過(guò)氧化物酶(POD)同工酶聚丙烯酰胺凝膠電泳.doc

過(guò)氧化物酶(POD)同工酶聚丙烯酰胺凝膠電泳一、目的1、了解聚丙烯酰胺凝膠電泳原理。2、了解聚丙烯酰胺凝膠的制作過(guò)程。3、了解過(guò)氧化物酶同工酶電泳過(guò)程。二、實(shí)驗(yàn)原理：1、聚丙烯酰胺凝膠電泳原理及影響電泳的主要因素帶電粒子在電場(chǎng)中向與其自身帶相反電荷的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱(chēng)為電泳。用電泳技術(shù)分離、分析蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物大分子，有較高的分辨率，目前已成為生物科學(xué)研究中必不可少的手段之一。帶電離子在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速度（1）和遷移率（泳動(dòng)度）（2）V=Eqa(1)6ru=qa(2)6r由（2）式可以看出，凡能影響溶液粘度的因素如溫度，影響分子帶電量q及解離度a的因素如pH的改變，都會(huì)對(duì)遷移率產(chǎn)生影響。因此，電泳應(yīng)盡可能在恒溫條件下進(jìn)行。并選用一定pH的緩沖液。同時(shí)，所選用的pH以能擴(kuò)大各種被分離物質(zhì)所帶電荷量的差異為好，以利于分離各種成分。遷移率與粒子的大?。╮）有關(guān)，非球形粒子（如DNA）在電泳過(guò)程中會(huì)受到更大的阻力，即粒子的移動(dòng)速度還與粒子形狀有關(guān)。另外，遷移率還受電滲現(xiàn)象的影響。所謂電滲是指在電場(chǎng)中，液體對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng)。例如在紙電泳中，由于濾紙（纖維素）上帶有負(fù)電荷，因感應(yīng)相吸而使與濾紙相接觸的水溶液帶正電荷，從而使液體向負(fù)極移動(dòng)，帶動(dòng)著本來(lái)是向負(fù)極泳動(dòng)的物質(zhì)以更快的速度移動(dòng)。因此，電泳時(shí)應(yīng)避免用高電滲物質(zhì)作支持介質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠結(jié)構(gòu)中不帶電荷，在電場(chǎng)中電滲現(xiàn)象極為微小。這些特點(diǎn)，使得聚丙烯酰胺凝膠適合作區(qū)帶電泳的支持介質(zhì)。最后，要考慮選用離子強(qiáng)度適宜的溶液。一般低離子強(qiáng)度比較合適，因?yàn)榇藭r(shí)導(dǎo)電性低，產(chǎn)生的熱量較少。同時(shí)可使被分離的帶電離子對(duì)電流貢獻(xiàn)最大從而加快電泳速度。但也不能過(guò)低，它必須可以緩沖被分離樣品中帶電離子對(duì)凝膠pH的影響，且過(guò)低的離子強(qiáng)度易導(dǎo)致蛋白質(zhì)凝聚。一般最適的離子強(qiáng)度在0.010.1mol/L之間。最常見(jiàn)的為0.05。在稀溶液中，離子強(qiáng)度可用下式計(jì)算：1/2miZi2 (3)（3)式中，mi為離子的摩爾濃度，Zi為離子的價(jià)數(shù)。（1）式中泳動(dòng)速度V除了上述影響因素外，還與電場(chǎng)強(qiáng)度E成正比。2、聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為載體的一種區(qū)帶電泳。這種凝膠是以丙烯酰胺單體（Acrylamide，簡(jiǎn)寫(xiě)為Acr）和交聯(lián)劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺（N,N-Methylena Bisacrylamide，簡(jiǎn)寫(xiě)為Bis）在催化劑的作用下聚合而成的。