大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)與蛋白表達(dá)純化.doc

8.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)與蛋白表達(dá)純化大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)遺傳背景清楚，目的基因表達(dá)水平高，培養(yǎng)周期短，抗污染能力強(qiáng)等特點(diǎn), 是分子生物學(xué)研究和生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展進(jìn)程中的重要工具。因此熟練掌握并運(yùn)用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的基本原理和常規(guī)操作是對(duì)每一個(gè)研究生來(lái)說(shuō)是非常必要的。本章節(jié)介紹了實(shí)驗(yàn)室常用的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)成特點(diǎn)，歸納了利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)純化重組蛋白的基本流程和詳細(xì)操作步驟，并且結(jié)合筆者的操作經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)了初學(xué)者在操作過(guò)程中可能遇到的問(wèn)題和解決策略。8.1大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇與構(gòu)建8.1.1表達(dá)載體的選擇根據(jù)啟動(dòng)子的不同這些載體大致可以分為熱誘導(dǎo)啟動(dòng)子，如PL，cspA 等和另外一類就是廣泛使用的IPTG誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，如lac，trc，tac，T5/lac operator，T5/lac operator等。根據(jù)表達(dá)蛋白質(zhì)的類型可分為單純表達(dá)載體和融合表達(dá)載體。融合表達(dá)是在目標(biāo)蛋白的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促進(jìn)蛋白的正確折疊，實(shí)現(xiàn)目的蛋白的快速親和純化，或者實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的表達(dá)定位。常用的用于親和純化融合標(biāo)簽包括 Poly-Arg，Poly-His, Strep-Tag ，S-tag，MBP等。其中His-Tag 和GST-Tag 是目前使用最多的。His Tag 大多數(shù)是連續(xù)的六個(gè)His 融合于目標(biāo)蛋白的N端或C端，通過(guò)His 與金屬離子：Cu2+>Fe2+>Zn2+>Ni2+ 的螯合作用而實(shí)現(xiàn)親和純化，其中Ni2+是目前使用最廣泛的。His 標(biāo)簽具有較小的分子量，融合于目標(biāo)蛋白的N端和C端不影響目標(biāo)蛋白的活性，因此純化過(guò)程中大多不需要去除。目前常使用的表達(dá)載體主要是由Novagen 提供的pET 系列和 Qiagen 公司提供的pQE 系列。除了His 標(biāo)簽外，還原性谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶是另一種實(shí)驗(yàn)室常用的融合標(biāo)簽。它可以通過(guò)還原性谷胱甘肽瓊脂糖親和層析而快速純化。此外，與His 相比，GST 很多時(shí)候能夠促進(jìn)目標(biāo)蛋白的正確折疊，提高目標(biāo)蛋白表達(dá)的可溶性，因此，對(duì)于那些用his 標(biāo)簽表達(dá)易形成包涵體的蛋白，可以嘗試用GST融合表達(dá)來(lái)改進(jìn)。當(dāng)然，GST 具有較大的分子量（26kDa），可能對(duì)目的蛋白的活性有影響，因此很多時(shí)候切除GST是必須的。目前，GST融合表達(dá)系統(tǒng)主要是由GE Healthcare（原Amersham）提供。8.1.2宿主菌的選擇重組質(zhì)粒的構(gòu)建一般選擇遺傳穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率高，質(zhì)粒產(chǎn)量高的菌株作為受體菌，常用的有E.coli DH5，E.coli JM 109，E.coli DH 10B ，E.coli NovaBle等recA和endA型細(xì)胞。作為表達(dá)宿主菌必須具備幾個(gè)基本特點(diǎn)：遺傳穩(wěn)定，生長(zhǎng)速度快，表達(dá)蛋白穩(wěn)定。具體操作過(guò)程中，根據(jù)所使用的表達(dá)載體的特點(diǎn)，目的基因密碼子的組成等選擇特定的表達(dá)宿主菌。以下是實(shí)驗(yàn)室常用的幾種表達(dá)宿主：BL2： lon和ompT 蛋白酶缺陷型，避免了宿主對(duì)外源蛋白的降解。是經(jīng)典的使用最廣泛的表達(dá)受體。適用于Tac，Trc，Lac，PL，cspA等作為啟動(dòng)子的載體。BL21（DE3）： DE3噬菌體溶源于BL21 形成的帶有染色體T7 RNA 聚合酶基因大腸桿菌。IPTG 誘導(dǎo)的lacV5 啟動(dòng)子控制T7 RNA 聚合酶基因表達(dá)T7 RNA 聚合酶，進(jìn)而控制T7 表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白。BL21（DE3）衍生系列：在經(jīng)典的T7表達(dá)系統(tǒng)BL21（DE3）的基礎(chǔ)上，Novagen 公司開發(fā)了一些特殊的表達(dá)宿主細(xì)胞。比如：Origami （DE3），Origami B（DE3）和Rosetta-gami （DE3）菌株帶有 trxB和gor雙突變。擁有trxB和gor突變的菌株比單具，trxB突變的菌株更有可能促進(jìn)二硫鍵的形成，使蛋白可溶性更好，活性更高。Rosetta 系列：是經(jīng)過(guò)修飾，專用于帶有大腸桿菌稀有密碼子的真核蛋白表達(dá)的菌株。經(jīng)提高稀有tRNA 水平，可以提高一些真核基因表達(dá)效率（更多信息可參考相應(yīng)公司的資料）。BL21-Codon Plus系列：包括BL21-CodonPlus （DE3）-RIPL，BL21-CodonPls-RIL，BL21-CodonPls（DE3）-RIL, BL21-CodonPls-RP，BL21- CodonPlus （DE3）-RP等。這些受體菌添加了大腸桿菌中編碼精氨酸（R），亮氨酸（L），異亮氨酸（I）和脯氨酸（P）稀有密碼子的tRNA 基因，更多用于表達(dá)一些真核生物的基因。其中RIL系列常用于AT 含量高的基因，而RP系列主要用于GC含量高的基因（更多信息參考Stratagene 公司資料）。