大腸桿菌高效表達重組蛋白策略.doc

大腸桿菌高效表達重組蛋白策略前言重組蛋白的制備在蛋白結構分析和醫(yī)療應用領域十分重要。藥物蛋白的研究需要高純度的重組蛋白來進行藥物動力學和物理化學的研究1。重組蛋白在檢測酶活、連接配體、蛋白相互作用等生物學領域廣泛應用。已經表達出多種重組蛋白被證明有很大的應用潛力2,3。通過基因工程改造的方法已經獲得了許多性狀優(yōu)良的宿主菌表達系統(tǒng)，尤其是通過大腸桿菌可以大量表達外源基因編碼的重組蛋白4。但是仍然有兩個問題制約著大腸桿菌表達系統(tǒng)對重組蛋白的表達：一個是表達量低，還有一個就是表達錯誤折疊的蛋白包涵體5。蛋白的表達和純化工藝一直在發(fā)展進步，但是超過30%的重組蛋白為不具有生物活性的包涵體，嚴重影響了重組蛋白的生產應用6,7。在理想條件下，重組蛋白由強啟動子進行表達，產生大量的具有生物學活性的可溶性重組蛋白。但是，強啟動子會導致重組蛋白的過表達,從而影響宿主菌體的生長并產生包涵體8。在某些條件下可以通過變性、復性的方法使包涵體恢復活性9，但是復性后的蛋白是否能夠完全恢復活性仍然未可知。一般來講，可以通過表達條件的優(yōu)化來促進蛋白的可溶性表達，比如：誘導溫度、培養(yǎng)基組成、宿主菌的種類。還可以通過多種方案來解決蛋白不溶的問題：蛋白重新折疊10，構建融合蛋白11。另外想要進一步增加蛋白可溶性可以與分子伴侶共表達8或者低溫誘導12。本文對目前主要的促進蛋白可溶表達的方法進行了比較全面的總結。1.大腸桿菌表達系統(tǒng)的構建1.1選擇表達宿主菌對于大規(guī)模的表達重組蛋白，一般選擇胞內表達或者周質空間表達。與周質空間表達相比，胞內表達的表達量更高，因此應用更為廣泛。在實驗研究和實際生產中，已經有很多大腸桿菌表達系統(tǒng)廣泛應用于。在表達體系中較為常用的大腸桿菌為B菌株和K12菌株及它們的衍生菌株（表113）。美國國立研究院已經認證了K12菌株的標準性以及安全的使用方案，因此K12菌株在生產應用中具有極大的優(yōu)勢。但是由B菌株演變而來的BL系列菌株與K12相比，突變了lon 和 ompT兩個基因14，因此具有許多表達優(yōu)勢：產物積累少，缺少蛋白酶，防止產物被降解。這些優(yōu)勢使得BL菌株也具有非常廣泛的應用15,16,17。通常來講，針對不同的重組蛋白，宿主菌的選擇也是不同的。如果重組蛋白含有大腸桿菌稀有密碼子，就需要宿主能夠表達針對這些密碼子的tRNA，比如BL21 (DE3) CodonPlus-RIL，Rosetta (DE3)等菌株。如果重組蛋白具有許多二硫鍵，則需要宿主表達環(huán)境為氧化條件的。AD494宿主菌是硫氧還蛋白突變型，可以促進二硫鍵的折疊。Origami菌株為硫氧還蛋白突變和谷胱甘肽還原酶突變，進一步加強了二硫鍵在細胞內的形成18。另外一方面，如果表達的重組蛋白對于宿主菌是有毒性的，則需要表達為包涵體的形式。表1：常用于重組蛋白表達的宿主菌及其特點1.2 質粒的設計理想的基因轉錄是質粒和啟動子功能協(xié)同完成的。廣泛使用的質粒都是由復制子、啟動子、標記位點、多克隆位點、融合蛋白聯(lián)合調控進行轉錄的（圖120。）重組蛋白的表達量與質粒的拷貝數(shù)、結構、分離穩(wěn)定性有關。如果拷貝數(shù)低形成的mRNA數(shù)量少，蛋白的表達量就會降低。高拷貝數(shù)可以提高蛋白的表達量，但是這也會給宿主造成代謝上的負擔?？截悢?shù)很大程度上由起始子的復制情況決定的，也體現(xiàn)出質粒是嚴密調控還是松散調控。圖1. 質粒的基本構成高拷貝數(shù)質粒在生產應用中并不令人滿意。首先，宿主為了保存高拷貝數(shù)質粒，不得不在培養(yǎng)基中增加篩選抗生素。但是FDA限制臨床應用產品中添加劑的含量。其次，高拷貝數(shù)質粒存在分離不穩(wěn)定性，尤其是在低抗生素的條件下23,24。第三，高拷貝數(shù)質粒的表達和維持需要大量能量，不可避免的會影響宿主菌的生長和蛋白的合成。