Acr和Bis在它們單獨(dú)存在或混合在一起時(shí)是穩(wěn)定的，且具有神經(jīng)毒性，操作時(shí)應(yīng)避免接觸皮膚。但在具有自由基團(tuán)體系時(shí)，它們聚合。引發(fā)產(chǎn)生自由基團(tuán)的方法有兩種，即化學(xué)法和光化學(xué)法?；瘜W(xué)聚合的引發(fā)劑是過(guò)硫酸銨 (NH4)2S2O3（Ammonium persulfate，簡(jiǎn)寫(xiě)為Ap），催化劑是N，N，N,N-四甲基乙二胺（Tetramethylenediamine，簡(jiǎn)寫(xiě)為T(mén)EMED）。在催化劑TEMED的作用下，由過(guò)硫酸銨（Ap）形成的自由基又使單體形成自由基，從而引起聚合作用。冷卻可使聚合速度變慢；一些金屬抑制聚合；分子氧阻止鏈的延長(zhǎng)，防礙聚合作用。這些因素在實(shí)際操作時(shí)都應(yīng)予以控制。光聚合以光敏感物核黃素（即VB2）作為催化劑，在痕量氧存在下，核黃素經(jīng)光解形成無(wú)色基，無(wú)色基被氧再氧化成自由基，從而引起聚合作用。聚丙烯酰胺的基本結(jié)構(gòu)，為丙烯酰胺單位構(gòu)成的長(zhǎng)鏈，鏈與鏈之間通過(guò)甲叉橋聯(lián)結(jié)在一起。鏈的縱橫交錯(cuò)，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使凝膠具有分子篩性質(zhì)。網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)還能限制蛋白質(zhì)等樣品的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，使凝膠具有良好的抗對(duì)流作用。此外，長(zhǎng)鏈上富含酰胺基團(tuán)，使其成為穩(wěn)定的親水凝膠。聚丙烯酰胺凝膠的質(zhì)量主要由凝膠濃度和交聯(lián)度決定。每100mL凝膠溶液中含有的單體（Acr）和交聯(lián)劑（Bis）總克數(shù)稱(chēng)為凝膠濃度，用T表示。凝膠溶液中，交聯(lián)劑（Bis）占單體（Acr）和交聯(lián)劑（Bis）總量的百分?jǐn)?shù)稱(chēng)為交聯(lián)度，用C表示。改變凝膠濃度以便適應(yīng)各種樣品的分離。一般常用7.5濃度的聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)，而用2.4%的分離核酸。但根據(jù)蛋白質(zhì)與核酸分子量不同，適用的濃度也不同（見(jiàn)表1）。表1 凝 膠 濃 度 選 用 表物 質(zhì)分 子 量 范 圍適用的凝膠濃度(%)蛋 白 質(zhì) 104 2030 11044104 1520 41041105 1015 11055105 510 5105 25核 酸 104 1520 104105 510 1052106 22.63、不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：（1）凝膠板由上、下兩層膠組成，兩層凝膠的孔徑不同。上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠。濃縮膠：又稱(chēng)堆積膠。凝膠濃度較小，孔徑相對(duì)較大。把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過(guò)大孔徑凝膠的遷移作用樣品被濃縮成一個(gè)狹窄的區(qū)帶，使樣品組分在分離膠中得以高分辨率的被分離。分離膠:又稱(chēng)電泳膠，通?？讖捷^小，通過(guò)選擇合適的凝膠濃度，使樣品組分得以很好地分離。分離膠又分為均一膠和梯度膠。