M15/SG13009：自身表達(dá)T5 RNA polymerase，主要用于pQE系列載體的表達(dá)。另一個(gè)需要考慮的是大腸桿菌的密碼子及其偏愛性。表1 大腸桿菌密碼子使用頻率統(tǒng)計(jì)TAAFRQCAAFRQAAAFRQGAAFRQTTTTF19.7TCTS5.7TATY16.8TGTC5.9TTCF15TCCS5.5TACY14.6TGCC8TTAL15.2TCAS7.8TAAstop1.8TGAstop1TTGL11.9TCGS8TAGstop0TGGW10.7CCTTL12CCTP8.4CATH15.8CGTR21.1CTCL11CCCP6.4CACH13.1CGCR26CTAL5.3CCAP6.6CAAQ12.1CGAR4.3CTGL46.9CCGP26.7CAGQ27.7CGGR4.1AATTI30.5ACTT8AATN21.9AGTS7.2ATCI30.6ACCT22.8AACN24.4AGCS16.6ATAI30.7ACAT6.4AAAK33.2AGAR1.4ATGM30.8ACGT11.5AAGK12.1AGGR1.6GGTTV16.8GCTA10.7GATD37.9GGTG21.3GTCV16.9GCCA31.6GACD20.5GGCG33.4GTAV16.1GCAA21.1GAAE43.7GGAG9.2GTGV16.11GCGA38.5GAGE18.4GGGG8.68.2表達(dá)條件的建立為了方便后續(xù)的純化操作, 保持目標(biāo)蛋白的活性,提高蛋白的得率，我們?cè)谶M(jìn)行蛋白的大量制備之前應(yīng)該首先確定目標(biāo)蛋白的最佳表達(dá)條件。首先，保證表達(dá)蛋白穩(wěn)定，盡量避免蛋白酶的降解，我們可以通過(guò)使用一些蛋白酶缺陷性的表達(dá)宿主，其次在表達(dá)的過(guò)程中可以在培養(yǎng)體系中添加一些蛋白酶抑制劑等來(lái)解決。與實(shí)現(xiàn)外源蛋白的穩(wěn)定表達(dá)相比，更多時(shí)候保證目標(biāo)蛋白的可溶性表達(dá)，是建立表達(dá)條件的主要工作。很多外源基因在大腸桿菌表達(dá)時(shí)很容易形成不可容的包涵體，其原因可能有：表達(dá)量過(guò)高，研究發(fā)現(xiàn)在低表達(dá)時(shí)很少形成包涵體，表達(dá)量越高越容易形成包涵體；蛋白合成速度太快，以至于沒有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確配對(duì)；過(guò)多蛋白間的非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無(wú)法達(dá)到足夠的溶解度等。目前對(duì)包涵體的形成和復(fù)性過(guò)程中發(fā)生聚集的機(jī)制尚不清楚, 但已經(jīng)報(bào)道了很多用于優(yōu)化表達(dá)以增加目標(biāo)蛋白可溶性的方法。8.2.1確定表達(dá)狀況轉(zhuǎn)化構(gòu)建好的質(zhì)粒至表達(dá)宿主感受細(xì)胞，挑取單克隆子至5ml 含有相應(yīng)抗性的LB 培養(yǎng)基中，37，200 rpm，培養(yǎng)至OD600=0.5左右，加入IPTG至終濃度0.2mM，轉(zhuǎn)移至28，200 rpm 繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，可以在2h，4h，6h分別取樣以分析表達(dá)狀況。將取出的1ml 菌液12000 rpm 離心1min，收集菌體，加入1ml PBS 緩沖液重懸沉淀，同樣離心1min。再加入300500ml PBS重懸細(xì)胞。超聲破碎細(xì)胞（具體見操作細(xì)胞破碎）將破碎液體4，12000 rpm 離心10min，分離上清和沉淀。SDS-PAGE 分析上清和沉淀的蛋白分布（具體操作參考SDS-PAGE）。若在上清中有明顯的目的蛋白的條帶，即可以放大培養(yǎng)進(jìn)而純化目標(biāo)蛋白。若目標(biāo)蛋白的表達(dá)主要分布于沉淀，則可以嘗試一下幾種方法來(lái)改善表達(dá)。改變表達(dá)載體下手，像GST，NS，MBP, TrxA等融合標(biāo)簽?zāi)軌蛱岣吆芏嗟鞍自诖竽c桿菌中表達(dá)的可溶性，此外一些分泌標(biāo)簽如ompA,Pet-22b上的pelB也能夠?qū)⒛繕?biāo)蛋白運(yùn)輸至細(xì)胞的周質(zhì)空間，從而提高目標(biāo)蛋白的可溶性。降低表達(dá)速度，可采取低溫誘導(dǎo)，如15誘導(dǎo)過(guò)夜，或者采用弱啟動(dòng)子表達(dá)載體。嘗試一些特殊設(shè)計(jì)的表達(dá)宿主Origami：thioredoxin redctase/gltathione redctase 雙突變適合帶thioredoxin redctase的融合表達(dá)載體，幫助形成更多的二硫鍵。對(duì)于一些蛋白可能無(wú)法實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，這時(shí)候溶解包涵體后再純化是唯一的解決辦法。8.2.2聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）大腸桿菌表達(dá)純化外源蛋白，SDS-PAGE是必不可少的操作。可以用來(lái)檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況(表達(dá)量，表達(dá)分布等)，用來(lái)分析純化的目的蛋白的純度。本小節(jié)列出SDS-PAGE 操作中一些試劑的配置及其基本的操作過(guò)程。8.2.2.1主要試劑的配置（1）30%丙烯酰胺貯存液：29g丙烯酰胺和1g N,N-亞甲雙丙烯酰胺溶于100ml熱水中，驗(yàn)證其pH值不大于7.0。置棕色瓶中，4保存。丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性并可以通過(guò)皮膚吸收，其作用具累積性。稱量丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺時(shí)應(yīng)戴手套和面具。可認(rèn)為聚丙烯酰胺無(wú)毒，但也應(yīng)謹(jǐn)慎操作，因?yàn)樗€可能會(huì)含有少量未聚合材料。建議實(shí)驗(yàn)室劃出專門的臺(tái)面，設(shè)置單獨(dú)的配置器皿進(jìn)行SDS-PAGE 的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。（2）1.5mol/L Tris（pH8.8）溶液。（3）10% SDS溶液：SDS 10.0g 加入ddH2O ToTo100。（4）10%過(guò)硫酸銨：新鮮配制。（5）TEMED溶液：4保存。（6）1.0 mol/L Tris（pH6.8）溶液。（7）2樣品溶解液：2%SDS，5%巰基乙醇，10%甘油，0.02%溴酚藍(lán)，0.01mol/L Tris-HCl（pH8.0）緩沖液。（8）5Tris-甘氨酸電極緩沖液： 15.1g Tris，94g甘氨酸和5g SDS定容到1000ml（建議每次電泳用新稀釋的緩沖液）。