血紅蛋白的提取和分離 基礎(chǔ)知識(shí)

第15課時(shí)血紅蛋白的提取和分離1.歸納蛋白質(zhì)多樣性的原因(1)圖甲說(shuō)明：氨基酸的種類不同，構(gòu)成的肽鏈不同。(2)圖乙說(shuō)明：氨基酸的數(shù)目不同，構(gòu)成的肽鏈不同。(3)圖丙說(shuō)明：氨基酸的排列次序不同，構(gòu)成的肽鏈不同。(4)圖丁說(shuō)明：肽鏈的數(shù)目和空間結(jié)構(gòu)不同，構(gòu)成的蛋白質(zhì)不同。2.血液包括血細(xì)胞和血漿，血細(xì)胞又分為紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板，其中紅細(xì)胞含有血紅蛋白，使紅細(xì)胞呈現(xiàn)紅色。3.紅細(xì)胞放到低滲溶液中，會(huì)吸收水分，體積膨脹直至漲破。課堂導(dǎo)入蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)不可缺少的物質(zhì)，隨著基因組測(cè)序工作的完成，人們對(duì)蛋白質(zhì)的研究和應(yīng)用工作進(jìn)入了新的時(shí)代，這就需要獲得純度較高的蛋白質(zhì)。因此對(duì)蛋白質(zhì)的分離就是生物學(xué)研究中經(jīng)常要做的工作，下面我們就以血紅蛋白的提取和分離來(lái)學(xué)習(xí)有關(guān)蛋白質(zhì)的一些基本技術(shù)。探究點(diǎn)一蛋白質(zhì)分離技術(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)多種多樣，按照科學(xué)的需要有時(shí)要把它們分開(kāi)，分離蛋白質(zhì)常使用的方法是凝膠色譜法和電泳法，都是根據(jù)不同蛋白質(zhì)分子的之間的差異來(lái)分離的。2 / 231.蛋白質(zhì)特性的差異(1)分子的形狀和大小；(2)所帶電荷的性質(zhì)和多少；(3)溶解度；(4)吸附性質(zhì)；(5)對(duì)其他分子的親和力。2.分離的方法(1)凝膠色譜法.概念：凝膠色譜法，也稱做分配色譜法，是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。.凝膠：是一些微小的多孔球體，大多數(shù)是由多糖類化合物構(gòu)成的，內(nèi)含許多貫穿通道，具有多孔的凝膠又稱為分子篩。.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理(如圖A)相對(duì)分子質(zhì)量直徑大小運(yùn)動(dòng)方式運(yùn)動(dòng)速度運(yùn)動(dòng)路程洗脫次序大大于凝膠顆?？障吨睆健⒈慌抛柙谀z顆粒的外面垂直向下移動(dòng)較快較短先從凝膠柱洗脫出來(lái)小小于凝膠顆?？障吨睆?，可以進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部垂直向下移動(dòng)，無(wú)規(guī)則擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒較慢較長(zhǎng)后從凝膠柱洗脫出來(lái).分離蛋白質(zhì)的過(guò)程(如圖B)蛋白質(zhì)混合物上柱；洗脫開(kāi)始，相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)；相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)則被排阻于凝膠顆粒之外；相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)被滯留；相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)向下移動(dòng)；相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子完全分開(kāi)；相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)行程較短，已從層析柱中洗脫出來(lái)，相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)還在行進(jìn)中。 (2)電泳概念：電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。原理：在同一電場(chǎng)下，由于各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。常用方法a.瓊脂糖凝膠電泳：由于瓊脂糖本身不帶電荷，所以，各種分子在電場(chǎng)中的遷移速率因各種分子帶電性質(zhì)的差異、分子大小和形狀的不同而不同，從而得以分離。b.聚丙烯酰胺凝膠電泳加入SDS作用：使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性，解聚成單條肽鏈；SDS能與各種蛋白質(zhì)結(jié)合形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)原有的電荷量，因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。(3)緩沖溶液概念：在一定范圍內(nèi)，能夠抵制外界的酸、堿或稀釋的影響，維持pH基本不變的溶液叫做緩沖溶液。