【基金標(biāo)書】2010CB945400-干細(xì)胞向生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化的調(diào)控機(jī)理及應(yīng)用性研究

項(xiàng)目名稱： 干細(xì)胞向生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化的調(diào)控機(jī)理及應(yīng)用性研究首席科學(xué)家： 松陽洲 中山大學(xué)起止年限： 2010年 1月-2014 年 8月依托部門： 教育部一、研究?jī)?nèi)容本項(xiàng)目將以胚胎干細(xì)胞及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS）為技術(shù)平臺(tái)，研究哺乳動(dòng)物干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化以及生殖細(xì)胞減數(shù)分裂的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和機(jī)理，并建立研究生殖細(xì)胞分化所需的生物技術(shù)平臺(tái)及多種細(xì)胞及小鼠模型，從而提高干細(xì)胞向生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化的效率，為大型 經(jīng)濟(jì)動(dòng)物優(yōu)質(zhì)培育奠定基礎(chǔ)。（1）利用蛋白質(zhì)組學(xué)，BiFC 組學(xué), 信息學(xué)研究平臺(tái)，建立以 PGC 關(guān)鍵調(diào)控元為中心的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，篩選控制 PGC 基因表達(dá)的關(guān)鍵因子，并 闡述端粒蛋白以及端粒酶在干細(xì)胞向 PGC 誘導(dǎo)分化過程中的作用機(jī)理。同時(shí)利用表觀遺傳學(xué)研究技術(shù)，分析 PGC 誘導(dǎo)過程中組蛋白修飾的動(dòng)態(tài)過程和不同修飾與 PGC 發(fā)育之間的相互關(guān)系。探討以上關(guān)鍵信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、關(guān) 鍵因子在誘導(dǎo)牛干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化過程中的調(diào)控機(jī)理。 (2) 利用基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)，系 統(tǒng)地分析精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的特異性差異。闡明雄性生殖細(xì)胞中誘導(dǎo)減數(shù)分裂的分子機(jī)制，建立干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化雄性生殖細(xì)胞的理論體系，并分析體外生成生殖細(xì)胞的生物學(xué)功能。(3)以人及小鼠胚胎干細(xì)胞體外分化系統(tǒng)為模型，優(yōu)化 PGC 特化的條件，并通過轉(zhuǎn)基因及基因敲除的方法，探索關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子及信號(hào)網(wǎng)絡(luò)在 PGC 形成過程中的功能及調(diào)控機(jī)理。(4)建立較為完善的牛 ES 細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，探討牛干細(xì)胞自我更新和分化途徑。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)、選擇合適的生長(zhǎng)因子、 轉(zhuǎn)錄因子和培養(yǎng)體系誘導(dǎo)牛 ES 細(xì)胞分化為雄性生殖細(xì)胞，并建立相應(yīng)的技術(shù)平臺(tái)。二、預(yù)期目標(biāo)總體目標(biāo)本項(xiàng)目以研究誘導(dǎo)分化技術(shù)、蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、減數(shù)分裂機(jī)理及農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物培育為主線，緊密圍繞以上 3 個(gè)擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題。在建立的多種技術(shù)平臺(tái)的基礎(chǔ)上， 確立以 PGC 關(guān)鍵調(diào)控元為中心的信號(hào)調(diào) 控網(wǎng)絡(luò)， 篩選控制 PGC 基因表達(dá)的關(guān)鍵因子。系統(tǒng)地分析精原干細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞之間特異性差異，闡明雄性生殖細(xì)胞中誘導(dǎo)減數(shù)分裂的分子機(jī)制。同時(shí)，建立體外誘導(dǎo)培養(yǎng)功能性生殖細(xì)胞的技術(shù)體系，以小鼠為主要研究對(duì)象， 嘗試應(yīng)用干 細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的生殖細(xì)胞來培育優(yōu)化動(dòng)物，最終確立我國(guó)在這一極富競(jìng)爭(zhēng)性的前沿探索領(lǐng)域的領(lǐng)先地位。五年預(yù)期目標(biāo)1，發(fā)展基于干細(xì)胞學(xué)和生殖細(xì)胞學(xué)研究的一整套方法和綜合技術(shù)平臺(tái)。2，建立以 PGC 關(guān)鍵調(diào)控元為中心的較為完整的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)， 篩選出控制 PGC基因表達(dá)的幾個(gè)關(guān)鍵因子。3，明確端粒蛋白以及端粒酶在干細(xì)胞向 PGC 誘導(dǎo)過程中的作用機(jī)理，并揭示 組蛋白修飾的動(dòng)態(tài)過程和不同修飾與 PGC 發(fā)育之間的相互關(guān)系。4，明確精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞之間的基因表達(dá)差異，確定 3-6 個(gè)差異表達(dá)基因。5，闡明雄性生殖細(xì)胞中誘導(dǎo)減數(shù)分裂的分子機(jī)制。6，建立一整套誘導(dǎo) PGC 生成的培養(yǎng)體系。7，建立 1-3 個(gè)體外培養(yǎng)生長(zhǎng)狀況良好、表達(dá)干 細(xì)胞 標(biāo)記的牛 ES 細(xì)胞系，初步 闡明牛干細(xì)胞自我更新和分化的可能途徑。8，力爭(zhēng)建立牛 ES 細(xì)胞體外 誘導(dǎo)分化形成功能性配子（精子、卵子）的技 術(shù)體系。9，在國(guó)際重要學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表高水平論文 40 篇以上。其中影響因子大于 10 的論文 8 篇以上。10，培養(yǎng)一批從事干細(xì)胞研究的交叉學(xué)科人才。11，主辦一次生殖細(xì)胞學(xué)研究的國(guó)際性學(xué)術(shù)研討會(huì)。