（9）考馬斯亮藍(lán)R染色液：每100ml甲醇、水、冰乙酸混合物（9:9:2）中，溶解0.25g考馬斯亮藍(lán)R，攪拌溶解。（10）脫色液：10%冰醋酸（可加如乙醇，建議不要使用甲醇）。8.2.2.2主要操作步驟1、凝膠制備（1）安裝洗滌干凈的玻璃板、板條，并將玻璃板固定在電泳槽中。（2）配制10%的分離膠（具體參考表2）：迅速在兩玻璃板間隙中灌注分離膠，直至剩余的板寬比梳子長(zhǎng)度多1cm。小心在膠上覆蓋一薄層異丙醇或水。（3）在分離膠聚合的過(guò)程（可置于37，約10min）中，配制5%的積層膠（參考表格3）。（4）分離膠聚合完全后，倒去異丙醇或水，用濾紙吸干膠面上的殘余。（5）灌注積層膠，立即插入干凈的梳子，避免產(chǎn)生氣泡。（6）積層膠聚合完全后，小心拔出梳子，撥去封膠用的塑料條，固定于電泳槽。（7）在上下電泳槽中加入足夠的電泳緩沖液。2、樣品的制備在蛋白溶液中加入等體積的2樣品溶解液，混合液在沸水浴中加熱5min，冷卻后即可上樣。3、上樣用微量移液器上樣，每加入一種樣品，上樣量根據(jù)根據(jù)具體的樣品濃度確定，未知濃度一般用10微升。4、電泳對(duì)于一塊膠，在濃縮膠中電流設(shè)置在1520mA,當(dāng)染料進(jìn)入分離膠后可設(shè)置電壓至電流約為2530mA，繼續(xù)電泳直至染料到達(dá)離凝膠底部1cm處。5、后處理（1）染色：加入染色液（用量同上），室溫染色30min1h。Tip：染色前可將染色液在微波爐里加熱至沸，然后搖床震蕩染色約10min即可。（2）脫色：將染色后的膠塊用水洗滌三次去除表面染料，然后加入脫色液脫色，其間更換脫色液34次至條帶清晰。Tip：10min快速脫色:將脫色液置于微波爐煮沸，更換三次脫色液。表2. 配制SDS-PAGE 不同濃度分離膠的配置不同體積（ml）凝膠液中各成分所需體積（ml）Gel%組成所需要各成份體積（ml）510152025306%水2.65.37.910.613.215.930%丙烯酰胺溶液1234561.5mol/LTris(pH8.8)1.32.53.856.37.510%SDS0.050.10.150.20.250.310%過(guò)硫酸氨0.050.10.150.20.250.3TEMED0.0040.0080.0120.0160.020.0248%水2.34.66.99.311.513.930%丙烯酰胺溶液1.32.745.36.781.5mol/LTris(pH8.8)1.32.53.856.37.510%SDS0.050.10.150.20.250.310%過(guò)硫酸氨0.050.10.150.20.250.3TEMED0.0030.0060.0090.0120.0150.01810%水1.945.97.99.911.930%丙烯酰胺溶液1.73.356.78.3101.5mol/LTris(pH8.8)1.32.53.856.37.510%SDS0.050.10.150.20.250.310%過(guò)硫酸氨0.050.10.150.20.250.3TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.01212%水1.63.34.96.68.29.930%丙烯酰胺溶液246810121.5mol/LTris(pH8.8)1.32.53.856.37.510%SDS0.050.10.150.20.250.310%過(guò)硫酸氨0.050.10.150.20.250.3TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.01215%水1.12.33.44.65.76.930%丙烯酰胺溶液2.557.51012.5151.5mol/LTris(pH8.8)1.32.53.856.37.510%SDS0.050.10.150.20.250.310%過(guò)硫酸氨0.050.10.150.20.250.3TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.012表3.SDS-PAGE 5%濃縮膠的配置Gel%組成所需要各成份體積（ml）1234565%水0.681.42.12.73.44.130%丙烯酰胺溶液0.170.330.50.670.831.01.0mol/LTris(pH6.8)0.130.250.380.50.630.7510%SDS0.010.020.030.040.050.0610%過(guò)硫酸氨0.010.020.030.040.050.06TEMED0.010.020.030.040.050.068.3細(xì)胞破碎獲取蛋白質(zhì)大腸桿菌細(xì)胞破碎有很多方法，譬如反復(fù)凍融法，滲透沖擊，超聲破碎，壓力破碎等。其中超聲破碎和壓力破碎破碎是我室常用方法。8.3.1超聲破碎在建立表達(dá)條件過(guò)程中，小量制備樣品可用小型超聲細(xì)胞粉碎儀。離心1.01.5ml 誘導(dǎo)后的菌液收集菌體，然后視菌體的量加入300500l的緩沖液重懸細(xì)胞，然后置于冰上超聲破碎。因很多實(shí)驗(yàn)室有自己的小型超聲粉碎器,各個(gè)操作不盡相同，具體操作參考儀器說(shuō)明書。常規(guī)操作步驟如下（以100ml 培養(yǎng)液為例）：（1）100 ml 誘導(dǎo)后的菌液（OD600=1.2 左右），12000 rpm，4離心2min，收集菌體。（2）加入預(yù)冷的緩沖液50ml，重懸細(xì)胞洗滌菌體一次，12000 rpm，4離心2min，收集菌體；常規(guī)的操作所使用的緩沖液多為PBS 或者 Tris-NaCl，針對(duì)不同的載體和純化方法，選擇相應(yīng)的緩沖液。對(duì)于一些蛋白酶敏感的目的蛋白，可以在整個(gè)操作過(guò)程中加入一些蛋白酶抑制劑。（3）向沉淀中加入15ml的緩沖液同上（若菌體太濃，可加倍），充分懸浮，將菌懸液裝在一個(gè)玻璃小燒杯中，置于冰水混合物中。（4）破碎：將用緩沖液洗滌過(guò)的超聲探頭伸入到菌液中，不要接觸燒杯底部，每處理30sec間隔1min使菌液冷卻，輸出強(qiáng)度為56，頻率為6070。（5）分離上清和沉淀：12000 rpm，4離心20min，分離上清和沉淀。（6）SDS-PAGE 分析蛋白表達(dá)情況。（7）準(zhǔn)備純化蛋白。超聲破碎注意事項(xiàng)與一些小的改進(jìn)：（1）破碎完全的判斷：超聲前菌懸液是渾濁的，超聲完全后變的透明、清澈。（2）如果超聲時(shí)出現(xiàn)黑色沉淀，說(shuō)明超聲功率太強(qiáng)。（3）超聲時(shí)間太長(zhǎng)、功率太高對(duì)蛋白活性肯定有影響。（4）盡量防止泡沫的產(chǎn)生。（5）大量破碎時(shí)將菌液置于一玻璃器皿中，破碎時(shí)放在冰水混合物中，以增加散熱，減小對(duì)蛋白的破壞作用。（6）破碎前的預(yù)處理，在破碎前可用溶菌酶（100g/ml）處理破環(huán)細(xì)胞壁（10min，30），增加細(xì)胞的通透性。8.3.2壓力破碎高壓破碎是大量的破碎提取細(xì)胞內(nèi)成份的首先方法，相對(duì)于超聲破碎，它具有過(guò)程溫和，操作迅速等優(yōu)點(diǎn)，具體使用需要根據(jù)具體的儀器使用說(shuō)明。