熒光蛋白基因在大腸桿菌中的表達與檢測.doc

綠色熒光蛋白基因在大腸桿菌中的表達與檢測一、 背景介紹1綠色熒光蛋白1955年，Davenport和Nicol 在太平洋海里的一種發(fā)光生物維多利亞水母(Aequorea victoria)中發(fā)現并發(fā)表了熒光蛋白的生物發(fā)光現象，但是對生物發(fā)光現象的機理并不了解。1962年，日本科學家下村修在水母中純化鑒定出了一種能催化化學發(fā)光的蛋白質分子并將其命名為aequorin，aequorin能將化學能轉化為光能，從而產生出波長為470nm的藍色光(lmax=470nm)，但是水母發(fā)出的光是獨有的綠色，因此水母發(fā)光的蛋白質并非 aequorin。與此同時，發(fā)現和分離了一個受紫外線激發(fā)能發(fā)出綠色熒光的蛋白質綠色熒光蛋白(GFP)。1971年，Morin和Hastings提出了GFP這個名稱。1985到1992年間，科學家 Douglas Prasher 測定完成了aequorin 和GFP的基因和蛋白質序列，并通過蛋白質序列分析和核磁共振分光術(NMR spectroscopy)確定了GFP發(fā)光位點。1994年，美國科學家錢永健開始改造GFP，目前所用的大多數是錢永健實驗室改造后的變種，有的熒光更強，有的可激活、變色。1996年，解析得到了GFP的晶體結構，它的發(fā)光過程是也在日后的應用中得到了解答?？v觀整個過程，從1961年到1974年，下村修的研究遙遙領先，卻很少有人注意。在1974年以后，特別是八十年代后，綠色熒光蛋白的研究得到了廣泛的重視和發(fā)展。綠色熒光蛋白，分子質量約為28kDa，由238個氨基酸構成，第6567位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成發(fā)光團，經共價鍵連接而成對羥苯甲基咪唑烷酮，它可以被光激發(fā)產生熒光，是主要發(fā)光的位置。綠色熒光蛋白分子的形狀呈圓柱形，就像一個桶，發(fā)光的基團位于桶中央，因此，它可形象地比喻成一個裝有色素的“油漆桶”。其發(fā)光團的形成不具有物種專一性，發(fā)出的熒光穩(wěn)定，且不需要依賴其他基質而發(fā)光。GFP的優(yōu)點很多：首先，它本身穩(wěn)定，不需要任何反應底物和輔助因子，且無種屬限制，可在多種生物細胞中表達發(fā)出穩(wěn)定熒光，在450490nm 藍光激發(fā)下,發(fā)光能保持 10min 以上。其次，其分子量小，對目的基因的功能無任何影響，融合蛋白具有與GFP一樣的熒光性質，對細胞沒有毒性。最后，GFP觀察方便，利用激光掃描共聚焦顯微鏡，甚至普通顯微鏡都可以觀察到活細胞內蛋白的變化、活動，用肉眼就可對辨別細胞是否表達及其表達水平。作為一種新型的報告基因， 綠色熒光蛋白在生命科學的各個領域得到廣泛的應用：利用綠色熒光蛋白的特有發(fā)光機制，可將GFP作為蛋白標簽。就是利用 DNA 重組技術，將目的基因與GFP基因構成融合基因，轉染或轉化至合適的細胞進行表達，而后借助熒光顯微鏡觀察細胞內活體中標記的蛋白質。綠色熒光蛋白也可用于大規(guī)模藥物篩選。另外，由于綠色熒光蛋白獨特的光信號傳導機制及其在表達后易被周圍化學環(huán)境和蛋白之間的相互作用影響的特性，極適用于成為活細胞體內的光學感受器。近年來，由于融合抗體具有發(fā)射熒光和與抗原結合兩種特性，所以將其用做免疫染色的檢測試劑，直接用于流式細胞儀、免疫熒光的標記、腫瘤的檢測等。目前應用較多的是GFP的突變體增強型綠色熒光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein，簡稱EGFP）。EGFP將GFP的第64位氨基酸苯丙氨酸突變成為亮氨酸，從而發(fā)射出的熒光強度比GFP大6倍以上。所以，EGFP比GFP更適合作為報告基因來研究基因表達、調控、細胞分化及蛋白質在生物體內的定位和轉運等EGFP (720bp)的基因片段: ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA2.大腸桿菌表達載體及表達系統(tǒng)大腸桿菌質粒是一類獨立于染色體外自主復制的雙鏈、閉環(huán)DNA分子，大腸桿菌質粒可分為結合轉移型和非結合轉移型兩種，非結合轉移型質粒在通常培養(yǎng)條件下不在宿主間轉移，整合到染色體上的頻率也很低，具有遺傳學上的穩(wěn)定性和安全性。