12，申請(qǐng)發(fā)明專利 10 項(xiàng)以上。三、研究方案1，總體思路干細(xì)胞具有自我更新、高度增殖和多向分化的潛能。 干細(xì)胞的功能則是通過細(xì)胞內(nèi)外因子對(duì)蛋白質(zhì)組和基因組的動(dòng)態(tài)調(diào)控來實(shí)現(xiàn)的。 因此探討干細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境、蛋白質(zhì)間 相互作用、 組蛋白修飾與基因表達(dá)之間的相互關(guān)系，并依此建立干細(xì)胞向生殖 細(xì)胞分化的調(diào)控蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)和定向誘導(dǎo)技術(shù)體系將是本項(xiàng)目的重要研究方向。2，技術(shù)途徑根據(jù)以上的學(xué)術(shù)思路，本項(xiàng)目的總體研究技術(shù)途徑如圖2所示。具體地，本項(xiàng)目將首先建立能夠系統(tǒng)挖掘生殖細(xì)胞靶蛋白及其體外誘導(dǎo)分化的技術(shù)手段與平臺(tái)，包括：蛋白質(zhì)組 學(xué)平臺(tái)、蛋白 質(zhì)BiFC 表達(dá) 庫和RNAi 庫、生物信息學(xué)技術(shù)平臺(tái)和動(dòng)物模型技術(shù)平臺(tái)。通過這些平臺(tái)，系 統(tǒng) 地發(fā)現(xiàn)與生殖細(xì)胞分化相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)一步利用現(xiàn)代分子生物學(xué)、 細(xì) 胞培養(yǎng)等技術(shù)確定一些蛋白質(zhì)的靶蛋白網(wǎng)絡(luò)和功能以及調(diào)控機(jī)理。在這些基礎(chǔ)研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步以小鼠和農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物為研究對(duì)象，應(yīng)用干細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的生殖細(xì)胞來培育優(yōu)化動(dòng)物。 3，可行性分析本項(xiàng)目的總體方案是切實(shí)可行的。首先，本 項(xiàng)目提出的主要科學(xué)問題和研究目標(biāo)不僅具有理論和實(shí)際依據(jù)，而且都是該領(lǐng)域前沿性和關(guān)鍵性的問題。我們?cè)诟杉?xì)胞學(xué)、胚胎發(fā)育學(xué)、生殖學(xué)等領(lǐng)域進(jìn)行了多年的研究，取得了一些重要的成果，具備 完成本項(xiàng)目的堅(jiān)實(shí) 基礎(chǔ)。研究方案建立在申請(qǐng)者以及項(xiàng)目組成員大量的相關(guān)研究工作的基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合理周密。研究 課題 所用的方法和材料都是本項(xiàng)目組成員多年應(yīng)用、被證 明是行之有效的方法；而且，我們的課題組成員積累了大量的關(guān)鍵性研究材料，如各種ES 細(xì)胞系，iPS細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因鼠，牛等，可為本項(xiàng)目的實(shí)施提供強(qiáng)有力的保證。其次， 項(xiàng)目承擔(dān)單位具有良好的研究條件和基礎(chǔ)，并且已經(jīng)具備了相當(dāng)?shù)囊?guī)模、取得了很好的科研成果。我們擁有完善的蛋白質(zhì)組學(xué)，BiFC，基因組學(xué)，信息學(xué)，干細(xì)胞學(xué)等研究平臺(tái)，可以完成本項(xiàng)目所涉及的研究工作。中山大學(xué)及其他參與的單位擁有大型及關(guān)鍵性儀器設(shè)備，采用公共平臺(tái)建設(shè)方式，已擁有的條件（ 動(dòng)物房和儀器設(shè)備等）、各重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室等設(shè)備均可公用，這將為本項(xiàng)目提供較全面的技術(shù)條件。本 項(xiàng)目注重各研究課題之間的配合、確保信息共享，發(fā)揮專業(yè)交叉、知識(shí)互補(bǔ)、團(tuán)結(jié)協(xié)作的精神，確保本項(xiàng)目圓滿、順利完成。其三，承擔(dān)本項(xiàng)目研究工作的中堅(jiān)力量和學(xué)術(shù)骨干多數(shù)是新近從海外留學(xué)工作歸國(guó)的成績(jī)卓著的中青年科學(xué)家，擁有豐富的研究成果和研究經(jīng)驗(yàn)，多次在國(guó)際著名專業(yè)雜志上發(fā)表論文。這些都是確保研究項(xiàng)目順利實(shí)施和取得重大成果的最基本、最關(guān)鍵的因素。本項(xiàng)目課題組成員熟悉當(dāng)前的研究狀況和方法，對(duì)本項(xiàng)目的研究具有較強(qiáng)的掌控能力和應(yīng)變能力，能夠保證項(xiàng)目的順利完成。4，創(chuàng)新點(diǎn)本項(xiàng)目探討影響國(guó)計(jì)民生的的重大科學(xué)問題。項(xiàng)目中的四個(gè)子課題既相互獨(dú)立，又交叉互補(bǔ)。這些課題既是有關(guān)研究人員各自多年工作的合理延伸和拓展，又集中了優(yōu)勢(shì)力量，對(duì)誘導(dǎo) 干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化中的核心問題進(jìn)行多側(cè)面的合作研究。本題目的創(chuàng)新性主要體現(xiàn)在：(1)本項(xiàng)目探討 的問題是國(guó)際前沿的科學(xué)問題，因此保證了項(xiàng)目的創(chuàng)新性。本項(xiàng)目的選題涉及干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化過程中重要蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；雄性生殖細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的基因表達(dá)及調(diào)控機(jī)理；胚胎干細(xì)胞向原始生殖細(xì)胞分化的體系及機(jī)理；干細(xì)胞向生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化技術(shù)在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物培育上的應(yīng)用等科學(xué)問題。將基礎(chǔ)科學(xué)與實(shí)際應(yīng)用相結(jié)合，力爭(zhēng)在解答基礎(chǔ)科學(xué)問題的同時(shí)，發(fā)展新的動(dòng)物繁殖技能。(2)本項(xiàng)目在充分利用 課題組已建立的蛋白質(zhì)組學(xué)研究平臺(tái)，BiFC研究平臺(tái)（松陽洲教授研究團(tuán)隊(duì)獨(dú)創(chuàng)），信息學(xué)研究平臺(tái)和基因組學(xué)研究平臺(tái)的基礎(chǔ)上，發(fā)展和創(chuàng)建綜合技術(shù)平臺(tái)及多種細(xì)胞和動(dòng)物模型，分析從干細(xì)胞誘導(dǎo)生成生殖細(xì)胞過程中的蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和基因調(diào)控機(jī)理，填補(bǔ)生殖細(xì)胞發(fā)育機(jī)理和干細(xì)胞分化機(jī)制研究領(lǐng)域的空白，為干細(xì)胞的再生醫(yī)學(xué)及畜牧產(chǎn)業(yè)的應(yīng)用提供新的途徑。