FRENCH PRESS 細(xì)胞破碎儀標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（1）使用前將高壓腔、底座、活塞桿在4冰箱中預(yù)冷30min。（2）將三腳固定器置于水平桌面上，將高壓腔正放在固定器器上；在活塞桿的O型環(huán)、底座的O型環(huán)和針形閥的O型環(huán)上均勻涂上少量凡士林。（3）把活塞桿正向插入高壓腔至最大加樣線，將整個(gè)腔體連同活塞桿一起倒轉(zhuǎn)固定在固定器上。（4）將菌液倒入腔體，最大處理量為35ml，最小為5ml。視樣品體積，大致估計(jì)并調(diào)整活塞桿的位置。（5）將針形閥和樣品噴射管裝配于底座上，針形閥擰到輕輕不能擰動(dòng)為止，并向反方向稍微松動(dòng)，保證閥門處于開啟狀態(tài)（注意：務(wù)必不能用力擰緊，否則會(huì)降低其密封性）。把底座倒扣于腔體上，向上調(diào)整活塞桿的位置，直至腔內(nèi)空氣完全排出，流出一滴樣品為止，輕輕旋緊針形閥。（6）雙手托起整個(gè)高壓腔組件，翻轉(zhuǎn)至正向位置，將其置于升降臺(tái)上（事先要確保操作臺(tái)足夠的低，以容的下整個(gè)組件），向后推動(dòng)底座，使底座固定于三個(gè)位置校準(zhǔn)針之間，并調(diào)整腔體使針形閥朝向正面。將固定夾固定于支持桿上，擰緊固定夾上的兩個(gè)螺絲以固定腔體。將活塞桿上的手柄轉(zhuǎn)至與固定夾垂直的方向。（7）打開電源，將檔位手柄轉(zhuǎn)至HIGH檔，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)壓力控制閥至50psi，升降臺(tái)開始上升，當(dāng)活塞桿接觸上頂臺(tái)后，繼續(xù)順時(shí)針旋轉(zhuǎn)壓力控制閥，直至壓力達(dá)到需要的壓力（大腸桿菌的破碎壓力一半設(shè)定為12000psi，芽孢桿菌設(shè)定為2000psi）。（7）取一冰預(yù)冷的離心管（或者將離心管至于冰中）置于樣品噴射管出口處，輕輕逆時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)針形閥，小心控制樣品的流出速度，根據(jù)破碎程度決定流速（建議在噴射管出口處接一個(gè)1cm長(zhǎng)的透明的塑料管如輸液管，通過(guò)觀察塑料管流出樣品的透明度來(lái)判斷破碎是否完全）。當(dāng)活塞桿上的安全指示線（Stop Line）降至腔體上表面時(shí)，迅速關(guān)緊針形閥（不要過(guò)緊），旋轉(zhuǎn)檔位手柄至DOWN位置。待升降臺(tái)完全下降后，繼續(xù)降低壓力至零，關(guān)閉電源。（8）松開固定夾，取出高壓腔，重新倒置于三腳固定器上，取出底座。將各部分拆開，徹底清洗。底座及噴射管的內(nèi)壁要重點(diǎn)沖洗，涂有凡士林處要用洗潔精徹底洗凈。【注意事項(xiàng)】（1）儀器最大承受壓力為4000psi（指示針2500）。（2）各O形環(huán)處（包括樣高壓腔，底座，活塞桿和針形閥）一定要涂凡士林潤(rùn)滑，以降低磨損，防止損傷。（3）壓力的升高或降低速度要控制在一定范圍內(nèi)。升高壓力前務(wù)必保證整個(gè)組件固定于升降臺(tái)上,任何的松動(dòng)可能導(dǎo)致事故。（4）活塞桿的手柄要與固定夾垂直，否則會(huì)發(fā)生危險(xiǎn)。（5）嚴(yán)禁將出樣閥過(guò)分?jǐn)Q緊，否則會(huì)損壞內(nèi)部撞針，以不流出液體為準(zhǔn)。（6）嚴(yán)禁使活塞桿下至安全線以下，否則會(huì)導(dǎo)致活塞桿與底座損壞。（7）使用完畢要將壓力控制閥轉(zhuǎn)至壓力為零。（8）各部件清洗要徹底，否則底座小孔容易堵死，活塞桿上殘留的菌體會(huì)在未洗凈的凡士林上滋生。（9）長(zhǎng)期不用應(yīng)保存在干燥的環(huán)境中，必要時(shí)可涂凡士林防止生銹。（10）壓力腔的空氣一定要完全排出，否則當(dāng)樣品完全排出時(shí)，造成活塞與壓力池底座直接接觸，造成損傷，由于壓力非常大，有可能導(dǎo)致活塞或壓力池底座變形，造成永久性損傷！（11）在搬動(dòng)裝好的樣品池時(shí)，一定要雙手，一手扶住住高壓腔，一手托住底座，防止底座脫落而造成事故。（12）O型環(huán)若老化則及時(shí)更換。（13）操作過(guò)程中禁止將液體濺入機(jī)箱內(nèi)部。（14）儀器使用過(guò)程中出現(xiàn)故障應(yīng)及時(shí)與負(fù)責(zé)人聯(lián)系。8.4目的蛋白的純化8.4.1 His Tag 純化操作實(shí)例本實(shí)驗(yàn)室中所用的表達(dá)載體pET28a（+）中含有一個(gè)編碼多聚組氨酸的序列，即His-Tag，因此會(huì)獲得帶有His-Tag的重組目標(biāo)蛋白。His-Tag可與金屬Ni2+離子結(jié)合，從而有利于目標(biāo)蛋白的純化。加上了His-Tag的蛋白在非變性的條件下可用Ni2+親和層析柱純化。純化蛋白的原理是：當(dāng)親和層析柱負(fù)載了Ni2+后，可以選擇性吸附暴露在蛋白表面具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基（特別是組氨酸殘基）。蛋白質(zhì)中含有的組氨酸越多，與Ni2+結(jié)合的特異性就越高，則將其洗脫下來(lái)會(huì)需要更高的咪唑濃度。含有組氨酸標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白與細(xì)胞中的總蛋白相比，具有更高的Ni2+結(jié)合特異性。為了得到具有較高純度的目標(biāo)蛋白，必須找到一個(gè)合適咪唑濃度的洗脫液（結(jié)合緩沖液），在此濃度下非特異性的雜蛋白能從柱上洗脫下來(lái)，而與Ni2+特異性結(jié)合的目標(biāo)蛋白不會(huì)被洗脫。最后用更高咪唑濃度的緩沖液（洗脫緩沖液）將目標(biāo)蛋白洗脫下來(lái)，此時(shí)目標(biāo)蛋白特異性的存在于該咪唑濃度的洗脫液中，從而得到純化了的目標(biāo)蛋白質(zhì)。8.4.1.1 重組蛋白的誘導(dǎo)（1）載體構(gòu)建：本實(shí)驗(yàn)采用pET-28a（+）表達(dá)載體，克隆受體菌為E.coli DH5，表達(dá)宿主為E.coli BL21(DE3)。具體操作參考基因克隆與轉(zhuǎn)化部分。（2）挑一個(gè)轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的單菌落接種于5mlLB液體培養(yǎng)基中（含100g/m卡那霉素和），于37過(guò)夜培養(yǎng)。（3）取1ml過(guò)夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)接于100ml含100g/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37培養(yǎng)1.52小時(shí)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。