（2）緩沖液離子組成及各層凝膠的pH不同。本實(shí)驗(yàn)采用堿性系統(tǒng)。電極緩沖液為pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液，濃縮膠為pH6.7的Tris-HCl緩沖液。而分離膠為pH8.9的Tris-HCl緩沖液。（3）在電場(chǎng)中形成不連續(xù)的電位梯度。在這樣一個(gè)不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng)，即電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和濃縮效應(yīng)。在這三種效應(yīng)的共同作用下，待測(cè)物質(zhì)被很好地分離開(kāi)來(lái)。下面以本實(shí)驗(yàn)要分離的豆芽或土豆過(guò)氧化物酶同工酶為例，分別說(shuō)明三種效應(yīng)的作用：（1）電荷效應(yīng)：各種酶蛋白按其所帶電荷的性質(zhì)及數(shù)量，在電場(chǎng)作用下向一定電極，以一定速度泳動(dòng)。（2）分子篩效應(yīng)：分子量小，形狀為球形的分子在電泳過(guò)程中受到阻力較小，移動(dòng)較快；反之，分子量大、形狀不規(guī)則的分子，電泳過(guò)程中受到的阻力較大，移動(dòng)較慢。這種效應(yīng)與凝膠過(guò)濾過(guò)程中的情況不同。（3）濃縮效應(yīng)：待分離樣品中的各組分在濃縮膠中會(huì)被壓縮成層，而使原來(lái)很稀的樣品得到高度濃縮。其原因如下： 由于兩層凝膠孔徑不同，酶蛋白向下移動(dòng)到兩層凝膠界面時(shí)，阻力突然加大，速度變慢。使得在該界面處的待分離酶蛋白區(qū)帶變窄，濃度升高。 在聚丙烯酰胺凝膠中，雖然濃縮膠和分離膠用的都是Tris-HCl緩沖液，但上層濃縮膠為pH 6.7，下層分離膠為pH 8.9。HCl是強(qiáng)電解質(zhì)，不管在哪層膠中，HCl幾乎都全部電離，Cl布滿整個(gè)膠板。待分離的酶蛋白樣品加在樣品槽中，浸在pH8.3和Tris-甘氨酸緩沖液中。電泳一開(kāi)始，遷移率最大的Cl迅速跑到最前邊，成為快離子（前導(dǎo)離子）。在pH6.7條件下解離度僅有0.11的甘氨酸（pI = 6.0 ）遷移率最低，跑在最后邊，成為慢離子（尾隨離子）。這樣，快離子和慢離子之間就形成了一個(gè)不斷移動(dòng)的界面。在pH6.7條件下帶有負(fù)電荷的酶蛋白，其遷移率介于快慢離子之間，被夾持分布于界面附近，逐漸形成一個(gè)區(qū)帶。由于快離子快速向前移動(dòng)，在其原來(lái)停留的那部分地區(qū)成了低離子濃度區(qū)，即低電導(dǎo)區(qū)。因?yàn)殡娢惶荻萔、電流強(qiáng)度I和電導(dǎo)率S之間有如下關(guān)系：VI/S (4)所以在電流恒定條件下低電導(dǎo)區(qū)兩側(cè)就產(chǎn)生了較高的電位梯度。這種在電泳開(kāi)始后產(chǎn)生的高電位梯度作用于酶蛋白和甘氨酸慢離子加速前進(jìn)，追趕快離子。本來(lái)夾在快慢離子之間的酶蛋白區(qū)帶，在這個(gè)追趕中被逐漸地壓縮聚集成一條更為狹窄的區(qū)帶。這就是所謂的濃縮效應(yīng)。當(dāng)酶蛋白和慢離子都進(jìn)入分離膠后，pH從6.7變?yōu)?.9，甘氨酸解離度劇增，遷移率迅速加大，從而趕上并超過(guò)所有酶蛋白分子。此時(shí)，快慢離子的界面跑到被分離的酶蛋白之前，不連續(xù)的高電位梯度不再存在。于是，此后的電泳過(guò)程中，酶蛋白在一個(gè)均一的電位梯度和pH條件下，僅按電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)而被分離。與連續(xù)系統(tǒng)相比，不連續(xù)系統(tǒng)的分辨率大大提高，因此已成為目前廣泛使用的分離分析手段。