又因其大小一般在250kb范圍內，適合于制備和重組DNA的體外操作，因此幾乎所有的大腸桿菌表達系統(tǒng)都選用非結合轉移型質粒作為運載外源基因的載體，這些表達載體通過對天然質粒的改造獲得。理想的大腸桿菌表達載體要求具有以下特征：（1）穩(wěn)定的遺傳復制、傳代能力，在無選擇壓力下能存在于大腸桿菌細胞內。（2）具有顯性的轉化篩選標記。（3）啟動子的轉錄是可以調控的，抑制時本底轉錄水平較低。（4）啟動子的轉錄的mRNA能夠在適當的位置終止，轉錄過程不影響表達載體的復制。（5）具備適用于外源基因插入的酶切位點。復制子、篩選標志、啟動子、終止子和核糖體結合位點是構成表達載體的最基本元件。大腸桿菌表達系統(tǒng)是基因表達技術中發(fā)展最早，目前應用最廣泛的經典表達系統(tǒng)。一個完整的大腸桿菌表達系統(tǒng)至少要有表達載體和宿主菌兩部分構成。為了改善表達系統(tǒng)的性能和對各類外源基因的適應能力，表達系統(tǒng)有時還需要有特定功能基因的質?；蛉茉椿晒勼w參與。到目前為止已經成功發(fā)展了許多表達載體和相應的宿主菌。由于大腸桿菌本身的蛋白質翻譯后修飾加工體系相當不完善，因此不能對重組蛋白質進行修飾加工，這是大腸桿菌系統(tǒng)與其它表達系統(tǒng)相比存在的一個比較突出的缺陷。大腸桿菌的表達系統(tǒng)包括：Lac和Tac表達系統(tǒng)，這是最早建立并得到廣泛應用的表達系統(tǒng)，它是以大腸桿菌lac操縱子調控機理為基礎設計、構建的表達系統(tǒng)。PL和PR表達系統(tǒng)，它是以噬箘體早期轉錄啟動子PL、PR為核心構建的表達系統(tǒng)稱為PL和PR表達系統(tǒng)。T7表達系統(tǒng)，大腸桿菌T7噬箘體具有一套專一性非常強的轉錄體系，利用這一體系中的元件為基礎構建的表達系統(tǒng)稱為T7表達系統(tǒng)。此外還有其他表達系統(tǒng)，如營養(yǎng)調控型、糖原調控型、pH調控型等。3SDS-PAGE原理SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進SDS，SDS能斷裂分子內和分子間氫鍵，破壞蛋白質的二級和三級結構，強還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質在一定濃度的含有強還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結合，形成帶負電荷的SDS-蛋白質復合物，這種復合物由于結合大量的SDS，使蛋白質喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的負離子團塊，從而降低或消除了各種蛋白質分子之間天然的電荷差異，由于SDS與蛋白質的結合是按重量成比例的，因此在進行電泳時，蛋白質分子的遷移速度取決于分子大小。當分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質的遷移率和分子量的對數呈線性關系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數，若將已知分子量的標準蛋白質的遷移率對分子量對數作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質在相同條件下進行電泳，根據它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量。SDS- 聚丙烯酰胺凝膠使用一種不連續(xù)的緩沖系統(tǒng)。在這一系統(tǒng)中，一般凝膠分為低濃度的成層膠（濃縮膠）和較高濃度的分離膠。在電泳時， SDS-多肽復合物向兩膠界面遷移，在分離膠表面形成了一個極薄的層，極大地濃縮了樣品的體積，使樣品在分離之前處于同一起跑線。一般來說，在被分析的蛋白質穩(wěn)定的pH范圍，凡是不與SDS發(fā)生相互作用的緩沖液都可以使用，但緩沖液的選擇對蛋白帶的分離和電泳的速度是非常關鍵的。Tris-甘氨酸系統(tǒng)是目前使用最多的緩沖系統(tǒng)。