(3)本項(xiàng)目著眼于 技術(shù)創(chuàng)新, 通過建立誘導(dǎo)干細(xì)胞生成生殖細(xì)胞的技術(shù)體系，獲得功能性生殖細(xì)胞，為大型經(jīng)濟(jì)動(dòng)物優(yōu)良種群的培育提供技術(shù)支持。同時(shí)，通 過建立大型經(jīng)濟(jì)動(dòng)物胚胎干細(xì)胞，研究在體外特定條件下的分化潛能，嘗試培育生長(zhǎng)性能好、環(huán)境友好型、品質(zhì)優(yōu)良的新品種。 這些可為 人類提供高品質(zhì)食源，具有非常明顯的創(chuàng)新性。通過這些嘗試，可能開辟家畜育種和保種的新途徑、新方法，也可以促進(jìn)干細(xì)胞在人類醫(yī)療事業(yè)上的早日應(yīng)用。5，組織方式(1)在組織方面，以總體研究方案為中心，強(qiáng)調(diào)團(tuán)隊(duì)化、體系化。瞄準(zhǔn) 戰(zhàn)略目標(biāo)，統(tǒng)一思路，力求持續(xù)發(fā)展。項(xiàng)目規(guī)劃管理和運(yùn)作體制包括總項(xiàng)目和子課題兩個(gè)層次。項(xiàng)目設(shè)負(fù)責(zé)人 1 名（首席科學(xué)家），負(fù)責(zé)整個(gè)項(xiàng)目的 貫通實(shí)施。首席科學(xué)家聘任若干學(xué)術(shù)專家組成項(xiàng)目顧問專家組，參與項(xiàng)目的領(lǐng)導(dǎo)、組織、運(yùn)行和管理， 協(xié)助項(xiàng)目負(fù)責(zé)人，調(diào)整和確定項(xiàng)目的方向及技術(shù)路線，制定有效可行的研究計(jì)劃，指 導(dǎo)協(xié)調(diào)各課題的工作，督促各課題間的交流，并 審核各子課題的進(jìn)展情況。 顧問專家由相關(guān)學(xué)科領(lǐng)域成就卓著的專家組成，承擔(dān)單位之外的專家占絕大多數(shù)。(2) 在研究方面，不只停留在單項(xiàng)技術(shù)或研究手段上，而是發(fā)展綜合技術(shù)平臺(tái)及多種細(xì)胞和動(dòng)物模型。為此，本項(xiàng)目將以系統(tǒng)性運(yùn)作方式為主。不但充分 發(fā)揮子課題各承擔(dān)單位的技術(shù)和學(xué)科優(yōu)勢(shì)，而且加強(qiáng)優(yōu)勢(shì)力量的整合和協(xié)同攻關(guān)，發(fā)揚(yáng)團(tuán)隊(duì)精神，形成科研功能配套、統(tǒng)籌合理、機(jī) 動(dòng)靈活且充 滿活力的科研體系。6，課題間的相互關(guān)系本項(xiàng)目以中山大學(xué)為主體，聯(lián)合中國(guó)科學(xué)學(xué)院， 華東師范大學(xué)及中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)等單位， 圍繞總體研究目 標(biāo)，本 項(xiàng)目設(shè)立4個(gè)課題組 ，研究 過程中相互配合、優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，提倡資源共享。本項(xiàng)目的執(zhí)行采用首席科學(xué)家 負(fù)責(zé)制。首席科學(xué)家將充分發(fā)揮課題負(fù)責(zé)人和學(xué)術(shù)帶頭人的作用，采用學(xué)科交叉、分工合作的方式來實(shí)施研究計(jì)劃。同時(shí)，首席科學(xué)家將在相關(guān)部門的領(lǐng)導(dǎo)下，根據(jù)國(guó)家規(guī)定，通過項(xiàng)目專家委員會(huì)，采用激勵(lì)和滾動(dòng)機(jī)制對(duì)項(xiàng)目進(jìn)行管理。本課題設(shè)置上緊密圍繞干細(xì)胞誘導(dǎo)生成生殖細(xì)胞這一重大科學(xué)問題，以研究誘導(dǎo)分化技術(shù)、蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、減數(shù)分裂機(jī)理以及農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物培育為主線，將各個(gè)課題有機(jī)地結(jié)合起來，使各方面的研究工作既具有明確的研究目標(biāo)，同時(shí)又相互緊密聯(lián)系，形成我國(guó)在這一前沿領(lǐng)域的研究特色。本項(xiàng)目期望在誘導(dǎo)干細(xì)胞生成生殖細(xì)胞關(guān)鍵科學(xué)問題上取得重大突破性成果，保證按期完成項(xiàng)目的總體目標(biāo)和五年目標(biāo)。課題 2. 雄性生殖細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的基因表達(dá)及調(diào)控機(jī)理研究課題 1. 干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化過程中重要蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的解析干細(xì)胞向生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化的調(diào)控機(jī)理及應(yīng)用性研究闡明干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化機(jī)理產(chǎn)生功能性配子與克隆動(dòng)物建立以PGC 關(guān)鍵調(diào)控元為中心的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)全面了解轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白修飾在PGC 形成中的功能與調(diào)控機(jī)制闡述端粒蛋白以及端粒酶在干細(xì)胞向 PGC誘導(dǎo)過程中的作用與機(jī) 理探索誘導(dǎo)分化的生殖細(xì)胞的生物學(xué)功能及其對(duì)小鼠胚胎發(fā)育的影響比較ESC和 SSC DNA甲基化模式、基因表達(dá)和細(xì)胞表面蛋白成分的差 異檢索RA 信號(hào)調(diào)控的靶基因,分析減數(shù)分裂的機(jī) 理探討在誘導(dǎo)牛干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化過程中信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)課題 3. 誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向原始生殖細(xì)胞分化的體系及機(jī)理研究?jī)?yōu)化促進(jìn) PGC形成的最佳體外培養(yǎng)條 件探討關(guān)鍵基因在小鼠PGC 特化過程中的功能及體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式創(chuàng)建表達(dá)標(biāo)志PGC 特化的報(bào)告基因體 系，探討關(guān)鍵信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控機(jī) 理課題 4. 