緩沖溶液的配制：緩沖溶液通常由12種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液。小貼士緩沖溶液常見(jiàn)的有三類(1)弱酸及其對(duì)應(yīng)鹽，如CH3COOHCH3COONa，H2CO3NaHCO3。(2)多元弱酸的酸式鹽及其對(duì)應(yīng)的次級(jí)鹽，如：NaHCO3Na2CO3，NaH2PO4Na2HPO4。(3)弱堿及其對(duì)應(yīng)鹽，如NH3H2ONH4Cl。歸納提煉凝膠色譜法和電泳法凝膠色譜法分離分子是依據(jù)分子質(zhì)量大小，利用凝膠色譜柱使大分子優(yōu)先洗脫出來(lái)，而小分子后分離出來(lái)。電泳法分離分子則是依據(jù)各種分子帶電性質(zhì)的差異，以及分子本身的大小、形狀不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)在電場(chǎng)中將各種分子分離?；顚W(xué)活用1.下列各項(xiàng)中，除哪項(xiàng)外均為電泳使樣品中各分子分離的原因()A.分子帶電性質(zhì)的差異 B.分子的大小C.分子的形狀 D.分子的變性溫度問(wèn)題導(dǎo)析電泳法是在同一電場(chǎng)下，由于各種分子帶電性質(zhì)的差異及分子本身大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。答案D解析電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。樣品分子的帶電性質(zhì)不同、分子的大小和形狀不同都會(huì)影響帶電粒子在電場(chǎng)中的遷移速度，與分子的變性溫度無(wú)關(guān)，故選D項(xiàng)。探究點(diǎn)二血紅蛋白的提取和分離每一種蛋白質(zhì)的分離純化方法因其來(lái)源和性質(zhì)不同會(huì)有很大差異，下面以哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞為材料，學(xué)習(xí)初步分離蛋白質(zhì)的方法。1.蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。2.樣品處理(1)紅細(xì)胞的洗滌目的：去除雜蛋白；方法：采集血樣，低速短時(shí)間離心，然后用膠頭吸管吸出上層透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細(xì)胞液體倒入燒杯，再加入五倍體積的生理鹽水稀釋，再離心，重復(fù)三次，直至上清液中不再呈現(xiàn)黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。(2)血紅蛋白的釋放將洗滌好的紅細(xì)胞倒入燒杯中：加蒸餾水到原血液的體積，其作用是使紅細(xì)胞吸水漲破；加入40%體積的甲苯，其作用是溶解細(xì)胞膜；置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0 min，其作用是加速紅細(xì)胞破裂；紅細(xì)胞破裂，釋放出血紅蛋白。(3)分離血紅蛋白溶液將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，以2 000 r/min的速度離心10 min，試管中的溶液分為4層：將試管中的液體用濾紙過(guò)濾、除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分離出下層的紅色透明液體，即血紅蛋白溶液。(4)透析原理：透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而將大分子保留在袋內(nèi)。過(guò)程：取1 mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300 mL的物質(zhì)的量濃度為20 mmol/L的磷酸緩沖液中(pH為7.0)，透析12 h。目的：a.除去樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)。b.用于更換樣品的緩沖液。3.凝膠色譜柱的制作(1)取長(zhǎng)40 cm，內(nèi)徑為1.6 cm的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。(2)柱底部制作：橡皮塞打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗將橡皮塞上部包好。(3)柱頂部制作：打孔安裝玻璃管。(4)將上述三部分按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。4.凝膠色譜柱的裝填(1)計(jì)算：根據(jù)色譜柱的內(nèi)體積計(jì)算所需凝膠量(2)凝膠溶脹：凝膠用蒸餾水充分溶脹后，配成凝膠懸浮液(3)固定：將色譜柱垂直固定在支架上(4)裝填：將凝膠懸液一次性裝填入色譜柱內(nèi)(5)洗滌平衡：用20 mmol/L的磷酸緩沖液(pH7.0)洗滌平衡凝膠12 h，使凝膠裝填緊密5.純度鑒定電泳判斷純化的蛋白質(zhì)是否達(dá)到要求，需要進(jìn)行蛋白質(zhì)純度的鑒定。鑒定的方法中，使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。