（4）在培養(yǎng)物中加入異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度為0.2 mM，按照預(yù)先建立的最佳表達(dá)條件進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。（5）1200 rpm，離心2min，收集菌體。（6）棄上清，向沉淀中加入500ml Starting buffer（20mM磷酸緩沖液（Na2HPO4和NaH2PO4），200mM NaCl，10% 甘油，pH 7.0），充分懸浮洗滌菌體。（7）12000 rpm，離心2min，收集菌體。（8）向沉淀中加入15ml的starting buffer，重懸菌體。（9）冰浴條件下超聲波處理3min，每處理30sec間隔1min使菌液冷卻，輸出強(qiáng)度為56，頻率為6070，處理時(shí)以不發(fā)生氣泡，不過(guò)熱為準(zhǔn)，以菌液變清晰為終止標(biāo)準(zhǔn)。（10）12000 rpm，4離心20min，將上清移到干凈滅過(guò)菌的50ml離心管。SDS-PAGE 分析蛋白的表達(dá)情況。若目的蛋白分布在上清中，繼續(xù)進(jìn)行下面的純化操作。8.4.1.2 目標(biāo)蛋白的體外純化（1）灌制好Ni2+-NTA親和層析柱（Ni-NTA瓊脂糖親和層析柱？），用去離子水進(jìn)行緩慢洗脫，避免在柱床中引入氣泡。（2）用10倍柱床體積的starting buffer進(jìn)行預(yù)平衡，上樣，將細(xì)胞破碎后的上清液注入Ni2+-NTA親和層析柱中。（3）用10倍ml的starting buffer進(jìn)行漂洗，收集濾過(guò)液。（4）開始用5倍柱床體積的含20 mM咪唑的starting buffer進(jìn)行洗脫，并對(duì)洗脫液進(jìn)行收集。（5）依次用5倍柱床體積的含40 mM，60 mM，80 mM，100 mM，200 mM，300 mM和500 mM咪唑的starting buffer進(jìn)行洗脫，分別對(duì)洗脫液進(jìn)行收集。（6）通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)回收的效果，確定咪唑最合適洗脫濃度。（7）從每管收集的濾出液取出10l的樣品，加入10l的2X SDS凝膠加樣緩沖液，搖勻。（8）沸水浴處理3min。（9）取出樣品，將10l樣品全部上樣于適當(dāng)濃度的SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳?！咀⒁馐马?xiàng)】（1）樣品可貯存于4，以備在聚丙烯酰胺凝膠上加樣。（2）用考馬斯亮藍(lán)或銀染液進(jìn)行染色，檢測(cè)重組蛋白的純化程度，并找到咪唑最合適洗脫濃度，也就是純化蛋白含量最多的一管洗脫液所對(duì)應(yīng)的濃度；并將該純化出來(lái)的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)PD-10柱子以去掉溶液中的咪唑。 （3）蛋白質(zhì)被洗脫完成之后，要及時(shí)地清洗柱子，使柱子能重復(fù)使用。（4）在下次對(duì)同一蛋白的純化過(guò)程中，即可根據(jù)膠圖所顯示的個(gè)洗脫液中蛋白濃度的情況來(lái)優(yōu)化整個(gè)洗脫過(guò)程。蛋白質(zhì)溶液的去鹽處理（使用PD-10去鹽柱）（1）用10ml的starting buffer平衡PD-10去鹽柱。（2）上樣：往PD-10去鹽柱中加入2.5ml的蛋白質(zhì)溶液。（3）用10ml的starting buffer去洗PD-10去鹽柱，開始收集濾出液，每1ml收集一管。離心管應(yīng)該先在冰上預(yù)冷。（4）電泳檢測(cè)重組蛋白質(zhì)的純化程度。（5）具體方法和過(guò)程與上面步驟一致。（6）選擇合適的純化蛋白樣品，加入1倍體積的預(yù)冷甘油。接著將蛋白質(zhì)樣品置于80保存，以備使用?！咀⒁狻縋D-10去鹽柱可以多次反復(fù)使用，但是不能使柱子變干，保存時(shí)應(yīng)該用相應(yīng)的緩沖液浸泡，并且置于4。圖 1：PD-10去鹽柱除去鹽離子示意圖（載自Amersham Biosciences產(chǎn)品說(shuō)明）8.4.1.3 His-tag NOTE（1）若His標(biāo)簽蛋白沒有結(jié)合，請(qǐng)依次檢查：可能原因1：樣品或者是結(jié)合緩沖液不正確。策略：檢測(cè)pH 及樣品和結(jié)合緩沖液的組成份。確保在溶液中鰲合劑或強(qiáng)還原劑的濃度及咪唑的濃度不是太高?？赡茉?：組氨酸的標(biāo)簽沒有完全的暴露。策略：在變性條件下(用48 M 脲，或46 M鹽酸胍)進(jìn)行純化?？赡茉?：HIS標(biāo)簽丟失。策略1：WB或者anti-his的抗體檢查His是否表達(dá)，上游構(gòu)建，改變his-tag的位置(C-terminal or N-terminal)，必要時(shí)增加his個(gè)數(shù)(常用610個(gè))；策略2：孵育的時(shí)間不夠，降低流速和增加孵育的時(shí)間；策略3：改變螯合的金屬離子，尋找到最佳的結(jié)合金屬離子。（2）若沒有洗脫下來(lái)，請(qǐng)依次檢查：可能原因1：洗脫條件太溫和（組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)仍然結(jié)合在柱上，結(jié)合力較強(qiáng)）。策略：用增加咪唑的梯度洗脫或降低pH來(lái)找出最佳的洗脫條件。可能原因2：降低PH的方法洗脫的，因?yàn)槿鬚H低于3.5，會(huì)導(dǎo)致鎳離子脫落。策略：改變洗脫辦法，咪唑競(jìng)爭(zhēng)性洗脫?？赡茉?：蛋白已沉淀在柱上。策略：減少上樣量，或使用咪唑的線性梯度而不是分步洗脫以降低蛋白的濃度。試用去污劑或改變NaCl的濃度，或在變性條件(去折疊)下洗脫(用48 M脲，或46 M 鹽酸胍)?？赡茉?：非特異性疏水或其他相互反應(yīng)。策略：加非離子去污劑到洗脫緩沖液（如，2%Triton X-100）或增加NaCl的濃度。（3）HIS標(biāo)簽蛋白洗脫后雜帶較多，什么原因? 如何優(yōu)化?高純度的蛋白是純化工作者的追求，但是由于很多天然的蛋白也會(huì)帶有HIS，所以經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)HIS標(biāo)簽蛋白洗脫后有一些雜帶，可能的原因和優(yōu)化的方法如下：可能原因1：蛋白酶部分降解了標(biāo)簽蛋白。策略：請(qǐng)?zhí)砑拥鞍酌敢种苿?，（慎用EDTA）?？赡茉?：雜質(zhì)對(duì)鎳離子有更高的親和性。策略1：咪唑濃度必須優(yōu)化，以確保高純度（宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的低結(jié)合）和高產(chǎn)率（組氨酸標(biāo)記的目標(biāo)蛋白質(zhì)的強(qiáng)結(jié)合）之間的最佳平衡。