL。,2染色液：氨基黑10B 0.25g，用甲醇50mL、冰醋酸10mL、水40mL溶解（可重復使用）。,3漂洗液：甲醇或乙醇45mL，冰醋酸5mL，水50mL，混勻。,4.人或動物血清：從醫(yī)院或自制，冰凍保存，現(xiàn)取現(xiàn)用,五、實驗過程,浸泡：將,28 cm,醋酸纖維薄膜迎著光辨別光澤面和無光澤面。將粗糙面朝上置于盛有緩沖液的平皿中，浸泡20,min,方可用于點樣,點樣：用鑷子取出浸透的薄膜，夾在兩層粗濾紙內(nèi)吸干多余的緩沖液，然后平鋪在玻璃板上（無光澤面朝上）。在另一載玻片上滴一滴血清，點樣器（用蓋玻片的一邊）在血清上蘸一下（可來回移動一次），再將點樣器輕印在加樣線上，使血清滲透到薄膜內(nèi)，形成均勻的直線,五、實驗過程,電泳槽的準備：根據(jù)電泳槽膜支架的寬度，裁剪尺寸合適的濾紙條。在兩個電極槽中，各倒入等體積的電泳緩沖液，在電泳槽的兩個膜支架，各放兩層濾紙條，使濾紙一端的長邊與支架前沿對齊，另一端浸入電泳緩沖液中。當濾紙全部潤濕后，用玻璃棒輕輕擠壓在膜支架上的濾紙以驅(qū)趕氣泡，使濾紙的一端能緊貼在膜支架上，即為濾紙橋,五、實驗過程,電泳：將點樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上（點樣面朝下），另一端平貼在陽極端支架上。蓋上電泳槽蓋，使薄膜平衡,10 min,。通電，調(diào)節(jié)電壓至,160 V,，電流強度為,0.4,0.6,mA,/cm,膜寬度，電泳時間約,25 min,染色：電泳完畢后將薄膜取下,放在含氨基黑,10B,染色液的培養(yǎng)皿中浸泡,5 min,漂洗：將薄膜從染色液中取出后移置漂洗液中漂洗數(shù)次，直至背景藍色脫盡，條帶清晰為止，可得到色帶清晰的電泳圖譜,六、注意事項,保持薄膜清潔，務必戴上塑料手套，勿用手指接觸薄膜表面，以免油污或污物沾上，影響電泳結(jié)果。,注意醋酸纖維膜的質(zhì)量，至少浸泡10分鐘，浸泡很久仍有大塊白色硬點者須棄之不用。,加樣時一定要呈直線、垂直、分布均勻，這樣泳動的區(qū)帶整齊、不歪。以免影響蛋白質(zhì)區(qū)帶圖譜的完美。,電泳槽兩邊的緩沖液應保持液面在同一水平面上，槽里的緩沖液要保持清潔。,電泳電壓大小，時間長短與緩沖液的離子強度都有一定的關(guān)系。一般電流約0.40.6mA/cm,電壓110160V，通電時間4060min。電壓高，電流大，電泳速度加快，時間可縮短，但薄膜上蒸發(fā)嚴重，因此不能無限增大電流。,使用比色皿時要潤洗。,染色的同時也是蛋白質(zhì)的固定，所以，不要將很多蛋白條重疊在一起。,注意薄膜正負極不要搭反，注意簿膜的正反不要放反。放的時候注意血樣不要與濾紙接觸了。,通電完畢時，必須切斷電源，以防觸電事故。,七、實驗結(jié)果,從左至右分別為血清蛋白、,1,-,球蛋白,、,2,-,球蛋白,、,-,球蛋白,、,-,球蛋白,、點樣處,04,06,07,09,八、失敗圖譜分析,拖尾狀,：,點樣量過多，被分離的血清蛋白不能分離成5條區(qū)帶或產(chǎn)生拖尾。,有斑點,：,點樣不均勻，不整齊，導致被分離的區(qū)帶出現(xiàn)斑點。,邊流現(xiàn)象,：,點樣板蘸取血清一邊多一邊少，導致區(qū)帶分離不清，出現(xiàn)邊流現(xiàn)象。,區(qū)帶模糊,：,薄膜過濕，樣品擴散迅速，導致樣品分離不成區(qū)帶。,鋸齒狀,：,薄膜用濾紙吸水過度（薄膜上出現(xiàn)白斑）或點樣過慢，又未及時大橋，導致薄膜過于干燥，使區(qū)帶成鋸齒狀。,區(qū)帶傾斜,：,薄膜搭載濾紙上的位置歪斜，彎曲，與電流方向不平行，或點樣一邊多一邊少，區(qū)帶容易泳斜。,顯色過淺,：,點樣太少，區(qū)帶顯色不明顯。,區(qū)帶重疊,：,染色時，醋酸纖維薄膜不是一張一張放入染色液的，在染色固定前，薄膜與薄膜之間重疊，造成薄膜上還未固定的血清蛋白彼此粘連。,區(qū)帶過密,：,電泳時電壓，電流或電泳過小或時間不夠，造成區(qū)帶未分離。,實驗結(jié)果既有清晰的圖譜，也有模糊不清的圖譜,九、實驗思考,1、為什么要將點樣一端放在電泳槽的負極？,答：帶電質(zhì)點在電場中向本身所帶電荷相反的電極移動。因為血清樣品帶負電荷，在電場中將向正極泳動，所以點樣端要置于負極。,2、電泳時電壓表顯示的電壓是否等于加在膜條兩端的實際電壓，為什么？,答：不相等。因為在實際中緩沖液兩邊離子不平衡。,九、實驗思考,3、根據(jù)人血清中蛋白各組分的等電點，估計它們在pH8.6的巴比妥電極緩沖液中電泳移動的相對位置。,答：,巴比妥電極緩沖液的pH為8.6，蛋白的等電點均低于它，因此蛋白帶負電荷，向正極移動。速度為血清蛋白1-,球蛋白,2,-,球蛋白,-,球蛋白,-,球蛋白,。因此，在電泳圖譜上位置由左向右依次為血清蛋白、,1,-,球蛋白,、,2,-,球蛋白,、,-,球蛋白,、,-,球蛋白,。,