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實(shí)驗(yàn)1 大腸桿菌的培養(yǎng)和分離 微生物包括哪五類 病毒細(xì)菌放線菌真菌原生生物 特點(diǎn) 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單 形體微小 通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到 有的甚至沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu) 且體內(nèi)一般不含有葉綠素 不能進(jìn)行光合作用 原核生物界 原生生物界 真菌界 病毒界 一 基礎(chǔ)知識(shí) 一 微生物 大腸桿菌 E coli 分布 人和哺乳動(dòng)物腸道 此外還廣泛分布于水 污水 土壤 谷類 乳制品等當(dāng)中 大腸桿菌在人體的 中一般對(duì)人體無害 但任何大腸桿菌如果進(jìn)入 都會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害 大腸桿菌是 工程中被廣泛采用的工具 腸道 泌尿系統(tǒng) 基因 革蘭氏 填陰或陽 性菌 陰 代謝類型 異養(yǎng) 兼性厭氧型 生長適宜溫度 質(zhì)粒 EcoR 限制酶 E coli DNA連接酶 受體細(xì)胞 37 左右 細(xì)菌的代謝類型 自養(yǎng)型細(xì)菌異養(yǎng)型細(xì)菌 光合自養(yǎng)型 化能自養(yǎng)型 大部分腐生菌和寄生菌 如藍(lán)細(xì)菌 如硝化細(xì)菌 1 同化作用類型 2 異化作用類型 需氧型細(xì)菌厭氧型細(xì)菌兼性厭氧型細(xì)菌 大多數(shù)細(xì)菌 如破傷風(fēng)桿菌 如酵母菌 大腸桿菌 大腸桿菌屬于異養(yǎng) 兼性厭氧型細(xì)菌 大腸桿菌 酵母菌 放線菌 霉菌 菌落 單個(gè)或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量生長繁殖時(shí) 所形成的肉眼可見的具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體 不同微生物形成的菌落具有不同的特征 是鑒定菌種的重要依據(jù) 如菌落的大小 形狀 邊緣 光澤度 顏色 透明度等 菌落的概念 白色或乳白色 光滑 大腸桿菌菌落 芽孢 有些細(xì)菌在一定的條件下 細(xì)胞里面形成一個(gè)橢圓形的休眠體 叫做芽孢 芽孢的壁很厚 對(duì)干旱 低溫 高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力 例如 有的細(xì)菌的芽孢 煮沸3小時(shí)以后才死亡 芽孢又小又輕 可以隨風(fēng)飄散 當(dāng)環(huán)境適宜 如溫度 水分適宜 的時(shí)候 芽孢又可以萌發(fā) 形成一個(gè)細(xì)菌 一 基礎(chǔ)知識(shí) 二 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基 培養(yǎng)液 是由人工方法配制而成的 專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)液 1 按物理狀態(tài)分 固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基 半固體培養(yǎng)基 2 按功能分 選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基 3 按成分分 天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基 1 培養(yǎng)基的類型和用途 液體培養(yǎng)基 表面生長 均勻混濁生長 沉淀生長 固體培養(yǎng)基 菌落 菌苔 半固體培養(yǎng)基 無動(dòng)力有動(dòng)力 彌散 是否運(yùn)動(dòng) 選擇培養(yǎng)基 加入青霉素的培養(yǎng)基 分離酵母菌 霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基 分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基 分離固氮菌不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基 分離自養(yǎng)型微生物加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基 分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞加入氨基喋呤 次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基 分離雜交瘤細(xì)胞 天然培養(yǎng)基有血清 血漿 和組織提取液 如雞胚和牛胚浸液 優(yōu)點(diǎn) 營養(yǎng)成分豐富 培養(yǎng)效果好缺點(diǎn) 