4、過(guò)氧化物酶同工酶電泳同工酶是指其催化的化學(xué)反應(yīng)相同，而酶的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)乃至免疫性質(zhì)不同的一組酶。植物在發(fā)育過(guò)程中，所含同工酶的種類(lèi)和比例都不相同，它們與植物的遺傳、生長(zhǎng)發(fā)育、代謝調(diào)節(jié)及抗性等都有一定關(guān)系，因此作為基因表達(dá)的產(chǎn)物，測(cè)定同工酶譜是認(rèn)識(shí)基因存在和表達(dá)的一種工具，在植物的種群、發(fā)育及雜交遺傳的研究中有重要的意義。過(guò)氧化物酶是植物體內(nèi)普遍存在的、活性較高的一種酶。它與呼吸作用、光合作用及生長(zhǎng)素的氧化等都有關(guān)系。在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中它的活性不斷發(fā)生變化，測(cè)定這種酶的活性或其同工酶，可以反映某一時(shí)期植物體內(nèi)代謝的變化。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定同工酶，方法簡(jiǎn)便，靈敏度高，重現(xiàn)性強(qiáng)，測(cè)定結(jié)果便于觀察、記錄和保存。本實(shí)驗(yàn)采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳技術(shù)，分離、鑒定土豆、豆芽過(guò)氧化物酶同工酶。同工酶染色：根據(jù)酶的生物化學(xué)反應(yīng)，通過(guò)染色方法顯示出酶的不同區(qū)帶。過(guò)氧化物酶能催化過(guò)氧化氫使聯(lián)苯胺氧化成藍(lán)色或棕色產(chǎn)物，據(jù)此即可將該酶在凝膠中顯色定位。三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器與試劑1、材料土豆和豆芽2、儀器：DYCZ-24E電泳槽、DYY-11型和DYY-12型三恒多用電泳儀、臺(tái)式高速離心機(jī)、微量進(jìn)樣器、芬蘭可調(diào)移液器，研缽，50mL燒杯，量筒、大培養(yǎng)皿等玻璃器皿。3、試劑：電泳試劑貯存液配置見(jiàn)附表(附表1)。染色液成分：抗壞血酸70.4mg,聯(lián)苯胺溶液(2g聯(lián)苯胺溶于18mL溫?zé)岜姿嶂?再加入蒸餾水72mL)20mL,0.6%(或1.2%)過(guò)氧化氫20mL,蒸餾水60mL。四、實(shí)驗(yàn)步驟：1.安裝制膠模具（教師演示，學(xué)生安裝）注意事項(xiàng)：在整個(gè)過(guò)程中要輕拿輕放，以免將玻璃板弄碎。2.制作分離膠(濃度10%)分離膠配方(濃度10%):pH8.9 Tris-HCl溶液:0.8mL 分離膠PAG溶液:1.2mL 蒸餾水:1.6mL 10%TEMED:40l 10%AP: 40l將上述溶液充分混勻,立即全部倒入安裝好的制膠玻板中,為使分離膠界面平整,可在倒入分離膠后約5min后在其表面沿高板緩慢均勻加入0.5mL蒸餾水并將電泳槽輕輕敲擊桌面。再靜置40min左右,讓分離膠凝聚完全。3.制作濃縮膠(濃度2.4%)濃縮膠配方(濃度2.4%):pH6.7 Tris-HCl溶液:0.42 mL 濃縮膠PAG溶液:1.25mL 40%蔗糖溶液:1.25mL 10%TEMED:30l 10%AP: 30l將上述溶液充分混勻,在聚合完全的分離膠上,倒入濃縮膠,（注意在倒入濃縮膠前要去掉分離膠表層的水）同時(shí)插入梳子,直到溶液裝滿和梳子插平為止。再靜置40min左右,濃縮膠聚合完全后為乳白色。注意事項(xiàng)：A、在整個(gè)過(guò)程中要將制膠模具垂直放在桌面上，不容許傾斜。