干 細(xì) 胞向生殖 細(xì) 胞 誘導(dǎo) 分化技術(shù) 在 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動(dòng) 物培育上的 應(yīng) 用建立合適的牛ESC 體外培養(yǎng)體系利用創(chuàng)建的牛ESC 體系，探討牛干細(xì)胞自我更新和分化的途徑誘導(dǎo)牛ESC 分化為雄性生殖細(xì)胞建立以ESC 體外誘導(dǎo)分化為功能性生殖細(xì)胞的技術(shù)平臺(tái)課題1，干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化過程中重要蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的解析研究目標(biāo)：建立和完善高通量研究蛋白互動(dòng)網(wǎng)絡(luò)以及干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化的技術(shù)平臺(tái)，包括蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)，BiFC 組學(xué)平臺(tái), 基因組學(xué)平臺(tái)，生物信息學(xué)平臺(tái)。在此基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)若干新的調(diào)控干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和染色質(zhì)修飾因子，在整體細(xì)胞水平上初步確立干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。研究?jī)?nèi)容：1, 以一些 PGC 表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控元，如 Nanog, Oct4，RAR/RXR, Smad 為研究對(duì)象, 運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)及 BiFC 組學(xué)平臺(tái), 系統(tǒng)地發(fā)現(xiàn)直接與關(guān)鍵調(diào)控元相互作用的蛋白, 并依此建立以 PGC 關(guān)鍵調(diào)控元為中心的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。2, 以 Blimp1 、Stella, PITX2, c-kit、Stra-8, vasa 和 DAZL 等重要的 PGC 表達(dá)基因?yàn)槟Ｊ剑?從 PGC 或生殖母細(xì)胞調(diào)控元及與其相互作用的蛋白質(zhì)組中篩選出控制這些基因表達(dá)的關(guān)鍵因子。從表觀遺傳學(xué)著手，研究 PGC 誘導(dǎo)過程中組蛋白修飾的動(dòng)態(tài)過程和不同修飾與 PGC 或精子發(fā)育之間的相互關(guān)系，以全面了解轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白修飾（著重于組蛋白?；?、甲基化的研究）在 PGC 形成中的功能與調(diào)控機(jī)制。3, 利用四環(huán)素調(diào)節(jié)表達(dá)系統(tǒng), RNAi, ChIP 等技術(shù)闡述端粒蛋白以及端粒酶在干細(xì)胞向 PGC 誘導(dǎo)過程中的作用與機(jī)理。4, 探討在誘導(dǎo)牛干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化過程中，以上信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的適用性。課題承擔(dān)單位： 中山大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： 松陽洲 教授 （中山大學(xué)）主要學(xué)術(shù)骨干： 張 雁 教授 （中山大學(xué)）項(xiàng) 鵬 教授 （中山大學(xué)）周天壽 教授 （中山大學(xué)）張勤奮 副教授 （中山大學(xué)）王繼剛 講師 （華東師范大學(xué)）李鯤鵬 講師 （中山大學(xué)）課題經(jīng)費(fèi)比例： 占申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)的31%課題 2，雄性生殖細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的基因表達(dá)及調(diào)控機(jī)理研究研究目標(biāo)：通過對(duì)精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的表觀遺傳，基因表達(dá)和表面蛋白差異的系統(tǒng)分析，對(duì)視黃素(RA)信號(hào)通路及其在精子生成 細(xì)胞中誘導(dǎo)減數(shù)分裂功能的特異性分析，闡述精原干細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)制，為干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化雄性生殖細(xì)胞提供依據(jù)。研究?jī)?nèi)容：1，利用測(cè)序的方法（如 CpG 二核苷酸位點(diǎn)上的甲基化）， cDNA 基因芯片的篩選，蛋白質(zhì)組學(xué)和質(zhì)譜分析技術(shù)，系統(tǒng)地比較胚胎干細(xì)胞和精原干細(xì)胞 DNA 甲基化模式、基因表達(dá)和細(xì)胞表面蛋白成分的差異。2，通過生物信息學(xué)技術(shù)，利用 RAR/RXR 在 DNA 結(jié)合區(qū)域的序列保守性，檢索精子前體細(xì)胞中 RA 信號(hào)調(diào)控的靶基因。分析核受體 RAR/RXR 復(fù)合體在精原細(xì)胞中的特異性及其調(diào)節(jié)減數(shù)分裂的機(jī)理。3利用全細(xì)胞成像及分子生物學(xué)技術(shù)分析誘導(dǎo)分化的雄性生殖細(xì)胞，通過小鼠曲細(xì)精管內(nèi)細(xì)胞注射和卵細(xì)胞胞漿內(nèi)精子注射，探索體外誘導(dǎo)分化的生殖細(xì)胞的生物學(xué)功能及其對(duì)小鼠胚胎發(fā)育的影響。課題承擔(dān)單位：中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院課題負(fù)責(zé)人： 楊東山 副研究員（中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院）主要學(xué)術(shù)骨干：戚華宇 研究員 （中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院）謝 亭 教授 （中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院）徐仁和 教授 （中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院）課題經(jīng)費(fèi)比例：占申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)的23%。