來源受限 成分復(fù)雜 影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析 易發(fā)生支原體污染 根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量 用人工方法模擬合成的 合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸 維生素 碳水化合物 無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì) 優(yōu)點(diǎn) 標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn) 組分和含量相對(duì)固定 成本低缺點(diǎn) 缺少某些成分 不能完全滿足體外細(xì)胞生長需要 合成培養(yǎng)基 天然培養(yǎng)基 血清中含有 多種蛋白質(zhì) 白蛋白 球蛋白 鐵蛋白等 多種金屬離子 激素 促貼附物質(zhì) 如纖粘蛋白 冷析球蛋白 膠原等 各種生長因子 轉(zhuǎn)移蛋白 不明成分 人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存 要想使細(xì)胞生長和繁殖 還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基 如血清 培養(yǎng)基的用途 液體培養(yǎng)基 增菌 常用于發(fā)酵工業(yè)固體培養(yǎng)基 增菌 菌種保存及分離純化 鑒定菌落 活菌計(jì)數(shù)等半固體培養(yǎng)基 動(dòng)力檢測(cè) 保種 不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方 調(diào)節(jié)pH 2 成分 水 碳源 氮源 無機(jī)鹽 生長因子 生長因子即細(xì)菌生長必需 而自身不能合成的化合物 如維生素 某些氨基酸 嘌呤 嘧啶 真菌 5 6細(xì)菌 6 5 7 5 有時(shí)會(huì)加一定量的氯化鈉以維持一定的滲透壓 1 無菌操作的概念 無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中 所有防止 污染的方法 四 無菌操作 必須無菌 也必須要無菌 時(shí)不能帶入其他雜菌 主要包括 雜菌 2 消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別 消毒 使用較溫和理化因素 僅殺死物體表面或內(nèi)部的一部分對(duì)人體有害的微生物的過程 不能殺死芽孢和孢子 滅菌 使用強(qiáng)烈的理化因素消滅物體內(nèi)外所有微生物 包括芽孢和孢子 各種器具 培養(yǎng)基 轉(zhuǎn)移菌種 比較消毒與滅菌 較為溫和 部分生活狀態(tài)的微生物 不能 能 全部微生物 強(qiáng)烈 高壓蒸汽滅菌 濕熱滅菌 灑精燈灼燒滅菌干熱滅菌 1 滅菌方法 3 常用的滅菌和消毒的方法 培養(yǎng)基 無菌水 各種耐高溫的玻璃金屬器具100kPa 121 下維持15 30min 需要保持干燥耐高溫的玻璃金屬器皿160 170 下加熱1 2h 接種環(huán)等金屬器具 1 煮沸消毒法 100 煮沸5 6min2 巴氏消毒法 70 75 下煮30min或80 下煮15min3 化學(xué)藥劑消毒法 用75 酒精 新潔爾滅等進(jìn)行皮膚消毒 氯氣消毒水源4 紫外線消毒 2 消毒的方法 3 常用的消毒與滅菌的方法 請(qǐng)你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌 如果需要 請(qǐng)選擇合適的方法 1 培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿 2 玻棒 試管 燒瓶和吸管 3 實(shí)驗(yàn)操作者的雙手 答 1 2 需要滅菌 3 需要消毒 一 制備LB培養(yǎng)基 通用的細(xì)菌培養(yǎng)基 1 配方 蛋白胨0 5克 酵母提取物0 25克 氯化鈉0 5克 水50ml 配固體培養(yǎng)基再加瓊脂1克 溶解 計(jì)算稱量 調(diào)pH 分裝 加塞 包扎 2 流程 二操作步驟 滅菌 倒平板 分裝 注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上 因此在將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到三角瓶或試管中時(shí)必須用 加塞 試管用塑料蓋或 三角瓶口用 或 封口 再用 或報(bào)紙封口 包扎 用 或報(bào)紙 三角漏斗 棉花塞 封口膜 6層紗布 牛皮紙 牛皮紙 高壓蒸氣滅菌法 滅菌 1 加水 2 裝鍋 向外層鍋內(nèi)加入適量的水 加水的要求是 物品放置的要求 加蓋 將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層滅菌桶的 內(nèi) 再以 方式同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺栓 使螺栓松緊一致 勿使漏氣 不觸及內(nèi)膽 整齊 穩(wěn)定 留出空隙 排氣槽 兩兩對(duì)稱 3 加熱排氣 4 保溫保壓 5 出鍋 打開排氣閥 使水沸騰以排除鍋內(nèi)的 后 關(guān)上排氣閥 當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到 kg cm2時(shí) 控制熱源 維持壓力至 min 切斷電源 讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降 當(dāng)壓力降至 時(shí) 打開 旋松螺栓 打開蓋子 取出滅菌物品 冷空氣 待冷空氣完全排盡 0 1 15 排氣閥 否則會(huì)因鍋內(nèi)壓力較高 打開氣閥后造成的壓力差可能使容器內(nèi)的培養(yǎng)基噴濺造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染 甚至使容器爆炸 滅菌后 通常將實(shí)驗(yàn)用具放入60 80 中烘干 以除去滅菌時(shí)的水分 避免引起 烘箱 污染 倒平板 待培養(yǎng)基冷卻至 時(shí) 將每只培養(yǎng)皿倒入 ml未凝固的固體培養(yǎng)基 置于 位置上 輕輕晃動(dòng)使其均勻鋪滿平皿底部 待凝 使之形成平面 備用 制斜面 將未凝固的固體培養(yǎng)基的試管 放 冷卻待凝使即成為斜面 10 12 水平 倒置 斜 倒平板 制斜面操作平臺(tái) 滅菌好的培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)器具置于超凈臺(tái)上打開 和 滅菌30min 過濾風(fēng) 紫外線 超凈臺(tái) 思考題 A 操作過程中避免帶入雜菌的方法有哪些 1 滅菌后的培養(yǎng)基 器具置于超凈臺(tái)上 并打開超凈臺(tái)的紫外燈和過濾風(fēng) 滅菌30分鐘 2 用鑷子夾出灑精棉球擦拭桌面和實(shí)驗(yàn)者雙手 3 整個(gè)操作在酒精燈火焰旁進(jìn)行4 打開后或加塞前試管口 三角瓶口灼燒滅菌 B 培養(yǎng)基滅菌后 需要冷卻到60后才倒平板 你用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度呢 可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶 感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí) 就可以進(jìn)行倒平板了 思考題 C 為何要將平板倒置 平板冷凝后 皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠 凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高 將平板倒置 既可以使培養(yǎng)基面的水分更好地?fù)]發(fā) 又可以防止皿蓋上的水珠落培養(yǎng)基 造成污染 D 在倒平板的過程中 如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位 這個(gè)平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎 為什么 空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生 因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物 E 如何檢查培養(yǎng)基是否受雜菌的污染 將未接種的培養(yǎng)基放在恒溫箱中培養(yǎng) 若無菌落產(chǎn)生則未受雜菌污染 二 液體培養(yǎng)基接種培養(yǎng) 主要器具 操作方法 先將接種環(huán)進(jìn)行 滅菌 后的接種環(huán)挑取少量菌種 放入三角瓶的液體培養(yǎng)基中 加塞 置于 搖床振蕩培養(yǎng) 小時(shí) 無菌操作 略 搖床 思考 如何冷卻接種環(huán) 可通過接觸試管內(nèi)壁或未長菌的培養(yǎng)基達(dá)到冷卻的目的 接種環(huán) 搖床等 灼燒 冷卻 三 平板劃線分離法 主要器具 操作過程 注意 無菌操作方法 同前 將培養(yǎng)皿 蓋在下 放于 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 小時(shí) 在作第二次以及其后的劃線操作時(shí) 要從上一次劃線的開始 劃線 接種環(huán) 思考 若如上圖所示進(jìn)行劃線分離 則接種環(huán)總共進(jìn)行幾次灼燒滅菌 恒溫培養(yǎng)箱 每次劃線前接種環(huán)都要灼燒滅菌 再冷卻 末端 倒置 平板劃線的操作方法交叉劃線法連續(xù)劃線法 1 為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán) 操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物 每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后 