分步或者線性洗脫摸索出最優(yōu)的咪唑結(jié)合和清洗濃度；在樣品中加入與結(jié)合緩沖液同樣濃度的咪唑；咪唑的梯度不大（20個(gè)或更多的柱床體積），可能分離出有相似結(jié)合強(qiáng)度的蛋白。策略2：篩選最適合的緩沖液條件，NaCl濃度，PH的范圍都需要進(jìn)行篩選，以便決定最適的結(jié)合和洗脫條件。對(duì)于單一目標(biāo)蛋白在進(jìn)行緩沖液篩選時(shí)，將緩沖液、鹽、甘油和還原劑設(shè)計(jì)成幾個(gè)不同的混合配方?？赡茉?：雜質(zhì)和標(biāo)簽蛋白結(jié)合在一起。策略：在超聲破碎細(xì)胞之前加入去垢劑或者還原劑；增加去垢劑的濃度，（2 % Triton X-100 or 2 % Tween 20）；或者在wash buffer中增加甘油的濃度（50%）減少非特異性的相互反應(yīng)；考慮增加咪唑的濃度或者改變金屬離子可能原因4：洗滌不充分。策略：增加洗滌的次數(shù),使洗滌充分。8.4.1.4 NTA樹脂的再生NTA樹脂在使用若干次數(shù)（35次）后，結(jié)合效率有所下降，可以用以下方法再生，提高樹脂的使用壽命和蛋白質(zhì)的結(jié)合效率。注意：NTA樹脂再生前需要從層析柱下端流干所有溶液，估計(jì)出NTA的樹脂體積，按下列次序?qū)⒃偕噭┘拥綄游鲋?，在等上一再生溶液流干后，再加下一再生溶解。用戶需要自行?zhǔn)備25%，50%，75%，100%（v/v）乙醇和去離子水。NTA再生步驟：（1）從層析柱下端流干所有溶液，用2倍NTA樹脂體積的0.2M Acetic Acid/6M ganidine HCl 洗。（2）用2倍體積的去離子水洗。（3）用3倍體積的2% SDS洗。（4）用1倍體積的25%乙醇洗。（5）用1倍體積的50%乙醇洗。（6）用1倍體積的75%乙醇洗。（7）用5倍體積的100%乙醇洗。（8）用1倍體積的75%乙醇洗。（9）用1倍體積的50%乙醇洗。（10）用1倍體積的25%乙醇洗。（11）用1倍體積的去離子水洗。（12）用5倍體積的0.1M EDTA pH8.0洗。（13）用3倍體積的去離子水洗。（14）如果立即使用，用5倍體積的100mM NiSO4.6H2O洗，再用10倍體積的平衡溶液（NTA-0 buffer或GNTA-0 buffer）洗。（15）如果想長(zhǎng)期儲(chǔ)存，加入1倍體積的20%乙醇，4度保存，使用前需要執(zhí)行步驟14。8.4.2 GST 親和標(biāo)簽的純化谷胱甘肽S- 轉(zhuǎn)移酶（GST）是繼組氨酸之后的第二個(gè)應(yīng)用最多的重組蛋白標(biāo)記。GST 融合于目標(biāo)蛋白的N端，可以通過(guò)谷胱甘肽-瓊脂糖親和層析進(jìn)行純化。由于GST 對(duì)底物還原性谷胱甘肽的親和力是亞摩爾級(jí)的，因此谷胱甘肽固化于瓊脂糖形成的親和層析樹脂對(duì)GST 及其融合蛋白的純化效率很高。用1ml 的樹脂純化1L 的大腸桿菌培養(yǎng)物可得到的目的蛋白產(chǎn)率為0.16.0 mg。GST 親和純化融合蛋白主要包括結(jié)合，洗滌，洗脫三個(gè)步驟，全過(guò)程只需要一到兩種緩沖液，可以大量純化，也可以小量的實(shí)現(xiàn)快速純化。非常適合實(shí)驗(yàn)室小量制備大腸桿菌重組蛋白。下面以克隆到表達(dá)載體pGEX-6p-1上的GFP 表達(dá)純化為例，介紹一種小量快速的純化方法，供大家參考。蛋白的誘導(dǎo)與樣品的制備方法基本同上。8.4.2.1 GST 親和標(biāo)簽純化的使用（1）從4冷柜中取出Gltathione Sepharose 4B（本產(chǎn)品購(gòu)置GE公司，儲(chǔ)存于20%乙醇，樹脂的量和20%乙醇1：1），輕柔、充分翻轉(zhuǎn)搖勻樹脂懸濁液。（2）用寬嘴吸頭吸取1ml 的脂漿，加入到裝有40ml 的PBS(整個(gè)操作過(guò)程所有的PB均需預(yù)冷) V型離心管中，輕柔顛倒數(shù)次，洗滌除去殘留的20%乙醇，2000 rpm，離心5min，小心傾倒出PBS。（3）將破碎后的上清加入平衡上一步驟中的樹脂中，輕輕混勻，4振蕩溫育，500 rpm ，1h，期間不斷混勻，防止樹脂沉淀，保GST-GFP 充分結(jié)合于樹脂上。（4）2000 rpm，離心5min，小心傾倒出上清。（5）向沉淀中加入約40ml 的PBS，輕柔混勻，振蕩溫育10 min，2000 rpm，離心5min，小心傾倒出上清。（6）重復(fù)步驟（5）一次，然后向沉淀中加入5ml 的PBS 懸浮樹脂，并將懸浮液轉(zhuǎn)移到一個(gè)10ml 的塑料層析柱，并打開閥門放掉PBS。（7）洗脫收集目的蛋白。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要不同有兩種方法來(lái)收集目的蛋白。方法一：是不切除GST-tag，可以向（6）中的樹脂中加入12ml 的洗脫緩沖液（50 mM Tris-HCl，10 mM 還原性谷胱甘肽（GSH），pH 8.0），輕輕混勻然后4溫育10min，收集流出液，即為GST-GFP的純化產(chǎn)物。方法二：是純化不含GST-tag 的蛋白，按照說(shuō)明書將蛋白酶PreScission Protease（GE公司）用PBS 稀釋到到1ml，加入到（6）中的樹脂中，輕輕混勻然后4溫育12h，收集流出液，即為GFP的純化產(chǎn)物。（8）SDS-PAGE 分析純化的蛋白?？梢詫?duì)操作過(guò)程中的每一步取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析。8.4.2.2 Gltathione Sepharose 4B 再生GSTBind樹脂可以重復(fù)使用數(shù)次而無(wú)需再生。但隨著非特異性結(jié)合的蛋白的增多和蛋白的聚集，往往會(huì)造成流速和結(jié)合載量都下降。為了去除結(jié)合在樹脂上的蛋白，可以用10倍體積的50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，pH8.0洗樹脂，接著用10倍體積的100mM醋酸鈉pH4.5，0.5M NaCl再洗一次。其它可以選用做去除污染蛋白的緩沖液還包括：6M尿素，6M鹽酸胍或低極性溶劑，如5070%乙醇或50%乙二醇。任何上述處理后應(yīng)該立即用10倍柱體積1X GST Bind/Wash buffer平衡。樹脂可以在4下，20%乙醇/80%水中長(zhǎng)時(shí)間存放。8.4.2.3 GST使用過(guò)程中可能的問(wèn)題與對(duì)策（1）目標(biāo)蛋白結(jié)合效率低結(jié)合條件不對(duì)：仔細(xì)核對(duì)各種溶液、緩沖液的成分和pH。低于pH6.5或高于pH8時(shí)，融合蛋白與GSTBind樹脂會(huì)結(jié)合不充分。確保樹脂在與細(xì)胞裂解液結(jié)合前經(jīng)過(guò)pH6.58.0緩沖液（如1X GST Bind/Wash buffer，PBS）的平衡細(xì)胞裂解前加入DTT會(huì)顯著改善某些GST融合蛋白與GSTBind樹脂的結(jié)合GST融合蛋白被超聲打斷降解：過(guò)度超聲會(huì)破壞帶標(biāo)簽的蛋白而減少其與樹脂的結(jié)合。