B、充分混勻的（分離膠或濃縮膠）溶液應(yīng)盡快用移液槍延高板的一側(cè)慢慢加入膠板中C、膠制作完成后，松開(kāi)卡板取下橡膠皮，然后再用卡板卡緊膠板。要注意低板在內(nèi)側(cè)。4.制樣取適量(2g)的馬鈴薯于研缽中,加1mL的PBS(磷酸緩沖液,pH7.4),于冰上研磨至勻漿狀,收集在1.5mL的離心管中,在臺(tái)式離心機(jī)中以8000rpm離心5min，取上清,即為粗酶提取液,其中含有所需的POD。另外,豆芽研磨可取4g左右,同樣加入1mL的PBS。5.點(diǎn)樣在濃縮膠聚合完畢后,小心取出梳子,兩拇指和食指捏住梳子的柄,其余三指頂住制膠框兩側(cè),勻速地拔出梳子,然后向電泳槽中倒入預(yù)冷的電極緩沖液（原液要稀釋10倍）,緩沖液要沒(méi)過(guò)低板。點(diǎn)樣前,要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理,即把粗酶提取液與甘油溴酚藍(lán)指示劑以4:1混合,用50l的微量點(diǎn)樣器吸取樣品20l,將點(diǎn)樣器的針頭小心插入到點(diǎn)樣孔底部,慢慢注入樣品,要注意防止漂樣。6.電泳點(diǎn)樣完畢后,連接好導(dǎo)線(正負(fù)電極不要接反,紅色為正極,黑色為負(fù)極),將電壓調(diào)至70 V,當(dāng)溴酚藍(lán)標(biāo)志線移至濃縮膠與分離膠分界處,將電壓調(diào)至150V,電泳2-3小時(shí),當(dāng)溴酚藍(lán)標(biāo)志線剛好跑出膠板時(shí),結(jié)束電泳。7.取膠切斷電源,取出緩沖液并低溫保存,可重復(fù)使用2次。然后松開(kāi)卡板，取出凝膠板,用解剖刀扁平部分插入玻板的一角(是分離膠的一角),輕輕撬去一塊玻板,用刀切掉分離膠右下角以示點(diǎn)樣順序,輕輕撬起分離膠,使之滾入染色培養(yǎng)皿中。8.染色POD染色步驟如下：先用自來(lái)水溶液潤(rùn)洗兩遍,再加入30-40mL的染色液,室溫下放置5-20min,至顯色完全。9.清洗玻璃板、膠皮、電泳槽。五、注意事項(xiàng)：1.在整個(gè)清洗過(guò)程中要輕拿輕放，以免將玻璃板弄碎。同時(shí)，清洗玻璃板不容許用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿以及酒精溶液，一般用清水加一點(diǎn)洗滌劑進(jìn)行清洗，然后用去離子水或蒸餾水潤(rùn)洗。2.在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，要注意實(shí)驗(yàn)安全，凝膠、聯(lián)苯胺等試劑有毒，應(yīng)戴乳膠手套或一次性手套操作。3.在電泳過(guò)程中不允許用手去觸摸電極緩沖液，以免觸電。附表1試劑 配方分離膠PAG溶液 丙烯酰胺 (Acr):30g N,N-亞甲基雙丙烯酰胺(Bis):0.8g 加水定容至100mLTris-HCl緩沖液(pH8.9) Tris:36g HCl(12mol/L):2mL 加水定容至100mL濃縮膠PAG溶液 Acr:5.0g Bis:1.25g 加水定容至50mLTris-HCl緩沖液(pH6.7) Tris:3g HCl(12mol/L):2mL 加水定容至50mL 40%蔗糖溶液 蔗糖:20g 加水定容至50mL10% TEMED 溶液 四甲基乙二胺(TEMED):10mL 加水定容至100mL(避光、低溫保存)10%過(guò)硫酸胺(AP)溶液 AP:0.5g H2O:5mL (避光、低溫保存,一周內(nèi)可多次使用)甘油溴酚藍(lán)指示劑 溴酚藍(lán):0.01g H2O:5mL 甘油:5mL電極緩沖液(pH 8.3) Tris:6.0g 甘氨酸(Gly):28.8g 加水定容至1000mL,使用時(shí)稀釋10倍0.2mol/L PBS溶液(pH7.8) 按照有關(guān)參考書(shū)配置