另外一個缺點就是，大量蛋白的過表達容易產生包涵體。利于蛋白產品高表達的大腸桿菌表達系統(tǒng)應該是嚴密調控并且高轉錄效率的。但是如果目的蛋白有毒性，則會損傷宿主細菌。另外有些特殊的宿主只能與特定的質粒組合才能獲得理想的重組蛋白。表2. 大腸桿菌表達中經常使用的啟動子有多種啟動子已經成功的用于表達各類重組蛋白(表225,26,27,17),。其中，lac啟動子及其衍生物，tac和trc，在研究和工業(yè)化中有著重要的應用28,25。tac和trc啟動子比lac啟動子更強，這三個啟動子都是由IPTG進行誘導的。IPTG可以抑制lac啟動子的阻遏，因此重組表達的水平由培養(yǎng)基中IPTG的濃度進行調控。但是，IPTG價格比較昂貴，且對許多菌株有毒性作用。為了解決這些問題，通突變篩選的方法獲得了可以通過溫度的調節(jié)控制熱敏啟動子29。從T7噬菌體中得到的T7啟動子也廣泛的應用于蛋白重組表達。T7噬菌體RNA聚合酶可以識別T7啟動子，DNA鏈的延長速率比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍。宿主菌染色體中含有前噬菌體(DE3)可以編碼T7噬菌體聚合酶，在T7啟動子衍生物L8-UV5的調控下可以進行表達。這種新的lac啟動子減少了對于AMP的依賴，也減少了對于葡萄糖抑制的敏感性。因此T7啟動子系統(tǒng)被認為比lac啟動子系統(tǒng)更為強大。通過T7啟動子系統(tǒng)可以獲得重組目的蛋白占總蛋白含量50%，但是大多以包涵體的形式存在23,30。儲熱調控啟動子系統(tǒng)比如噬菌體pL和pR啟動子，也用于生產治療性蛋白。質粒中含有熱敏性的cI857阻遏組件，可以通過溫度的變化控制pL和pR啟動子。由于溫控法容易操作，所以適合于大規(guī)模的產業(yè)化應用，同時也可以減少培養(yǎng)基的污染。但是溫控誘導也有其局限性，由于熱激會抑制菌體的生長，對重組蛋白的表達也會造成一定壓力。但是對于蛋白產品的質量和產量，這些壓力都是可以忽略的。噬菌體pL和pR啟動子也可以在低溫下進行調控，應用于表達可溶蛋白或者熱敏感蛋白31。應用營養(yǎng)調控啟動子phoA和trp時，培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分要確保菌體的正常生長并且能夠利用磷酸鹽進行誘導。這種誘導方法與其他的方法相比，誘導時間范圍非常廣泛32。另外一種嚴謹型啟動子lux，從費時弧菌中分離得到，具有群體感應元件，在基因表達中由luxI進行調控，通過添加自誘導AHL物進行轉錄的激活。AHL的濃度通常為IPTG濃度的1/1000，因此這種方法更加經濟利于生產放大33。2融合標簽的選擇通過選擇蛋白表達環(huán)境的方法不一定能夠使蛋白可溶，因此進一步采用融合標簽的方法加強可溶蛋白的表達。在重組蛋白中增加融合標簽可以增加蛋白的可溶性，并且使親和純化的過程更為簡便34。盡管這些標簽最開始是用于促進目的蛋白的分選及純化，近些年的研究表明，融合標簽也可以促進蛋白的產量，加強蛋白的溶解性，并且促進蛋白的正確折疊35。許多大腸桿菌表達質粒都可以在不同的啟動子調控下表達多種融合標簽：多聚組氨酸、麥芽糖連接蛋白(MBP)、谷胱甘肽轉移酶(GST) 36。選擇標簽的主要依據是蛋白本身的特性以及蛋白處理的階段，比如：是否為治療蛋白，層析分離的成本以及過程可控性的影響37。組氨酸標簽時目前應用最為廣泛的融合標簽。通過金屬離子螯合層析的方法可以對組氨酸標簽標記的目的蛋白進行分離純化。蛋白上的組氨酸標簽與固載的金屬離子奧何物相互作用38。另外通過MBP標記的蛋白可以通過形成交聯(lián)直鏈淀粉進行一步純化39,之后用含有10 mM麥芽糖的非變性緩沖液洗脫連接上的蛋白。GST也是一個親和力標簽，通過固載谷胱甘肽可以對GST標記的可溶蛋白進行分離。洗脫緩沖液一般含有還原型谷胱甘肽。GST標記的重組蛋白也可以通過酶催化或者免疫測定的方法進行定量檢測34。