如果要測定糖蛋白的分子量，最好采用Tris-硼酸鹽緩沖系統(tǒng)，對于分子質量小于15kDa的蛋白樣品，可以使用SDS-尿素系統(tǒng)，也可以采用Tris-tricine緩沖系統(tǒng)。4.蛋白分離與檢測蛋白質的分離方法很多，依據分子大小分離的方法包括：透析和超過濾，透析指利用蛋白質分子不能通過半透膜而與小分子分離；超濾是利用壓力或離心力使小分子溶質通過半透膜而蛋白質被截留在膜上而分離。密度梯度離心，蛋白質顆粒在具有密度梯度的介質中離心時，質量和密度大的顆粒比質量和密度小的顆粒沉降得快，且每種蛋白質顆粒沉降到與其自身密度相等的介質密度梯度時，即停止不前，最后各種蛋白質在離心管中被分離成不同的區(qū)帶。凝膠過濾，即分子排阻層析。凝膠顆粒內部為多孔的網狀結構。大分子最先流出層析柱。根據溶解度分離的方法包括：鹽溶和鹽析，中性鹽在低濃度時可增加蛋白質的溶解度，即鹽溶。原因是蛋白質分子吸附鹽類離子后，帶電層使蛋白質分子彼此排斥，而與水分子相互作用加強；當離子強度增大到足夠高時，此時與蛋白質疏水基團接觸的自由水被移去以溶劑化鹽離子，導致蛋白質疏水基團暴露，使蛋白質因疏水作用凝聚沉淀。根據所帶電荷分離的方法包括：電泳（凈電荷、分子大小、形狀），區(qū)帶電泳、聚丙烯酰氨凝膠電泳（PAGE）、毛細管電泳離子交換層析。其余的方法還有吸附層析、親和層析、高效液相層析（HPLC）,快速蛋白液相層析（FPLC）等。蛋白質的檢測方法包括：凱氏定氮法，它是樣品與濃硫酸共熱。含氮有機物即分解產生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。經強堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據此酸液被中和的程度可計算得樣品之氮含量。雙縮尿法，雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個分子脲經180左右加熱，放出一個分子氨后得到的產物。在強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能過一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應。Folin酚試劑法，此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。這兩種顯色反應產生深藍色的原因是：在堿性條件下，蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物。Folin酚試劑中的磷鉬酸鹽磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產生深藍色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，藍色深度與蛋白的量成正比。紫外吸收法，蛋白質分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質具有吸收紫外光的性質。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質含量成正比。此外，蛋白質溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下，蛋白質溶液的光吸收值與蛋白質濃度的正比關系，可以進行蛋白質含量的測定。5. pET28a 質粒pET28a 質粒作為表達載體, 該質粒含有強啟動子T7 啟動子, 可以使目的基因得到高效表達。其N端含有Thrombin蛋白酶切位點。 Pet28a的抗性是kana抗性，通常所用的表達菌株是BL21（DE3），BL21（DE3）Gold等BL21（DE3）系列的宿主菌。pET28a, b, c的差異僅僅存在于多克隆位點處，Pet28a和pET28b，pet28c的載體的區(qū)別是差了一個核苷酸堿基，目的是便于在進行克隆構建的時候調整氨基酸讀碼框，使得基因都可以克隆到這個系列目的載體中去。pET28a：5 測序引物及序列:T7: 5-TAATACGACTCACTATAGGG-33 測序引物序列:T7t: 5-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3二 試驗流程1. 