采用溫和的超聲條件或改用其它的破碎方法。蛋白的折疊問(wèn)題：GST 標(biāo)簽不能夠正確的折疊難以結(jié)合GSH的底物。（2）蛋白難以洗脫洗脫體積太少：有時(shí)需要使用更多的緩沖液洗脫目的蛋白。洗脫緩沖液不新鮮： 10XGST洗脫緩沖液20下可以穩(wěn)定存放6個(gè)月，最多耐受5次凍融。每次在臨純化前新鮮配制1X洗脫緩沖液洗脫緩沖液中谷胱甘肽濃度太低：GSTBind樹脂的還原型谷胱甘肽濃度達(dá)到10mM就夠了。但是洗脫時(shí)需要的還原型谷胱甘肽的濃度需要達(dá)到75mM。（3）純化的蛋白雜質(zhì)很多表達(dá)的蛋白不完整：再遇到一些稀有密碼子或者特殊的RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，可能使得目標(biāo)蛋白截短表達(dá)，可采用一些特殊的表達(dá)宿主，如Rosetta系列。洗滌體積不夠：增加洗脫量。洗脫條件：可已在洗脫緩沖液中加入一定量的非離子去污劑，如0.1%的Triton-100 或NP-40等。也可以嘗試提高洗脫時(shí)NaCl 的濃度，以降低非特一性的結(jié)合。操作過(guò)程中目標(biāo)蛋白降解：控制操作條件，比如嚴(yán)格4操作，緩沖液中加入蛋白酶抑制劑，超聲處理過(guò)度：減少超聲，避免發(fā)泡導(dǎo)致蛋白變性。過(guò)度超聲還會(huì)增加宿主內(nèi)源蛋白與GST融合目的蛋白共純化共價(jià)共純化：膠上有些多出來(lái)的條帶是共純化的促進(jìn)蛋白正確折疊的分子伴侶，如：DnaK（70kDa），DnaJ（37kDa），GrpE（40kDa），GroEL（57kDa），和GroES（10kDa），再進(jìn)行一次純化可以改善。8.4.3MBP 親和標(biāo)簽的純化原理：pMAL系統(tǒng)是一種高效的蛋白融合表達(dá)及純化系統(tǒng)。pMAL載體含有編碼麥芽糖結(jié)合蛋白（Maltose Binding Protein, MBP）的大腸桿菌malE基因，其下游的多克隆位點(diǎn)便于目的基因插入，表達(dá)N端帶有MBP的融合蛋白。通過(guò)“tac”強(qiáng)啟動(dòng)子和malE翻譯起始信號(hào)使克隆基因獲得高效表達(dá)，并進(jìn)一步利用MBP對(duì)麥芽糖的親和性達(dá)到用Amylose柱對(duì)融合蛋白的一步親和純化。 此系統(tǒng)的pMAL載體含有LacZ基因，目的基因的插入導(dǎo)致其失活，通過(guò)X-gal平板可進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。 pMAL載體都含有一段編碼蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的序列，融合蛋白純化后，通過(guò)Factor Xa（X），Enterokinase（E）或GenenaseTM I（G）可將目的蛋白與MBP切割分離。pMALTM-c2 系列載體缺失malE 信號(hào)序列，導(dǎo)致融合蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。pMAL-p2系列載體含有malE 信號(hào)序列，它可引導(dǎo)融合蛋白穿過(guò)胞質(zhì)膜，進(jìn)入周質(zhì)。所有這些載體都含有一段編碼蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的序列，融合蛋白純化后，通過(guò)Factor Xa（X），Enterokinase（E）或GenenaseTM I（G）可將目的蛋白與MBP切割分離。Amylose 樹脂預(yù)裝柱是一親和基質(zhì)，用來(lái)分離與麥芽糖結(jié)合蛋白融合的目的蛋白。結(jié)合容量：每毫升柱床體積可結(jié)合3.0 mg MBP-Paramyosin 融合蛋白。貯存：本品預(yù)膨脹在20%的乙醇中，4C貯存。過(guò)柱緩沖液：20 mM Tris-HCl， pH7.4，200 mM NaCl，1 mM EDTA。添加劑：1 mM sodim azide；10 mM mercaptoethanol 或1 mM DTT。洗脫緩沖液：過(guò)柱緩沖液+10 mM 麥芽糖實(shí)驗(yàn)步驟：（1）重組質(zhì)粒的構(gòu)建，轉(zhuǎn)化，融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和細(xì)胞破碎同上。（2）融合蛋白的親和純化：預(yù)裝柱用812倍柱床體積的雙蒸水沖洗；預(yù)裝柱用9倍柱床體積過(guò)柱緩沖液平衡；將上述實(shí)驗(yàn)步驟三的上清液加入到柱床內(nèi)，控制流速0.51 ml/min（建議每次上樣24ml）。用12倍柱床體積的過(guò)柱緩沖液淋洗未結(jié)合蛋白，每次用6ml，共4次。用4倍柱床體積的洗脫緩沖液洗脫與Amylose樹脂結(jié)合的MBP融合蛋白，控制流速約0.51 ml/min。收集35管樣品洗脫液，收集體積為1 ml/每管。通常，含目的蛋白的融合蛋白在一個(gè)柱床體積內(nèi)將被洗脫下來(lái)，可以通過(guò)波長(zhǎng)為280 nm的紫外吸收光或考馬斯亮藍(lán)蛋白檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)。SDS-PAGE檢測(cè)洗脫樣品*。再生。每次純化蛋白完畢后，需要及時(shí)對(duì)Amylose樹脂進(jìn)行再生。 Amylose樹脂可以采用下述清洗步驟進(jìn)行再生水3倍柱床體積0.1% SDS3倍柱床體積水1倍柱床體積過(guò)柱緩沖液3倍柱床體積【注意事項(xiàng)】（1）每次使用時(shí)，請(qǐng)先打開頂端的帽子再移去底部的帽子，以避免氣泡進(jìn)入到預(yù)裝柱內(nèi)。（2）在使用本預(yù)裝柱時(shí)，請(qǐng)使用經(jīng)過(guò)脫氣后的緩沖液，以避免產(chǎn)生氣泡。（3）預(yù)裝柱在每次使用完畢后，在柱床上方加入24 ml 緩沖液或水，蓋上頂端的帽子后，隨即蓋上底部的帽子，豎立放置于4貯存。（4）長(zhǎng)期貯存時(shí)應(yīng)貯存在含0.02疊氮鈉的緩沖液中或20乙醇中，以避免染菌?！緋MAL系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)】（1）75%的蛋白可獲得高效表達(dá)，蛋白產(chǎn)量可達(dá)100 mg/L （2）與其他幾種常用表達(dá)系統(tǒng)研究比較，與MBP融合表達(dá)更能提高E. coli表達(dá)蛋白的可溶性。（3）采用麥芽糖溫和洗脫：無(wú)去污劑或變性劑對(duì)蛋白活性的影響。（4）可在細(xì)胞質(zhì)或周質(zhì)中表達(dá)（pMAL-p2X載體）：周質(zhì)表達(dá)可提高二硫鍵的形成，促進(jìn)蛋白折疊的形成。