歸納提煉實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)(1)紅細(xì)胞的洗滌離心速度與離心時(shí)間十分重要，離心轉(zhuǎn)速要低，時(shí)間要短，否則白細(xì)胞等會(huì)一同沉淀，達(dá)不到分離的效果。重復(fù)洗滌三次，如上清液仍有黃色，可增加洗滌次數(shù)，否則無(wú)法清除血漿蛋白。(2)色譜柱填料的處理：為了加速干凝膠的膨脹，可將加入洗脫液的濕凝膠用沸水浴加熱，通常只需12 h。這種方法不僅節(jié)約時(shí)間，還可除去凝膠中可能帶有的微生物，排出膠粒內(nèi)的空氣。(3)凝膠色譜柱的裝填：在色譜柱中裝填凝膠的時(shí)候要盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。在裝填凝膠柱時(shí)，不得有氣泡存在。因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。在凝膠色譜操作過(guò)程中，不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。一旦發(fā)生上述兩種情況，凝膠色譜柱需要重新裝填。(4)蛋白質(zhì)的分離：滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，不要破壞凝膠面。根據(jù)紅色區(qū)帶的移動(dòng)狀況判斷收集流出液的時(shí)間。活學(xué)活用2.下列說(shuō)法不正確的是()A.在一定范圍內(nèi)，緩沖溶液能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液pH的影響，維持pH基本不變B.緩沖溶液通常由12種緩沖劑溶解于水中配制而成C.電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程D.透析袋能使大分子自由進(jìn)出，而將小分子保留在袋內(nèi)問(wèn)題導(dǎo)析透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而將大分子保留在袋內(nèi)。答案D解析透析袋一般是用硝酸纖維素(又叫玻璃紙)制成的。透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而將大分子保留在袋內(nèi)。透析可以除去樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)，或用于更換樣品的緩沖液。1.用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)()A.路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢B.路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較快C.路程較短，移動(dòng)速度較慢D.路程較短，移動(dòng)速度較快答案D解析凝膠顆粒內(nèi)部有許多貫穿的通道，當(dāng)相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢；而相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快。2.在血紅蛋白分離過(guò)程中，使用緩沖液的作用是()A.維持溶液濃度不變B.維持溶液酸堿度不變C.催化蛋白質(zhì)分離過(guò)程順利完成D.無(wú)實(shí)際意義答案B解析分離蛋白質(zhì)時(shí)加入緩沖液，其原因是緩沖液在一定范圍內(nèi)能抵制外界酸和堿對(duì)反應(yīng)溶液pH的影響，保持pH基本不變。3.下列關(guān)于蛋白質(zhì)提取和分離實(shí)驗(yàn)中樣品處理步驟的敘述，正確的是()A.紅細(xì)胞的洗滌：加入蒸餾水，緩慢攪拌，低速短時(shí)間離心B.血紅蛋白的釋放：加入生理鹽水和甲苯，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢鐲.分離血紅蛋白：將攪拌好的混合液離心，過(guò)濾后，用分液漏斗分離D.透析：將血紅蛋白溶液裝入透析袋，然后置于pH為4.0的磷酸緩沖液中透析12 h答案C解析紅細(xì)胞洗滌步驟中應(yīng)加入生理鹽水而不是蒸餾水，血紅蛋白釋放中加入蒸餾水，透析時(shí)緩沖液pH應(yīng)為7.0而不是4.0。4.凝膠色譜柱制作成功的標(biāo)志是()A.凝膠裝填緊密、均勻B.凝膠色譜柱中有氣泡C.洗脫中，紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng)D.洗脫中，紅色區(qū)帶偏向左邊移動(dòng)答案C解析洗脫過(guò)程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作成功。5.