接種環(huán)上殘留的菌種 使下一次劃線時(shí) 接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端 從而通過劃線次數(shù)的增加 使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少 以便得到單個(gè)菌落 2 在劃線操作結(jié)束時(shí) 仍然需要灼燒接種環(huán)嗎 為什么 劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán) 及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種 避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者 3 在灼燒接種環(huán)之后 為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線 以免接種環(huán)溫度太高 殺死菌種 4 在作第二次以及其后的劃線操作時(shí) 為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線 劃線后 線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少 每次從上一次劃線的末端開始 能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少 最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來的菌落 5 如何判斷接種操作是否符合無菌要求 如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色 形狀 大小基本一致 并符合大腸桿菌菌落的特點(diǎn) 則說明接種操作是符合要求的 如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落 則說明接種過程中 無菌操作還未達(dá)到要求 四 稀釋涂布平板法 主要器具 玻璃三角刮刀 移液管或吸管 操作過程 先將培養(yǎng)菌液稀釋 10 5 10 7倍 用移液管或吸管取0 1ml稀釋度不同的菌液 加在平板上 用無菌玻璃三角刮刀均勻涂布在培養(yǎng)基平面上 在適當(dāng)稀釋度下 可培養(yǎng)得到相互分開的的菌落 將培養(yǎng)皿倒置 蓋在下 放于 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 小時(shí) 劃線分離方法簡(jiǎn)單 涂布分離 易形成單菌落 但操作復(fù)雜些 10g土樣 從土壤中分離微生物 稀釋涂布法 五 斜面接種及菌種保存 主要器具 操作過程 在無菌操作下 用接種環(huán)挑取 菌落 再用劃線法 自斜面底部向上輕輕劃直線 接種在 上 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 小時(shí)后 冰箱保存 無菌操作 同前 試管斜面培養(yǎng)基密閉效果比平面的好很多 不容易進(jìn)入雜菌 同時(shí)能用來做純細(xì)菌的長期保存 思考 菌種保存為何采用斜面而不是平板 接種環(huán) 恒溫箱 冰箱 單 斜面 菌種的保存 1 臨時(shí)保藏 接種到固體斜面培養(yǎng)基 菌落長成后置于4 冰箱保存 2 長期保存 甘油冷凍管藏法 思考題 利用培養(yǎng)基技術(shù)不僅可以分離微生物 也可以進(jìn)行植物組織培養(yǎng) 請(qǐng)簡(jiǎn)要說明這兩項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用設(shè)計(jì)思路的相同點(diǎn)以及區(qū)別 相同點(diǎn) 都是從培養(yǎng)對(duì)象所需的營養(yǎng)條件出發(fā) 配置適宜培養(yǎng)基 都要求嚴(yán)格的無菌條件 不同點(diǎn) 植物組織培養(yǎng)往往還要加入激素 例1 關(guān)微生物營養(yǎng)物質(zhì)的敘述中 正確的A 是碳源的物質(zhì)不可能同時(shí)是氮源B 凡碳源都提供能量C 除水以外的無機(jī)物只提供無機(jī)鹽D 無機(jī)氮源也能提供能量 D 例2 右表是某微生物培養(yǎng)基成分 請(qǐng)據(jù)此回答 1 右表培養(yǎng)基可培養(yǎng)的微生物類型是 2 若不慎將過量NaCl加入培養(yǎng)基中 如不想浪費(fèi)此培養(yǎng)基 可再加入 自養(yǎng)型微生物 含碳有機(jī)物 超凈工作臺(tái) 紫外燈過濾風(fēng) 實(shí)驗(yàn)一大腸桿菌的培養(yǎng)和分離 實(shí)驗(yàn)步驟 一配制LB培養(yǎng)基 溶解 計(jì)算稱量 調(diào)pH 分裝 加塞 包扎 滅菌 二 倒平板 制斜面 三大腸桿菌的培養(yǎng) 三大腸桿菌的分離 平板劃線分離法 或稀釋涂布平板法 使所需細(xì)菌大量繁殖 獲得單菌落 純化菌株 四斜面接種培養(yǎng) 目的菌株的純培養(yǎng)和菌種保存