課題3， 誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向原始生殖細(xì)胞分化的體系及機(jī)理研究研究目標(biāo)：本課題將完善胚胎干細(xì)胞分化為 PGC 的技術(shù)體系，建立 PGC 特化過程中關(guān)鍵因子的轉(zhuǎn)基因及基因敲除的胚胎干細(xì)胞株及小鼠模型，揭示關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子及信號(hào)網(wǎng)絡(luò)在 PGC 形成過程中的功能及調(diào)控機(jī)理。研究?jī)?nèi)容1， 使用我們現(xiàn)有的 Oct4-GFP 及 Stella-GFP 胚胎干細(xì)胞株, 結(jié)合其它 PGC 特異性分子標(biāo)記，利用無血清培養(yǎng)方式, 優(yōu)化促進(jìn) PGC 形成的最佳體外條件；并以gonadal 細(xì)胞共培養(yǎng)的方式建立適合 PGC 生長(zhǎng)的微 環(huán)境。2， 利用轉(zhuǎn)基因及基因敲除技術(shù)，建立特定基因過量表達(dá)或缺失的胚胎干細(xì)胞株及小鼠模型，探討關(guān)鍵基因（如激素受體及 BMP 家族）在小鼠 PGC 特化過程中的功能及體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式。 3，在人胚胎干細(xì)胞中創(chuàng)建穩(wěn)定表達(dá)標(biāo)志 PGC 特化的報(bào)告基因體系 (Blimp1-GFP 和 Stella-GFP 等)，以有效地 監(jiān)測(cè) PGC 的形成，并利用此體系，優(yōu)化從人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化 PGC 的條件，探 討關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子及信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控機(jī)理。課題承擔(dān)單位： 華東師范大學(xué)課題負(fù)責(zé)人： 王 媛 特聘教授 （華東師范大學(xué)）主要學(xué)術(shù)骨干： 李大力 副研究員 （華東師范大學(xué)）周文良 教授 （中山大學(xué)）葉希韻 副教授 （華東師范大學(xué)）課題經(jīng)費(fèi)比例： 占申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)的23%。課題 4，干 細(xì) 胞向生殖 細(xì) 胞 誘導(dǎo) 分化技 術(shù) 在 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動(dòng) 物培育上的 應(yīng) 用研究目 標(biāo) ：建立牛 ES 細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系和體外定向 誘導(dǎo)分化技術(shù)平臺(tái)，從而揭示牛多能干細(xì)胞體外分化與發(fā)育的潛能,獲得具有生物活性的配子（精子、卵子），利用這些技術(shù)加速優(yōu)良經(jīng)濟(jì)動(dòng)物種群的培育。研究?jī)?nèi)容：1，參照人和動(dòng)物 ES 細(xì)胞建系的技 術(shù)，選用不同胚 齡及各種附植前牛胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，建立合適的牛 ES 細(xì) 胞體外培養(yǎng)體系。4，以其它子課題的蛋白網(wǎng)絡(luò)調(diào)控等相關(guān)研究為基礎(chǔ)，利用創(chuàng)建的牛 ES 細(xì)胞體系，探討牛干細(xì)胞自我更新和分化的途徑。5，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)、選擇合適的生長(zhǎng)因子、 轉(zhuǎn)錄因子和培養(yǎng)體系誘導(dǎo)牛 ES 細(xì)胞分化為雄性生殖細(xì)胞，為經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的改良服務(wù)。6，以牛 ES 細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來的精子為核供體，分析胞質(zhì)內(nèi)注射后胚胎的發(fā)育能力，建立以 ES 細(xì)胞體外 誘導(dǎo)分化為功能性生殖細(xì) 胞的技術(shù)平臺(tái)。課題承擔(dān)單位： 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)課題負(fù)責(zé)人： 朱 捷 教授 （中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)）主要學(xué)術(shù)骨干： 陳瑤生 教授 （中山大學(xué)）周光斌 副教授 （中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)）于政權(quán) 副教授 （中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)）課題經(jīng)費(fèi)比例 占申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)的23%四、年度計(jì)劃第一年：1, 建立較為理想的從小鼠胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo) PGC 形成的培養(yǎng)體系。2，檢測(cè)不同生長(zhǎng)因子的誘導(dǎo)作用,并嘗試體外誘導(dǎo) PGC 減數(shù)分裂形成功能性配子。3，利用蛋白質(zhì)組學(xué)及 BiFC 組學(xué)研究技術(shù), 系統(tǒng)地從 human ORFeome (12000 個(gè)基因) 或其他逆 轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá) 庫中篩選直接與 Nanog, Oct4，RAR/RXR, Smad 相互作用的蛋白。4，分離、純化精原干細(xì)胞，利用 RAR/RXR 在 DNA 上結(jié)合區(qū)域的序列保守性，通過生物信息學(xué)，分析、檢索含有與 stra8 等同源的調(diào)控區(qū)的新基因，尋找已知減數(shù)分裂基因組中在精子前體細(xì)胞中表達(dá)，受視黃酸誘導(dǎo)調(diào)控的基因，為研究減數(shù)分裂調(diào)控機(jī)制檢索目標(biāo)基因。5，開展小鼠曲細(xì)精管注射及卵母細(xì)胞胞漿注射實(shí)驗(yàn)，建立精原干細(xì)胞和精子細(xì)胞的功能檢測(cè)體系，以便于對(duì)體外誘導(dǎo)分化所得精原（精子）細(xì)胞的生物學(xué)功能加以驗(yàn)證。6，建立特定基因過量表達(dá)或缺失的轉(zhuǎn)基因及基因敲除載體。7，在人胚胎干細(xì)胞中創(chuàng)建穩(wěn)定表達(dá)標(biāo)志 PGC 特化的報(bào)告基因體系。8，優(yōu)化牛 ICM 細(xì)胞體外維持多能性的細(xì)胞因子組合，嘗試獲取牛類胚胎干細(xì)胞系和體外培養(yǎng)的技術(shù)平臺(tái)。