凝膠色譜技術(shù)是六十年代初發(fā)展起來(lái)的一種快速而又簡(jiǎn)單的分離技術(shù)，由于設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，不需要有機(jī)溶劑，對(duì)高分子物質(zhì)有很高的分離效果，目前已經(jīng)被生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程學(xué)、分子免疫學(xué)以及醫(yī)學(xué)等有關(guān)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，不但應(yīng)用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，而且已經(jīng)大規(guī)模地用于工業(yè)生產(chǎn)。據(jù)圖回答下列問(wèn)題：(1)a、b均為蛋白質(zhì)分子，其中先從層析柱中洗脫出來(lái)的是_，原因是_。(2)自己制作凝膠色譜柱時(shí)，在色譜柱底部d位置相當(dāng)于多孔板的結(jié)構(gòu)可由_替代。(3)裝填凝膠色譜柱時(shí)，色譜柱內(nèi)不能有氣泡存在，原因是_。(4)若選用Sephadex G100，則“G”表示_，100表示_。答案(1)aa相對(duì)分子質(zhì)量大，無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快(2)尼龍網(wǎng)和尼龍紗(3)氣泡會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果(4)凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍凝膠得水值解析用凝膠色譜法分離各種大分子物質(zhì)時(shí)，大分子物質(zhì)先洗脫出來(lái)，然后是小分子物質(zhì)。大分子物質(zhì)由于直徑較大，不易進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，而只能分布于顆粒之間，所以向下移動(dòng)的速度較快。小分子物質(zhì)除了可在凝膠顆粒間隙中擴(kuò)散外，還可以進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，在向下移動(dòng)的過(guò)程中，從一個(gè)凝膠內(nèi)擴(kuò)散到顆粒間隙后再進(jìn)入另一個(gè)凝膠顆粒，如此不斷地進(jìn)入和擴(kuò)散，小分子物質(zhì)的下移速度落后于大分子物質(zhì)，從而落后于大分子物質(zhì)洗脫出來(lái)。在色譜柱中裝填凝膠的時(shí)候要盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。一是在裝填凝膠柱時(shí)，不得有氣泡存在，因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。二是凝膠色譜操作過(guò)程中，不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。一旦發(fā)生上述兩種情況，凝膠色譜柱需要重新裝填?；A(chǔ)過(guò)關(guān)知識(shí)點(diǎn)一蛋白質(zhì)分離技術(shù)1.利用凝膠色譜法先洗脫出來(lái)的蛋白質(zhì)是()A.相對(duì)分子質(zhì)量大的B.溶解度高的C.相對(duì)分子質(zhì)量小的D.所帶電荷多的答案A解析相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)能進(jìn)入凝膠內(nèi)部通道，路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢；相對(duì)分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)，路程較短，移動(dòng)速度較快，首先洗脫出來(lái)。2.凝膠色譜法是分離蛋白質(zhì)分子的一種常用方法，但并非所有的蛋白質(zhì)都可以用此方法進(jìn)行分離，能分離的蛋白質(zhì)分子之間必須()A.具有相同的相對(duì)分子質(zhì)量B.相對(duì)分子質(zhì)量不同，但都是相對(duì)分子質(zhì)量較大的分子C.相對(duì)分子質(zhì)量不同，但都是相對(duì)分子質(zhì)量較小的分子D.具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量答案C解析若在每種凝膠分離范圍之外的分子，在不改變凝膠種類的情況下是很難分離的。對(duì)于分子大小不同，但同屬于凝膠分離范圍內(nèi)的各種分子，在凝膠床中的分布情況是不同的，分子較大的只能進(jìn)入孔徑較大的那一部分凝膠。3.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時(shí)，凝膠的種類較多，但其作用的共同點(diǎn)是()A.改變蛋白質(zhì)分子通過(guò)凝膠時(shí)的路徑B.吸附一部分蛋白質(zhì)，從而影響蛋白質(zhì)分子的移動(dòng)速度C.將酶或細(xì)胞固定在凝膠中D.與蛋白質(zhì)分子進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，從而影響其移動(dòng)速度答案A解析凝膠的種類較多，但每種凝膠內(nèi)部都有孔隙。相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子可以進(jìn)入凝膠內(nèi)部，通過(guò)的路程較長(zhǎng)，洗脫時(shí)從凝膠柱中出來(lái)的較晚，相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子則可以較早地洗脫出來(lái)，從而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的。