8.5目的蛋白的后處理8.5.1目的蛋白的濃縮蛋白的濃縮液是蛋白純化過(guò)程中常用的操作，常用的方法有：（1）透析袋濃縮法利用透析袋濃縮蛋白質(zhì)溶液是應(yīng)用最廣的一種。將要濃縮的蛋白溶液放入透析袋（無(wú)透析袋可用玻璃紙代替），結(jié)扎，把高分子（6 00012 000）聚合物如聚乙二醇（碳蠟）、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可將吸水劑配成3040濃度的溶液，將裝有蛋白液的透析袋放入即可。吸水劑用過(guò)后，可放入溫箱中烘干或自然干燥后，仍可再用。（2）冷凍干燥濃縮法這是濃縮蛋白質(zhì)的一種較好的辦法，它既使蛋白質(zhì)不易變性，又保持蛋白質(zhì)中固有的成分。它是在冰凍狀態(tài)下直接升華去除水分。具體做法是將蛋白液在低溫下冰凍，然后移置干燥器內(nèi)（干燥器內(nèi)裝有干燥劑，如NaOH、CaCl2和硅膠等）。密閉，迅速抽空，并維持在抽空狀態(tài)。數(shù)小時(shí)后即可獲得含有蛋白的干燥粉末。干燥后的蛋白質(zhì)保存方便，應(yīng)用時(shí)可配成任意濃度使用。也可采用凍干機(jī)進(jìn)行冷凍干燥。（3）超濾膜濃縮法此法是利用微孔纖維素膜通過(guò)高壓將水分濾出，而蛋白質(zhì)存留于膜上達(dá)到濃縮目的。有兩種方法進(jìn)行濃縮：一種是用醋酸纖維素膜裝入高壓過(guò)濾器內(nèi)，在不斷攪拌之下過(guò)濾。另一種是將蛋白液裝入透析袋內(nèi)置于真空干燥器的通風(fēng)口上，負(fù)壓抽氣，而使袋內(nèi)液體滲出。（4）凝膠濃縮法選用孔徑較小的凝膠，如SephadexG25或G50，將凝膠直接加入蛋白溶液中。根據(jù)干膠的吸水量和蛋白液需濃縮的倍數(shù)而稱取所需的干膠量。放入冰箱內(nèi)，凝膠粒子吸水后，通過(guò)離心除去。8.5.2蛋白質(zhì)的定量定量作為生物實(shí)驗(yàn)室的日常工作之一，具有非常重要的意義。在生物學(xué)相關(guān)的研究中，無(wú)論是對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)譜的定量比較還是蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的分析，都建立在準(zhǔn)確的定量這一基礎(chǔ)之上。蛋白質(zhì)的快速定量方法主要依靠蛋白質(zhì)本身的發(fā)色基團(tuán)，或其與其它顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生的紫外吸收來(lái)進(jìn)行定量。目前常用的主要有直接紫外吸收法、Bradford法和Lorry法三種。（1）直接紫外吸收法由于蛋白質(zhì)中存在著含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，所以任何一個(gè)蛋白質(zhì)都具有280nm附近的紫外吸收峰，在此波長(zhǎng)范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光密度OD280nm與其濃度呈正比關(guān)系，我們可以對(duì)其進(jìn)行定量。紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量迅速、簡(jiǎn)便、不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測(cè)定。因此，已在蛋白質(zhì)和酶的生化制備中廣泛采用，尤其在柱層析分離純化中，常用280nm進(jìn)行紫外檢測(cè)，來(lái)判斷蛋白質(zhì)吸附或洗脫情況。但該法存在無(wú)法彌補(bǔ)的缺陷。首先，對(duì)于測(cè)定那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差，故該法適于測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。其次，若樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大干擾。例如，在制備酶的過(guò)程中，層析柱的流出液中有時(shí)混雜有核酸，應(yīng)予以校正。（2）Bradford法目前，實(shí)驗(yàn)室一般不采用紫外吸收法，而通常采用改良的Bradford法進(jìn)行測(cè)定蛋白質(zhì)含量。其原理為，蛋白質(zhì)與染料考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合，使得染料最大吸收峰從465nm變?yōu)?95nm，在一定的線性范圍內(nèi)，反應(yīng)液595nm處吸光度的變化量與反應(yīng)蛋白量成正比，測(cè)定595nm處吸光度的增加即可進(jìn)行蛋白定量。測(cè)定時(shí)一般用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品。該法測(cè)定要求樣品中不能有能與考馬斯亮藍(lán)G-250反應(yīng)顯色的去污劑，比如Triton、NP-400、吐溫等。與具體操作可參考相關(guān)試劑盒說(shuō)明書。（3）Lorry法其原理是蛋白質(zhì)與堿性銅溶液中的Cu2+絡(luò)和使得肽鍵伸展，從而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在堿性銅條件下與福林試劑反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色，在一定濃度范圍內(nèi)，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比，由于各種蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在測(cè)定時(shí)需使用同種蛋白質(zhì)作標(biāo)準(zhǔn)。具體操作可參考相關(guān)試劑盒說(shuō)明書。一般而言，紫外吸收法適合于與色譜柱聯(lián)用，達(dá)到實(shí)時(shí)監(jiān)控，然而較不準(zhǔn)確。Bradford法適合于大規(guī)模測(cè)定樣品，但是樣品中不能含有太高濃度的去污劑，對(duì)樣品的要求較高。改良的Lorry法不再排斥去污劑，相對(duì)的操作就比較復(fù)雜。我們需要在試驗(yàn)中按照要求選用不同的定量方法。目前后兩種常用的定量方法都有相關(guān)的試劑盒采用。8.5.3蛋白的保存純化的蛋白往往需要在一定的保存條件，以保證目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定，避免活性喪失。蛋白溶液的保存原則：（1）緩沖液pH 避免接近蛋白的等電點(diǎn)；（2）根據(jù)每次使用的量分裝成多管，這樣可避免反復(fù)凍融；（3）加入穩(wěn)定劑如甘油，DTT, TritonX-100等。具體操作根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要和蛋白特性，多數(shù)蛋白都可以加入終濃度為50%的甘油后80保存。