實驗器材及試劑超低溫冰箱、電熱恒溫培養(yǎng)箱、恒溫調速搖床、PCR 擴增儀、電泳儀、高速冷凍離心機、電子天平、水浴鍋、低溫高速離心機、快速混勻器、EGFP-N3 模板、菌株E. coli DH5、E. coli BL21、質粒 pET28a、限制性內切酶 EcoR, Hind 、T4 DNA 連接酶、DNA 凝膠回收試劑盒及質粒、小提試劑盒、DNA 純化試劑盒及 IPTG、PCR用試劑、卡那霉素、瓊脂糖及 PCR 合成引物等、蛋白胨、酵母浸出粉、瓊脂粉等2. 實驗流程（實驗中樣品用量根據提取的各種載體、質粒的濃度相應的改變）2.1堿裂變法提質粒2.1.1細菌的培養(yǎng) 1) 添加適量的抗菌素（Ap: 20 mg/mL母液終濃度50100 ug/mL）（避免雜菌污染，防止質粒的丟失） 2) 接種（20 mL+Ap50 mL+Ap）3) 控制菌體的生長狀態(tài)（37過夜培養(yǎng)或轉接24菌液至新鮮培養(yǎng)基中， 37繼續(xù)培養(yǎng)至對數生長中后期）。2.1.2細胞裂解提取質粒DNA（4操作，每100mg菌體量，加入）1）稱離心管重W1，加入約1/2離心管的菌液，與另一組同學配平，6000r/min離心5min。2）棄去上清液，再加入5ml溶液，混勻，6000r/min離心5min，棄去上清液，稱離心管重量為W2，計算菌體量W。3）1.0mL溶液，充分渦旋震蕩，用溶液再次配平。4）2.0mL溶液，輕柔顛倒混勻，冰浴3-5min。5）15mL溶液，輕柔顛倒混勻，冰浴5min。6）12000rpm，15min；小心轉移上清到新的離心管中，記錄體積V。7）加入2V冰乙醇，顛倒混勻；-20,15min。8）12000rpm，15min，棄上清。9）加入5mL70%乙醇，12000rpm，3min，吸棄上清液。10）重復乙醇洗滌一次，37風干5-10min。11）分次加入1mLTE溶液并轉移到Ep管中，得到質粒DNA粗提物。12）加入50ulRNase（10mg/ml），終濃度為50ug/ml，37孵育1-2h。2.1.3質粒DNA的純化1）1ml粗提物均分于兩個Ep管中，加入等體積Tris飽和酚，混勻，12000rpm離心5min。2）轉移上清V1至新管，加入V1的酚/氯仿/異戊醇混合液，混勻，12000rpm離心5min。3） 轉移上清V2至新管，加入V2的氯仿/異戊醇溶液，混勻，12000rpm離心5min。4）轉移上清V3至新管，加入1/10V3的3MNaAc溶液（pH=5.2），再加入2V4（V4=V3+1/10V3）的冰乙醇，混勻，-20保存30min。5）12000rpm離心14min，棄上清。 6）加入500ul70%乙醇洗滌，12000rpm離心2min，棄上清。7）重復洗滌一次，吸棄上清液，37風干5min。8）每管加入25ulTE溶解沉淀，合并，得到50ul純化質粒DNA。2.2重組質粒的構建2.2.1 EGFP和質粒DNA的酶切加樣順序為：ddH2O-Buffer（緩沖液）-DNA-限制性內切酶 Hind；在不同的1.5ml無菌離心管中，按照表1中、組樣量順序加入各組分（將少量的樣品加在管壁上，確保加樣準確）。樣品混勻后，4000rpm離心1min，將液體集中于管底。酶切后，可以用電泳檢測一下酶切的效果。表1.限制性內切酶反應體系加樣順序加樣序號反應體系成分pUC19（各組）EGFP（商品）體積（l）體積（l）1ddH2O13.070.0210X M buffer2.010.03DNA4.015.04Hind（15U/l）1.05.0共計20.0100.0（50+50）備注各組1份全班1份2.2.2載體與外源片段的連接取無菌1.5mlEP管，加樣順序為：ddH2O-Buffer-pUC19/Hind- EGFP /Hind-T4DNA Ligase（見表二） 表2.T4連接酶反應體系加樣順序加樣序號成分體積（l）1ddH2O3.2210X T4 Ligase Buffer1.03pUC19/Hind1.54EGFP /Hind3.55T4DNA Ligase08共計10.02.3 重組DNA質粒的轉化、鑒定與篩選2.3.1 感受態(tài)細胞的制備（注意冰浴、離心）1倒LB平板，劃線活化E.coliDH5，培養(yǎng)一段時間。挑取單菌落接種到5mlLB液體中，37震蕩培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物按1%轉接至新鮮20mlLB液體，37，220rmp震蕩2-2.5h。