預(yù)期目標(biāo)：1，建立和完善高通量研究蛋白互動(dòng)網(wǎng)絡(luò)的技術(shù)平臺(tái)，包括蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)，BiFC 組學(xué)平臺(tái), 基因組學(xué)平臺(tái)，生物信息學(xué)平臺(tái)。2，分離獲得小鼠精原干細(xì)胞；初步完成精子前體細(xì)胞中生物信息學(xué)分析，確定2-3 個(gè)受 視黃酸誘導(dǎo)調(diào)控并參與減數(shù)分裂調(diào)控的目標(biāo)基因。3，初步建立胚胎干細(xì)胞（或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)體系。4，建立小鼠曲細(xì)精管注射及卵母細(xì)胞胞漿注射技術(shù)體系。5，成功誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化成為 PGC，檢測(cè) RA、BMP 等 5 種以上信號(hào)分子對(duì) PGC 分化的影響。6，構(gòu)建小鼠配子中特異表達(dá)的 Gpr126 等 3-5 個(gè)重要基因的條件敲除 載體或轉(zhuǎn)基因載體。7，構(gòu)建 Blimp1-GFP 和 Stella-GFP 等 PGC 特化報(bào)告基因穩(wěn)定表達(dá)的人胚胎干細(xì)胞。8，獲得促使牛 ICM 細(xì)胞體外維持多能性的最佳細(xì) 胞因子組合，建立 8 個(gè)體外培養(yǎng)生長(zhǎng)狀況良好、表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記的牛類胚胎干細(xì)胞系。9，建立牛胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。10， 撰寫論文 1-2 篇。第二年：1，在前年度研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，繼續(xù)完善體外胚胎干細(xì)胞（誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）誘導(dǎo)分化精子細(xì)胞的有效途徑，利用已知精原干細(xì)胞的標(biāo)志基因以及帶有精子前體細(xì)胞熒光標(biāo)記蛋白的小鼠對(duì)體外誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞加以檢驗(yàn)。2，通過過量表達(dá)或 RNAi 的研究手法，從 PGC 或生殖母細(xì)胞調(diào)控元及與其相互作用的蛋白質(zhì)組中篩選出控制 Blimp1, Stella, PITX2, c-kit、Stra-8, vasa 和DAZL 基因表達(dá)的關(guān) 鍵因子。3，利用生物信息學(xué)研究手法，建立以 PGC 關(guān)鍵調(diào)控元為中心的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。4，利用測(cè)序的方法（如 CpG 二核苷酸位點(diǎn)上的甲基化）分析精原干 細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的基因組 DNA，印跡基因和一些關(guān) 鍵的多能性基因的 DNA 甲基化模式。5，對(duì)經(jīng)過視黃酸刺激的精原干細(xì)胞進(jìn)行基因芯片分析來研究其表達(dá)譜。利用特定的抗體進(jìn)行免疫沉淀或染色質(zhì)免疫沉淀對(duì)視黃酸在生殖細(xì)胞中的受體、輔助受體復(fù)合物進(jìn)行生化分析。設(shè)計(jì)、構(gòu)建相關(guān) 載體、 DNA 文庫，用以篩選與視黃素受體相互作用的蛋白。6，建立清除內(nèi)源精原干細(xì)胞的野生型小鼠或缺失精原干細(xì)胞的突變型小鼠，用于曲細(xì)精管注射檢測(cè)體外培養(yǎng)的精原干細(xì)胞的生物學(xué)功能。建立穩(wěn)定的胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)平臺(tái)。7，通過報(bào)告基因和表面抗原標(biāo)記，篩選在體外培養(yǎng)體系中參與 PGC 特化的生長(zhǎng)因子和激素等細(xì)胞外因子或小分子化合物。8，以 gonadal 細(xì)胞共培養(yǎng)的方式建立適合 PGC 生 長(zhǎng)及減數(shù)分裂形成功能性配子的微環(huán)境。9，在優(yōu)化的體外培養(yǎng)條件下誘導(dǎo) ESC 向 PGC 分化，運(yùn)用基因芯片和定量 PCR等技術(shù)篩選 PGC 特異的基因（主要是 GPCR 和其他受體介 導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)分子）并研究其表達(dá)模式。10， 利用轉(zhuǎn)基因及基因敲除技術(shù)，建立特定基因過量表達(dá)或缺失的胚胎干細(xì)胞株或小鼠雜合體模型。11， 利用上述人胚胎干細(xì)胞中創(chuàng)建 PGC 特化的報(bào)告基因體系, 建立完善從人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo) PGC 生成的培養(yǎng)體系。12， 進(jìn)一步探索已建立的牛類胚干細(xì)胞系體外分化為三個(gè)胚層的能力及種系嵌合的研究。13， 探索已建立的牛胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)條件可否適合體外來源的牛胚胎（體外受精胚胎和體外克隆胚胎）的可行性。14， 利用創(chuàng)建的牛 ES 細(xì)胞體系，初步探 討牛 ES 細(xì)胞自我更新和分化途徑。預(yù)期目標(biāo)：1，篩選出控制 PGC 基因表達(dá)的 6-8 個(gè)關(guān)鍵因子。2，建立以 PGC 關(guān)鍵調(diào)控元為中心的較為完整的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。3，完成精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的 DNA 甲基化測(cè)序。4，完成對(duì)精原干細(xì)胞的基因芯片分析，確定 2-3 個(gè)受視黃酸刺激表達(dá)明顯上調(diào)的基因。5，對(duì)視黃酸受體、輔助受體復(fù)合物進(jìn)行生化分析，確定其基本成分；設(shè)計(jì)、構(gòu)建用于篩選相關(guān)蛋白相互作用的載體、DNA 文庫。6，獲得清除內(nèi)源精原干細(xì)胞的野生型小鼠或缺失精原干細(xì)胞的突變型小鼠，獲得精子注射小鼠后代。7，在無血清培養(yǎng)條件下，建立 ESC 向 PGC 分化的最佳體外培養(yǎng)體系。8，鑒定 PGC 參與調(diào)節(jié) ESC 特化為 PGC 過程中的生 長(zhǎng)因子、激素或小分子化合物。9，建立適合 PGC 生長(zhǎng)及減數(shù)分裂的 gonadal 細(xì)胞共培養(yǎng)體系。10， 鑒定 ESC 分化為 PGC 個(gè)階段的差異表達(dá)基因，明確它 們的表達(dá)模式。11， 建立特定基因過表達(dá)和 knockdown 的 ES 細(xì)胞株，得到嵌合體小鼠（第一批）。12， 獲得 3 個(gè)以上特定基因敲除的小鼠干細(xì)胞品系。13， 完善從人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo) PGC 生成的培養(yǎng)體系。