想要系統(tǒng)的分析融合標簽對于可溶蛋白的作用還是比較困難的，蛋白加入不同的融合標簽后的反應也不相同6,40。標簽的選擇十分重要，標簽可能會影響天然蛋白之間的相互作用、翻譯后修飾、是否可溶、重組蛋白的表達胞內定位等多個方面41,42。一些標簽在很多條件下（含有鹽離子、還原劑、表面活性劑）都可以實現(xiàn)功能，因此在之后的研究中可以彈性的選擇不同的緩沖液組成，與標簽的功能相適應34。3.提高蛋白轉錄效率蛋白在大腸桿菌中的轉錄過程可以被分為4個部分:起始、延伸、終止、核糖體循環(huán)。在大多數(shù)情況下，翻譯的起始是蛋白合成決定速率的關鍵步驟。這個效率由每條mRNA5末端的翻譯起始區(qū)(TIR)的序列和結構決定43。翻譯起始區(qū)(TIR)由四部分組成：(1)核糖體結合位點(SD)序列，(2)起始密碼子，(3)核糖體結合位點和起始密碼子之間的區(qū)域，(4) 在SD序列上游或是起始密碼子下游的翻譯增強子。調控TIR序列可以降低或者提高大腸桿菌中重組蛋白的表達44,45。已經證明了六個核苷酸的SD序列(AGGAGG)比其他更長或者更短的序列在表達綠色熒光蛋白(rGFP)方面效率更高46。在這個研究中，A/U合并的加強子使rGFP的表達增強了13倍。在對TIR區(qū)域進行修飾的時候要避免mRNA的二級結構覆蓋SD序列或者起始密碼子。在SD區(qū)域中進行單點突變會使RNA噬菌體MS2外殼蛋白的表達降低500倍47。將起始密碼子AUG從堿基配對的mRNA結構中暴露出來，可以有效提高大腸桿菌中IL-10的表達量，比野生型的表達量高10倍48。最近，科學家研究出了翻譯起始的生物學模型，可以通過設計核糖體的結合位點來改變翻譯起始速率。這個技術可以實現(xiàn)速率控制，并且細微精確的調整重組蛋白的表達43。表達量的精確程度對蛋白的分泌十分重要，如果表達速率太快會影響細菌的分泌過程，導致最終蛋白產量低。但是為了重組蛋白產量的最大化，翻譯水平通常選擇高分泌水平的表達方案49,44。4.提高mRNA的穩(wěn)定性 mRNA的穩(wěn)定性（半衰期）也會影響大腸桿菌中的表達速率。mRNA在大腸桿菌中的降解主要是由于RNA酶的存在，包括內切酶(RNase E, K and III和外切酶(RNase II 和多核酸磷酸化酶)。RNA酶和活性和菌體的生長環(huán)境有關50。對于高表達系統(tǒng)而言，提高mRNA的穩(wěn)定性主要有兩個策略：通過宿主的基因改造或者改變菌體生長條件，使mRNA的兩端更具有防護性，避免被RNA酶水解51。實驗證明，在序列5端非編碼區(qū)中添加ompA基因可以形成一個莖環(huán)結構，有效的延長外源mRNA的半衰期52。在人類IL-2的cDNA翻譯終止子的位置添加來源于蘇云金桿菌的penP基因，可以加強mRNA的穩(wěn)定性，提高IL-2在大腸桿菌中的表達量52。研究表明，在C末端添加的rne基因，可以編碼RNA酶，導致mRNA的降解，因此對rne基因進行突變可以提高mRNA的穩(wěn)定性，促進重組蛋白的表達量53。含有這種突變的菌株已經應用于商業(yè)生產領域。5.密碼子優(yōu)化除了TIR序列和mRNA的穩(wěn)定性以外，大腸桿菌密碼子的特異性也影響蛋白的翻譯。表達含有稀有密碼子的外源基因會導致菌體生長停滯，蛋白表達過程中過早結束翻譯，基因產生移碼，缺失等現(xiàn)象54。當稀有密碼子聚集時，這種現(xiàn)象更明顯55。解決這個問題的辦法是根據大腸桿菌偏好性，綜合的優(yōu)化基因序列，已經有多種方法可以對大腸桿菌和其他宿主菌進行優(yōu)化56。經過密碼子優(yōu)化后的抗體序列在周質空間的表達量為原始基因的100倍57。添加稀有密碼子同源的tRNA也可以彌補密碼子偏好的問題。大腸桿菌Rosetta (DE3)菌株具有pRARE質?？梢跃幋atRNA，識別只有真核細胞中才具有的稀有密碼子。通過這種菌株生產人類重組蛋白時，68種蛋白中有35種的產量獲得了明顯的提高58。