2取2個干凈的Ep管（編號SG-1-1、SG-1-2），各加入上述菌液1.5ml,4000rmp離心5min，棄上清，再各加入1.5ml菌液，4000rmp離心5min，棄上清。3. 利用殘留液體渦旋細胞，然后加入800l預冷的0.1M CaCl2，冰浴懸浮細胞，隨后4000rmp離心5min，棄上清。4. 加入100l冷0.1M CaCl2，輕輕懸浮細胞，冰浴20min，之后將SG-1-2分裝50l至SG-1-3管中。2.3.2 質粒轉化 按表3的序號順序加樣、操作。表3.質粒轉化步驟：171234567實驗設組感受態(tài)細胞（l/管）DNA（l）冰浴熱擊冰浴復蘇培養(yǎng)基涂布平板實驗組100連接物5.010min90s5minLB：0.9ml/管，0.5-1h麥+Ap50l2100l2150l2200l2轉化對照50pUC19（自提）1.0麥+Ap50l1細胞對照50麥+Ap50l1麥50l1備注預留一個空白麥+Ap平板； 共計：11（麥+Ap）和1（麥），倒置于37恒溫箱中培養(yǎng)16-20h（本實驗兩天后來觀察結果）。2.3.3 重組子的篩選與培養(yǎng)1. 觀察幾天前的涂布培養(yǎng)結果并記錄，著重包括：菌落生長情況、生長的菌落的顏色、菌落數量的多少，并測量菌落的pH值。2. 從實驗組的2個50ul的平板中挑出4個白色單菌落，在事先預留的空白麥+Ap平板上分區(qū)劃線培養(yǎng)。將接好菌的平板放在恒溫培養(yǎng)箱中。2.4 PCR反應2.4.1試劑盒法提質粒1. 觀察上次劃線的平板中的菌落是否為白色。用燒好的鑷子夾著無菌牙簽劃取帶有重組質粒的E.coliDH5a（白色的菌落），將帶有質粒的E.coli接種于5ml LB/抗生素培養(yǎng)液中，37搖床培養(yǎng)1216個小時。2. 取1.05.0ml的菌液，室溫下10000xg離心1min收集細菌。3. 倒棄培養(yǎng)基，加入250ul Solution/RNase A混合液，漩渦震蕩使細胞完全懸浮。4. 往重懸混合液中加入250ul Solution，輕輕顛倒混勻46次，此操作避免劇烈混勻裂解液且裂解反應不要超過5min。5. 加入350ul Solution，溫和顛倒數次至形成白色絮狀沉淀。6. 室溫下，10000xg離心10min。7. 轉移上清液至套有2ml收集管的HiBind DNA結合柱中，室溫下，10000xg離心1min，倒去收集管中的濾液。8. 把柱子重新裝回收集管，加入500ul HB Buffer，按上述條件離心，棄去濾液。9. 把柱子重新裝回收集管，加入700ul DNA Wash Buffer，按上述條件離心，棄去濾液。注意：濃縮的DNA Wash Buffer在使用之前必須按標簽的提示用無水乙醇稀釋。10. 把柱子重新裝回收集管，10000xg離心空柱2min以甩干柱子基質。注意:不要忽略次步這對去除柱子中殘留的乙醇至關重要。11. 把柱子裝在干凈的1.5ml離心管上，加入3050ul Elution Buffer到柱子基質中，靜置12分鐘，10000xg離心1min洗脫出DNA。2.4.2 PCR反應在進行PCR反應之前，可以用凝膠電泳檢測重組質粒，看一下重組質粒的大小，再用PCR擴增目的基因。以EGFP 片段為模板, 設計上游引物: 5-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3,下游引物: 5- GGCTGATTATGATCTAGAGTC-3?？梢韵葘⒛０暹m當稀釋，實驗要設置對照試驗，可根據需求自主設計加入各組分后，分別取模板、上游和下游引物、Taq酶（5u/ul）、dd水、10 Buffer、dNTP作為 PCR反應體系（可參照表4加），輕彈混勻加入的液體，快速離心集液于管底。將制備好的PCR體系放入PCR機器中，PCR的反應程序如表5。表4. PCR體系的建立編號組分加量（ul）1dd水13.2210Buffer2.03dNTP（2.5mM each）1.64M13F（10uM）15M13R（10uM）16摸板（1-10ng/ul）1.07Taq酶（5u/ul）0.2總體積20.0表5. PCR反應程序項目溫度時間預變性943min變性9430s復性5830s延伸7260s終延伸7210min保存42hr整個 PCR 反應體系共進行 35 個循環(huán)。