4.已知某樣品中存在甲、乙、丙、丁、戊五種物質(zhì)，其分子大小、電荷的性質(zhì)和數(shù)量情況如圖所示。下列敘述正確的是()A.將樣品裝入透析袋中透析12 h，若分子乙保留在袋內(nèi)，則分子甲也保留在袋內(nèi)B.若五種物質(zhì)為蛋白質(zhì)，則用凝膠色譜柱分離時(shí)，甲的移動(dòng)速度最快C.將樣品以2 000 r/min的速度離心10 min，若分子戊存在于沉淀中，則分子丙也存在于沉淀中D.若五種物質(zhì)為蛋白質(zhì)，用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品中的蛋白質(zhì)分子，則分子甲和分子戊形成的電泳帶相距最近答案C解析透析的原理是相對(duì)分子質(zhì)量小的物質(zhì)能透過(guò)半透膜，相對(duì)分子質(zhì)量大的物質(zhì)不能透過(guò)，乙保留在袋內(nèi)，甲則不一定保留在袋內(nèi)；凝膠色譜柱分離時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量小的物質(zhì)路程長(zhǎng)、移動(dòng)慢；離心時(shí)相對(duì)分子質(zhì)量大的物質(zhì)先沉淀，戊沉淀，則乙、丁、丙均已沉淀；用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)時(shí)，電泳遷移率主要取決于分子大小。知識(shí)點(diǎn)二血紅蛋白的提取和分離5.洗滌紅細(xì)胞時(shí)，離心所采用的方法是()A.低速長(zhǎng)時(shí)間離心 B.低速短時(shí)間離心C.高速長(zhǎng)時(shí)間離心 D.高速短時(shí)間離心答案B解析高速或長(zhǎng)時(shí)間離心，會(huì)導(dǎo)致白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，得不到純凈的紅細(xì)胞，而影響后面血紅蛋白的提取純度。6.對(duì)在凝膠柱上加入樣品和洗脫的操作，不正確的是()A.加樣前要使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液下降到與凝膠面平齊B.讓吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)，貼壁加樣至色譜柱頂端，不要破壞凝膠面C.打開(kāi)下端出口，待樣品完全進(jìn)入凝膠層后，直接連接緩沖液，洗脫瓶開(kāi)始洗脫D.待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5 mL收集一管，連續(xù)收集流出液答案C解析打開(kāi)下端出口，待樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口，再用同樣的方法小心加入適量的20 mmol/L的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，然后連接緩沖液洗脫瓶，打開(kāi)下端出口，開(kāi)始洗脫。7.在蛋白質(zhì)的提取和分離中，關(guān)于對(duì)樣品處理過(guò)程的分析正確的是()A.洗滌紅細(xì)胞的目的是去除血漿中的葡萄糖、無(wú)機(jī)鹽B.洗滌時(shí)離心速度過(guò)小，時(shí)間過(guò)短，白細(xì)胞等會(huì)沉淀，達(dá)不到分離的效果C.洗滌過(guò)程選用0.1%的生理鹽水D.透析的目的是去除樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)答案D解析洗滌紅細(xì)胞的目的是去除血漿中除血紅蛋白以外的雜蛋白；洗滌時(shí)離心速度過(guò)大，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，白細(xì)胞等會(huì)沉淀，達(dá)不到分離的效果；洗滌過(guò)程選用0.9%的生理鹽水。8.將處理破裂后的紅細(xì)胞混合液以2 000 r/min的速度離心10 min后，離心管中的溶液分為四層，從上到下的順序依次是()A.血紅蛋白、甲苯層、脂質(zhì)物質(zhì)層、紅細(xì)胞破碎物沉淀層B.甲苯層、紅細(xì)胞破碎物沉淀層、血紅蛋白、脂質(zhì)物質(zhì)層C.脂質(zhì)物質(zhì)層、血紅蛋白、甲苯層、紅細(xì)胞破碎物沉淀層D.甲苯層、脂質(zhì)物質(zhì)層、血紅蛋白、紅細(xì)胞破碎物沉淀層答案D解析混合液經(jīng)離心后按密度大小排列，在離心管中從上到下的順序依次是：第1層為無(wú)色透明的甲苯層，第2層白色薄層固體是脂溶性物質(zhì)沉淀層，第3層紅色透明液體是血紅蛋白水溶液，第4層暗紅色沉淀物主要是紅細(xì)胞破碎物沉淀。能力提升9.