WB檢測(cè)蛋白實(shí)驗(yàn)報(bào)告范本 - 上海秉新生物科技有限公司

時(shí)間就是金錢，效率就是生命！實(shí)驗(yàn)報(bào)告書項(xiàng)目名稱：Western blotting檢測(cè)組織中蛋白表達(dá)客戶姓名：合同號(hào)：項(xiàng)目負(fù)責(zé)人一、 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑表格一：實(shí)驗(yàn)儀器儀器廠家型號(hào)小型垂直電泳槽Biorad164-8001轉(zhuǎn)印槽BioradTrans-Blot脫色搖床常州澳華TY-80B電泳儀上海天能EPS-200低溫高速離心機(jī)64RBECKMAN酶標(biāo)儀 Thermo ScientificMultiskan Spectrum表格二：試劑試劑廠家RIPA裂解液碧云天PMSFAmrescoBCA蛋白定量試劑盒ThermoTrisAmresco甘氨酸Amresco鹽酸國藥集團(tuán)甲醇國藥集團(tuán)Tween 20國藥集團(tuán)SDS國藥集團(tuán)TEMEDSigmaBSASigmaPVDF膜MilliporeHRP標(biāo)記的羊抗小鼠二抗聯(lián)科生物化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑ThermoGAPDH鼠單克隆抗體聯(lián)科生物預(yù)染蛋白marker碧云天X光膠片柯達(dá)二、 實(shí)驗(yàn)步驟1、 組織中蛋白上清液的制備和濃度測(cè)定(1) 把組織剪切成細(xì)小的碎片；(2) 加入200L裂解液，在勻漿機(jī)中研磨，直至裂解液中組織消失；(3) 充分裂解后，12000rpm離心5min，取上清。(4) 取部分上清蛋白用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，按如下步驟： 按試劑盒說明書將A液和B液以50：1的比例配制成工作液；取2000g/mL的BSA標(biāo)準(zhǔn)品，用PBS(pH 7.4)稀釋成2000g/mL、1500g /mL、1000g/mL、750g/mL、500g/mL、250g/mL、125g/mL、25g/mL、0g/mL共9個(gè)濃度梯度；取上清液10L，用PBS稀釋20倍；每管中加20L蛋白標(biāo)準(zhǔn)品或稀釋后的上清液，再加上述工作液0.2mL，37孵育30min，562nm處測(cè)吸光度，記錄OD值；根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及相應(yīng)OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算樣品總蛋白濃度（mg/mL）樣品123456789OD值0.8176110.4384120.6577160.6756170.3625680.8177740.6880890.4775460.6275110.9913140.5170180.8148460.7480830.4604700.6229990.5744480.4045160.700393均值0.9044620.4777150.7362810.7118500.4115190.7203860.6312680.4410310.663952濃度 mg/mL21.469.2716.6615.967.3816.2113.668.2214.592、Western-Blot檢測(cè)總蛋白中目的蛋白表達(dá)。(1) 灌膠蒸餾水清洗灌膠玻璃板，豎直晾干。配制13分離膠10mL，加TEMED10L、10過硫酸銨100L，混勻后立即灌膠，灌至齒梳下緣23mm（事先做好標(biāo)記），用異丙醇封閉液面以去除氣泡并隔絕空氣，室溫靜置45min待膠完全聚合。待分離膠完全聚合后，傾去其頂部的去離子水，用濾紙將水吸干。配制4濃縮膠 5 mL，加TEMED 5 L、10APS 50 L，混勻立即灌膠，灌至頂部，并垂直插入Teflon齒梳，室溫靜置 20 min待膠聚合。待膠完全聚合后拔出梳子，將凝膠置于電泳槽中，加入電泳緩沖液，用電泳緩沖液沖洗上樣孔以去除氣泡。(2) 電泳取各個(gè)處理組蛋白提取液，調(diào)整蛋白濃度為6g/L，和等體積2×上樣緩沖液混合，即為上樣液。將上樣液于100沸水中煮沸5min，使蛋白變性，冰上驟冷，3000轉(zhuǎn)/min離心1min。每孔加上樣液15L，留一孔加10L預(yù)染的Marker。加滿電泳緩沖液，蓋上槽蓋，接通電源，先用80v恒壓電泳，約20min，當(dāng)指示劑溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后改用110v恒壓電泳，當(dāng)指示劑到達(dá)距凝膠下端約0.5cm處時(shí)關(guān)閉電源，取出膠板。(3) 轉(zhuǎn)印蛋白及免疫檢測(cè)在電泳即將結(jié)束前，預(yù)先將PVDF膜浸泡在甲醇中15s，然后用ddH2O漂洗2min，浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中5min后開始后續(xù)操作。在水中撬膠，修膠后將膠浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡15min。按黑面（負(fù)極）海綿濾紙膠PVDF膜濾紙海綿紅面（正極）的順序制備轉(zhuǎn)膜“三明治”，每層鋪好后先趕走氣泡再鋪另一層。在轉(zhuǎn)移緩沖液中制備三明治可避免氣泡的產(chǎn)生。接上正負(fù)極，按膜向正極的方向?qū)⑥D(zhuǎn)移盒放入電轉(zhuǎn)儀中，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液。將電轉(zhuǎn)儀置于冰水中，100V恒壓轉(zhuǎn)膜1h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，快速取出PVDF膜，放入5%BSA室溫封閉2h。取出膜，于搖床上用TBST洗膜5min×3次。孵育袋中加入TBST稀釋的一抗（1：500）4孵育過夜。TBST洗膜5min×3次，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗小鼠二抗（1：3000），室溫孵育1h。TBST洗膜10min×3次。膜于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑反應(yīng)至暗處出現(xiàn)亮條帶，取出膜，甩去多余的液體，用保鮮膜包好PVDF膜，暗室中用X膠片感光、顯影、定影。三、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果目的蛋白GAPDH 樣本編號(hào)123456789目的蛋白66025696137267770136001257421220162374175GAPDH488884054937709315313964428507326204022325951目的蛋白/GAPDH1234567890.1350.14050.3640.24640.34310.44110.65050.4040.1609唯有惜時(shí)才能成功，唯有努力方可成就！