14， 建立 1-3 個(gè)具備生殖嵌合能力的牛胚胎干細(xì)胞系。15， 與其他子課題的蛋白網(wǎng)絡(luò)調(diào)控等相關(guān)研究為基礎(chǔ)，初步闡明 LIF-STAT3等信號(hào)通路在維持 ES 細(xì)胞自我更新中的作用。16， 撰寫論文 6-8 篇，申請(qǐng)專利 1 項(xiàng)。第三年：1， 利用高通量的染色體免疫沉淀結(jié)合全基因組 DNA 芯片或短序列測(cè)序技術(shù)（“ChIP-chip”和“ChIP-seq”），研究 PGC 誘導(dǎo)過程中組蛋白修飾的動(dòng)態(tài)過程。2， 利用貝葉斯網(wǎng)絡(luò)推測(cè)組蛋白各種不同修飾和基因表達(dá)之間的因果關(guān)系及組合關(guān)系，并推測(cè)組蛋白修飾相互之間形成的邏輯關(guān)系。3， 全面篩選與組蛋白修飾相關(guān)的基因，通過基因敲除或過量表達(dá)，驗(yàn)證不同修飾與 PGC 或精子發(fā)育之間的相互關(guān)系，以全面了解轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白修飾（著重于組蛋白?；⒓谆难芯浚┰?PGC 形成中的功能與調(diào)控機(jī)制。4， 用特定的抗體通過 Western 雜交和免疫細(xì)胞化學(xué)的方法比較精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞中與控制基因表達(dá)相關(guān)的組蛋白修飾模式的差異，如H3K4me，H3K9me 等。5， 根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，挑選幾個(gè)相關(guān)基因開展分子、細(xì)胞等方面的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)詳細(xì)檢測(cè)它們對(duì)精原細(xì)胞減數(shù)分裂的影響。利用所構(gòu)建的相關(guān)載體、DNA 文庫篩選與視黃素受體相互作用的蛋白。6， 根據(jù)精原干細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞差異分析的初步結(jié)果，在已知的實(shí)驗(yàn)條件基礎(chǔ)上改進(jìn)，以期找出胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)精子細(xì)胞的更有效方法。7， 利用小鼠曲細(xì)精管注射實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)體外誘導(dǎo)分化所得精原干細(xì)胞形成克隆的能力，通過分子和細(xì)胞生物學(xué)的方法檢測(cè)其衍生細(xì)胞。通過體外受精和胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)檢測(cè)其衍生細(xì)胞的生物學(xué)功能。8， 在第一和第二課題篩選的在 PGC 特化和配子減數(shù)分裂過程中有重要功能的轉(zhuǎn)錄因子或輔因子中，選擇幾個(gè)代表性基因構(gòu)建轉(zhuǎn)基因或基因敲除載體，篩選基因打靶的 ES 細(xì)胞株；9， 對(duì)已構(gòu)建的小鼠模型進(jìn)行表型分析，鑒定目的基因的生理功能和下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑；10， 研究參與 PGC 特化的生長(zhǎng)因子和激素等細(xì)胞外因子或小分子化合物參與調(diào)控的分子機(jī)理，進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)體系。11， 已建立的不同胚胎來源（體內(nèi)胚胎、體外受精胚胎和克隆胚胎）的牛 ES 細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)分析。12， 探索牛 ES 細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化形成具有功能性配子（精子、卵子）的能力。預(yù)期目標(biāo)：1，把握 PGC 誘導(dǎo)過程中組蛋白修飾的動(dòng)態(tài)過程。2，發(fā)現(xiàn)若干個(gè)新的調(diào)控干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和染色質(zhì)修飾因子。3，揭示組蛋白修飾的動(dòng)態(tài)過程和不同修飾與 PGC 發(fā)育之間的相互關(guān)系。4，完成精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞（誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）組蛋白修飾模式的檢測(cè)和比較；5，完成生物信息學(xué)分析結(jié)果確定的相關(guān)基因?qū)?xì)胞減數(shù)分裂的影響研究，初步完成相關(guān)載體、DNA 文 庫的構(gòu)建，篩選與視黃素受體相互作用的蛋白，確定 1-2 個(gè)參與減數(shù)分裂調(diào)節(jié)的新基因；6，體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞（誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）產(chǎn)生具有精子分化表型的精原細(xì)胞，并通過小鼠曲細(xì)精管注射實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)體外誘導(dǎo)分化所得精原細(xì)胞形成克隆的能力，通過體外受精和胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)檢測(cè)其衍生細(xì)胞的受精和支持胚胎發(fā)育的能力。7，構(gòu)建 3-5 個(gè)第一和第二課題篩選得到的重要基因敲除載體（第二批）；8，初步完成小鼠模型的表型分析，找到這些基因可能調(diào)控的信號(hào)途徑；9，闡明新發(fā)現(xiàn)的生長(zhǎng)因子和激素等細(xì)胞外因子或小分子化合物參與調(diào)控 PGC分化的分子機(jī)理，進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)體系；10，探明不同來源的牛 ES 細(xì)胞分子生物學(xué)方面的差異， 為其體外誘導(dǎo)分化做準(zhǔn)備。11，初步建立牛 ES 細(xì)胞體外定向 誘導(dǎo)分化形成具有功能性配子（精子、卵子）的技術(shù)體系。利用卵母細(xì)胞帶下注射或胞質(zhì)注射的方法驗(yàn)證誘導(dǎo)分化的生殖細(xì)胞的能力。12，撰寫論文 8-10 篇，申請(qǐng)專 利 1-2 項(xiàng)。第四年：1，利用四環(huán)素調(diào)節(jié)表達(dá)系統(tǒng), RNAi, ChIP 等技術(shù)闡述端粒蛋白以及端粒酶在干細(xì)胞向 PGC 誘導(dǎo)過程中的作用與機(jī)理。2，通過 cDNA 基因芯片篩選的方法系統(tǒng)分析胚胎干細(xì)胞（誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）和精原干細(xì)胞的基因表達(dá)譜。從兩種細(xì)胞中分離出的 RNA 與小鼠的表達(dá) DNA 陣列雜交，以檢測(cè)基因表達(dá)的上調(diào)或下降。