使用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)中，相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)在凝膠中的行進(jìn)過(guò)程，可表示為圖中()答案B解析相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)留在顆粒外面，相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)進(jìn)入顆粒內(nèi)部；相對(duì)分子質(zhì)量大的通過(guò)凝膠間隙先被洗脫，相對(duì)分子質(zhì)量小的進(jìn)入凝膠內(nèi)部而后被洗脫。10.蛋白質(zhì)的分離與純化是蛋白質(zhì)研究的重要技術(shù)。下列有關(guān)敘述不正確的是()A.根據(jù)蛋白質(zhì)分子不能透過(guò)半透膜的特性，可將樣品中各種不同的蛋白質(zhì)分離B.根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷性質(zhì)的差異及分子大小等，可通過(guò)電泳法分離蛋白質(zhì)C.根據(jù)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小，可通過(guò)凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)D.根據(jù)蛋白質(zhì)的分子大小、密度不同，可通過(guò)離心沉降法分離蛋白質(zhì)答案A解析蛋白質(zhì)分子是生物大分子，都不能通過(guò)半透膜，因此不能利用半透膜分離蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)分子所帶電荷性質(zhì)的差異及分子大小可以使蛋白質(zhì)分子在電場(chǎng)中獲得不同的遷移速度，因此可以利用電泳法分離蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小不同，通過(guò)凝膠柱的時(shí)間不同，可通過(guò)凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)的分子大小、密度不同，具有不同的離心力，可通過(guò)離心沉降法分離蛋白質(zhì)。11.凝膠柱制作的順序一般是()橡皮塞打孔挖凹穴裝玻璃管蓋尼龍網(wǎng)蓋尼龍紗將橡皮塞插入玻璃管接尼龍管、裝螺旋夾柱頂插入安裝玻璃管的橡皮塞A. B.C. D.答案B解析凝膠柱制作的一般流程是：選擇玻璃管選擇合適的橡皮塞打孔挖凹穴蓋尼龍網(wǎng)蓋尼龍紗將橡皮塞插到玻璃管接尼龍管裝螺旋夾柱頂插入安裝玻璃管的橡皮塞。12.下列關(guān)于電泳的說(shuō)法，不正確的是()A.電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程B.帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)C.蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少D.用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于分子的大小答案C解析蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素，SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差異，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。13.下列操作正確的是()A.分離紅細(xì)胞時(shí)采用低速長(zhǎng)時(shí)間離心B.紅細(xì)胞釋放出血紅蛋白只需要加入蒸餾水即可C.分離血紅蛋白溶液是低速短時(shí)間離心D.透析時(shí)要用20 mmol/L的磷酸緩沖液，透析12 h答案D解析分離紅細(xì)胞時(shí)，采用低速短時(shí)間離心，如500 r/min離心2 min；分離血紅蛋白溶液時(shí)，離心時(shí)間較長(zhǎng)，如2 000 r/min離心10 min。釋放血紅蛋白時(shí)，加入蒸餾水和40%體積的甲苯；透析時(shí)用物質(zhì)的量濃度為20 mmol/L的磷酸緩沖液，以除去相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)。14.血紅蛋白是人和其他脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞的主要組成成分，負(fù)責(zé)血液中O2或CO2的運(yùn)輸。請(qǐng)根據(jù)血紅蛋白的提取和分離流程圖回答問(wèn)題。(1)將實(shí)驗(yàn)流程補(bǔ)充完整：A為_(kāi)，B為_(kāi)。凝膠色譜法是根據(jù)_而達(dá)到蛋白質(zhì)分離的有效方法。(2)洗滌紅細(xì)胞的目的是去除_，洗滌次數(shù)過(guò)少，無(wú)法除去_；離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使_一同沉淀，達(dá)不到分離的效果。洗滌干凈的標(biāo)志是_。釋放血紅蛋白的過(guò)程中起作用的是_。(3)在洗脫過(guò)程中加入物質(zhì)的量濃度為20 mmol/L的磷酸緩沖液(pH為7.0)的目的是_。如果紅色區(qū)帶_，說(shuō)明色譜柱制作成功。