擴增產物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳驗證。2.5重組表達載體的構建2.5.1 EGFP 基因和 pET28 a 表達載體的限制性酶切處理取上述經PCR擴增后的目的片段作為PCR反應的模板, 設計引入EcoR酶切位點的上游引物( 5GGAG / AATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG3)和 引 入Hind 酶切位點的下游引物( 5CCGA / AGCTTGGCTGATTATGATCTAGAGTC3)。PCR 反應體系及反應條件同2.4.2。擴增產物用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢驗。PCR后的EGFP片段進行雙酶切, 反應體系如下: 30L添加了酶切位點的 EGFP片段、5ul 10buffer、1ul EcoR(20 U/L)、1ul Hind ( 20 U/L) ,用無菌水將反應液調至 50 L 后,于 37下保溫1 h, 然后在 65條件下處理20min 進行熱失活。另一方面, 將pET28a 質粒載體按上述方法進行雙酶切?？梢杂铆傊悄z電泳對上述兩個酶切產物進行檢測。2.5.2 pET28a-EGFP重組表達載體的構建 將上述含酶切位點的EGFP片段與線性pET28a質粒按2：1比例、在45下保溫5 min 后, 置于冰浴中冷卻,冷卻后分別加入1ul T4DNA 連接酶、2ul10T4DNA連接酶緩沖液, 37培養(yǎng)過夜。2.6 EGFP 基因的原核表達及檢測 2.6.1制備E. coli BL21感受態(tài)細胞1倒LB平板，劃線活化E. coli BL21，培養(yǎng)一段時間。挑取單菌落接種到5mlLB液體中，37震蕩培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物按1%轉接至新鮮20mlLB液體，37，220rmp震蕩2-2.5h。2取2個干凈的Ep管（編號SG-1-1、SG-1-2），各加入上述菌液1.5ml,4000rmp離心5min，棄上清，再各加入1.5ml菌液，4000rmp離心5min，棄上清。3. 利用殘留液體渦旋細胞，然后加入800l預冷的0.1M CaCl2，冰浴懸浮細胞，隨后4000rmp離心5min，棄上清。4. 加入100l冷0.1M CaCl2，輕輕懸浮細胞，冰浴20min，之后分裝于管中2.6.2 pET28a-EGFP重組質粒的轉化、鑒定 按表6依次加入各物質。表6.質粒轉化步驟：171234567實驗設組感受態(tài)細胞（l/管）DNA（l）冰浴熱擊冰浴復蘇培養(yǎng)基涂布平板100pET28a-EGFP連接物5.010min90s5minLB：0.9ml/管，0.5-1h麥+卡那霉素50l2100l2150l2在含卡那霉素的培養(yǎng)基上，能生長的菌落均為轉化成功的菌落，可以挑選幾個單菌落，在準備好的培養(yǎng)基上劃線，37培養(yǎng)兩天，再從上面挑菌并劃平板，等平板上的菌長出后，在熒光下觀察，若菌落發(fā)綠色熒光，則證明試驗成功得到綠色熒光蛋白。 除此之外，還可對挑取的單菌落做菌落 PCR 檢驗, PCR 產物經 1%瓊脂糖凝膠電泳后,若發(fā)現在約750 bp 處有清晰條帶，則與理論相符, 可以初步確定為陽性克隆。進一步對陽性菌落中的質粒進行提純、用 EcoR和 Hind 對質粒進行雙酶切, 經1. 0%瓊脂糖凝膠電泳判斷。還可以直接將 PCR 產物進行測序, 通過與 GenBank 序列比對,可以證明目的片段 EGFP 是否已正確連接到 pET28a 表達載體。 參考文獻：1. 季愛加, 寧喜斌 原核表達載體 pET28a EGFP 的構建與表達 微生物學雜志 2011 年7 月第31 卷 第4 期2. 張麗瓊 抗菌肽DCD_1L與增強型綠色熒_省略_菌Transetta中的融合表達3. 辛國志 王玉英 盧波 王代紅 蛋白質的分離提純及鑒定分析方法 中國環(huán)境衛(wèi)生 2005年第8卷第1期4. 劉默芳 王恩多 綠色熒光蛋白 生物化學與生物物理進展 2000：27（3）