3，對(duì)視黃酸在生殖細(xì)胞中的受體及輔助受體復(fù)合物的形成及其中各成分的生物學(xué)功能的分子調(diào)節(jié)機(jī)制加以研究。4，通過卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)檢測(cè)體外誘導(dǎo)分化的生殖細(xì)胞是否可替代內(nèi)源精子細(xì)胞支持胚胎發(fā)育，產(chǎn)生后代。5，建立特定基因過量表達(dá)或缺失的小鼠純合體模型, 并研究上述特定基因過量表達(dá)或缺失的胚胎干細(xì)胞及小鼠純合體的表型及對(duì) PGC 及功能性配子形成的影響，探討關(guān)鍵基因（如激素受體）在小鼠 PGC 特化及減數(shù)分裂形成功能性配子過程中的功能及體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式。6，利用上述人胚胎干細(xì)胞中創(chuàng)建 PGC 特化的報(bào)告基因體系及 PGC 生成的培養(yǎng)體系，優(yōu)化從人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化 PGC 的條件，探討關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子及信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控機(jī)理。7，利用卵母細(xì)胞帶下注射或胞質(zhì)注射的方法對(duì)誘導(dǎo)分化的生殖細(xì)胞所形成的囊胚進(jìn)行分子生物學(xué)、生理學(xué)分析及安全性檢測(cè)。并為其體內(nèi)發(fā)育做準(zhǔn)備。8，召開國(guó)際生殖學(xué)研討會(huì)。預(yù)期目標(biāo)：1，明確端粒蛋白以及端粒酶在干細(xì)胞向 PGC 誘導(dǎo)過程中的作用機(jī)理。2，完成胚胎干細(xì)胞（誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）和精原干細(xì)胞的基因表達(dá)譜的檢測(cè)和比較。3，探索視黃酸在生殖細(xì)胞中的受體及輔助受體復(fù)合物的形成及其中各成分的生物學(xué)功能的分子調(diào)節(jié)機(jī)制。4，體外誘導(dǎo)分化獲得生殖細(xì)胞，并通過卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)獲得后代。5，完成第一批小鼠模型的表型分析和機(jī)理研究。6，初步完成重要基因在 ESC 特化為 PGC 體外功能和機(jī)理研究。7，得到優(yōu)化的人 ESC 分化 PGC 的培養(yǎng)體系，初步闡明細(xì)胞外因子的作用機(jī)理；8，獲得以牛 ES 細(xì)胞誘導(dǎo)而來的生殖細(xì)胞體外所形成的囊胚，利用分子生物學(xué)手段驗(yàn)證這些胚胎的生物活性，如甲基化、乙?；约岸肆Ｃ搁L(zhǎng)短和活性等，并與正常體內(nèi)胚胎進(jìn)行比較，初步闡明這種牛 ES 細(xì)胞 誘導(dǎo)分化而來的生殖細(xì)胞所形成的胚胎是否具有優(yōu)勢(shì)、是否具備安全性。9，召開一次生殖學(xué)研討會(huì)。10， 撰寫論文 8-10 篇，申請(qǐng)專利 1-3 項(xiàng)。第五年：1，利用以上的研究手法，與課題 4 共同篩選在誘導(dǎo)牛干細(xì)胞分化過程中的Nanog, Oct4，RAR/RXR 的結(jié)合蛋白， 檢索調(diào)控 Blimp1 、Stella, PITX2, c-kit、Stra-8, vasa 等基因表達(dá)的調(diào)控因子。明確 組蛋白修飾及端粒蛋白和端粒酶的作用。2，通過蛋白組學(xué)，分離，純化胚胎干細(xì)胞和精原干細(xì)胞的細(xì)胞膜成分，利用蛋白雙向凝膠電泳技術(shù)和質(zhì)譜分析，深入研究細(xì)胞表面蛋白表達(dá)的差別，綜合前四年研究結(jié)果分析胚胎干細(xì)胞和精原干細(xì)胞在 DNA 甲基化模式、基因表達(dá)和 細(xì)胞表面蛋白成分的差異，闡明造成精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的不同發(fā)育潛力的主要原因。3，綜合分析闡明通過視黃酸調(diào)控雄性生殖細(xì)胞減數(shù)分裂的機(jī)制。4，進(jìn)一步研究體外誘導(dǎo)分化的生殖細(xì)胞通過胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)獲得的后代的表型及生理功能，評(píng)估體外誘導(dǎo)分化獲得的生殖細(xì)胞對(duì)其后代的影響。5，研究特定基因過量表達(dá)或缺失的胚胎干細(xì)胞及小鼠純合體表型,并探討相關(guān)的體外分子機(jī)制實(shí)驗(yàn)。6，結(jié)合其他課題組的研究成果,利用已完善的 PGC 及功能性配子誘導(dǎo)體系,檢測(cè)新發(fā)現(xiàn)的重要基因(如 Oct4,Nanog 的相互作用分子等)的功能及分子作用機(jī)理。7，牛 ES 細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來的生殖細(xì)胞所形成的胚胎體內(nèi)發(fā)育能力，并與體內(nèi)來源胚胎在體內(nèi)正常發(fā)育進(jìn)行比較研究。8，總結(jié)研究結(jié)果，匯總數(shù)據(jù)，提交研究報(bào)告，撰寫論文。預(yù)期目標(biāo)：1，在整體細(xì)胞水平上初步確立干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。2，完成胚胎干細(xì)胞（誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）和精原干細(xì)胞表面蛋白表達(dá)的檢測(cè)和比較；綜合前四年研究結(jié)果，闡明造成精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的不同發(fā)育潛力的主要原因；綜合分析闡明通過視黃酸調(diào)控雄性生殖細(xì)胞減數(shù)分裂的機(jī)制；完成對(duì)卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)獲得后代的表型分析。3，完成第二批小鼠動(dòng)物模型表型分析和機(jī)理研究；4，重要基因在 ESC 特化為 PGC 體外功能和機(jī)理研究；5，將牛 ES 細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來的生殖 細(xì)胞所形成的胚胎移植于同期 誘導(dǎo)發(fā)情的母體內(nèi)，力爭(zhēng)獲得后代。6，比較分析兩種胚胎生成后代牛的異同，初步闡明以牛 ES 細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來的生殖細(xì)胞所形成的胚胎是否具備可行性和優(yōu)越性。以期真正意義上建立牛 ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化功能性生殖細(xì)胞的技術(shù)平臺(tái)，為經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的改良服務(wù)。7，整理論文 8-10 篇，申 請(qǐng)專利 3-5 項(xiàng)。