答案(1)血紅蛋白的釋放樣品的加入和洗脫相對(duì)分子質(zhì)量的大小(2)雜蛋白(血漿蛋白)血漿蛋白白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞離心后的上清液中沒(méi)有黃色蒸餾水和甲苯(3)準(zhǔn)確模擬生物體內(nèi)的生理環(huán)境，保持體外的pH和體內(nèi)一致均勻一致地移動(dòng)解析凝膠色譜法是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法，在蛋白質(zhì)提取與分離過(guò)程中包括樣品的處理、粗分離、純化和純度鑒定四步，每一步均應(yīng)用了不同的操作技術(shù)，需要注意。15.如圖表示血紅蛋白提取和分離的部分實(shí)驗(yàn)裝置，請(qǐng)據(jù)圖回答下列問(wèn)題。(1)血紅蛋白是人和其他脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞的主要組成成分，它在紅細(xì)胞中的作用體現(xiàn)了蛋白質(zhì)具有_功能。(2)甲裝置中，B是血紅蛋白溶液，則A是_；乙裝置中，C溶液的作用是_。(3)甲裝置用于_，目的是_。用乙裝置分離蛋白質(zhì)的方法叫_，是根據(jù)_分離蛋白質(zhì)的有效方法。(4)用乙裝置分離血紅蛋白時(shí)，待_時(shí)，用試管收集流出液，每5 mL收集一管，連續(xù)收集。答案(1)運(yùn)輸(2)磷酸緩沖溶液洗脫血紅蛋白(3)透析(粗分離)去除樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)凝膠色譜法相對(duì)分子質(zhì)量的大小(4)紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端解析用透析法(如圖甲)對(duì)血紅蛋白進(jìn)行粗分離，將血紅蛋白溶液裝入透析袋中，可以去除樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)。血紅蛋白的純化采用凝膠色譜法(如圖乙)，血紅蛋白相對(duì)分子質(zhì)量較大，無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路徑較短，移動(dòng)速度較快，可以收集到紅色的蛋白質(zhì)。個(gè)性拓展16.紅細(xì)胞含有大量血紅蛋白，血紅蛋白的主要功能是攜帶O2或CO2，我們可以選用豬、牛、羊或其他脊椎動(dòng)物的血液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，來(lái)提取和分離血紅蛋白，請(qǐng)回答下列有關(guān)問(wèn)題。(1)實(shí)驗(yàn)前取新鮮的血液，要切記在采血容器中預(yù)先加入檬酸鈉，取血回來(lái)，馬上進(jìn)行離心，收集血紅蛋白溶液。加入檸檬酸鈉的目的是_以上所述的過(guò)程即是樣品處理，它包括_、_、收集血紅蛋白溶液。(2)洗滌紅細(xì)胞的目的是_。(3)你如何知道紅細(xì)胞已洗滌干凈？_。(4)分離紅細(xì)胞時(shí)的離心速度及離心時(shí)間分別是_。(5)若離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)結(jié)果會(huì)怎樣？_。(6)將收集的血紅蛋白溶液放在透析袋中進(jìn)行透析，即樣品的粗分離。透析的目的是_。透析的原理是_。答案(1)防止血液凝固紅細(xì)胞的洗滌血紅蛋白的釋放(2)去除血漿蛋白(3)離心后的上清液沒(méi)有黃色(4)低速500 r/min；短時(shí)間如2 min(5)離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使白細(xì)胞等一同沉淀，得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度(6)去除分子量較小的雜質(zhì)透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而大分子則保留在袋內(nèi)解析人或哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞中無(wú)細(xì)胞核和細(xì)胞器，雜質(zhì)相對(duì)較少，提取血紅蛋白相對(duì)較容易，而其他動(dòng)物如鳥類、兩棲類等動(dòng)物紅細(xì)胞中含細(xì)胞核及大量的細(xì)胞器，不易提取血紅蛋白。為防止血液凝固，在采血容器中要預(yù)先加入抗凝血?jiǎng)幟仕徕c。樣品的處理包括紅細(xì)胞洗滌、血紅蛋白的釋放、分離血紅蛋白溶液。洗滌紅細(xì)胞的目的是去除雜質(zhì)蛋白，以利于后續(xù)步驟分離純化。重復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒(méi)有黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。采集的血樣要及時(shí)分離紅細(xì)胞，分離時(shí)采取低速短時(shí)間離心，如500 r/min離心2 min。若離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一起沉淀，得不到純凈紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白提取的純度。 溫馨提示：最好仔細(xì)閱讀后才下載使用，萬(wàn)分感謝！