這種菌株可以表達在BL21 (DE3)中無法表達的蛋白。應用pRARE質粒提高大腸桿菌重組蛋白的表達量非常實用，其效果在多個試驗中得到了驗證59,60。6.培養(yǎng)基環(huán)境對可溶表達的影響在大腸桿菌中想要獲得具有生物學活性的可溶蛋白需要平衡DNA轉錄、蛋白翻譯、蛋白折疊三個過程。大腸桿菌中高效表達可以獲得占總蛋白30%的重組蛋白，如果加入分子伴侶和調節(jié)因子可以獲得更多。另外，許多蛋白的正確折疊需要二硫鍵的正確形成以及糖基化，而大腸桿菌胞內表達環(huán)境不能滿足這些調節(jié)。所以許多人類重組蛋白在大腸桿菌中表達會出現(xiàn)大量的錯誤折疊，形成包涵體。培養(yǎng)條件對于外源基因的表達來說非常重要。一般來講，可以通過控制合成速率的方法來避免包涵體的形成。主要的影響因素有：不同時間進行誘導，誘導后陪時間、誘導溫度、誘導物濃度。6.1不同時間進行誘導對表達的影響通常在菌體生長的對數(shù)期早期進行誘導，但是也有報道顯示可以在對數(shù)期末期61甚至平臺期62進行誘導。因此，誘導前的菌體濃度對于重組蛋白的表達來講是非常重要的影響因素。6.2 誘導溫度和誘導后的培養(yǎng)時間對表達的影響兩個影響蛋白可溶表達的重要影響因素是誘導溫度和誘導后時間。通過降低誘導溫度的方法可以降低蛋白合成的速率，減少包涵體的形成。通過這種方法已經成功表達了多種難以表達的蛋白12。高溫可以促進菌體生長，但是易產生質粒丟失，不利于含有外源基因的質粒的表達63。在連續(xù)培養(yǎng)的過程中這種影響更為明顯。總的來說，高溫和溫度依賴性的疏水作用易與導致聚集沉淀64。在菌體中，有一些蛋白適合緩慢、長時間的誘導，那就必然要選擇低溫條件下65。6.3 誘導劑濃度對表達的影響低誘導劑濃度可能會導致誘導效率降低，重組蛋白產量降低；誘導劑價格昂貴，如果過量加入不僅會增加成本，還會帶來毒性抑制菌體的生長，影響重組蛋白的表達66。因此，誘導劑濃度應該嚴格控制，略高于臨界濃度。IPTG濃度在0-1 mM之間對菌體的生長速率和菌體濃度沒有明顯影響66。但是，IPTG的濃度需要與宿主菌、載體、重組蛋白相適應。7.胞內蛋白折疊調節(jié)因素胞內折疊調節(jié)因子包括：折疊伴侶（DnaK和GroEL），維持伴侶(e.g.,IbpA 和B)，降解伴侶(ClpB)，這些蛋白都在保持蛋白正確折疊構象方面有著非常重要的作用。共表達這些分子伴侶可以增強許多種蛋白的溶解性67。共表達GroEL/ GroES時，表達的B型鈉尿肽抗體中有65%時可溶的，比非共表達提高了2.4倍68。但是，通過共表達的方法并不一定能夠增強蛋白的可溶性，也可能會導致菌體代謝的負擔，降低蛋白的表達水平。不同的宿主菌也可以促進蛋白的折疊可溶。破壞txrB和 gor基因，可以促進蛋白二硫鍵的形成和異構化。通過在胞內過表達二硫鍵異構酶DsbC可以加強二硫鍵的形成69。結語：大腸桿菌表達系統(tǒng)是基因工程中最早的表達系統(tǒng), 但還存在一些問題: 一是有些來自真核生物的蛋白并沒有得到有效的表達; 二是選擇一個合適的宿主和載體系統(tǒng)要經過多次嘗試, 費時費力; 三是重組蛋白的分泌表達技術不如胞內表達技術研究得透徹。要解決這些問題可以通過以下途徑: (1)通過基因導入將修飾機制引入原核表達系統(tǒng), 如糖基化、磷酸化、乙酰化和酰胺化等; ( 2)構建一套適應性和功能強大的表達載體系統(tǒng), 避免大范圍嘗試; (3)深入研究表達系統(tǒng)的分泌機制,加強信號肽功能, 分子伴侶和轉運通路機制的研究, 獲得更多的胞外分泌。雖然現(xiàn)在已經出現(xiàn)大量真核表達系統(tǒng), 但大腸桿菌仍然是基礎研究和商業(yè)生產重組蛋白的強大工具, 隨著各項研究的深入, 重組蛋白的高效表達技術將會越來越完善。參考文獻1. 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