2022年高三生物總復(fù)習(xí) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)實(shí)踐導(dǎo)學(xué)案 蘇科版

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1、2022年高三生物總復(fù)習(xí) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)實(shí)踐導(dǎo)學(xué)案 蘇科版 【學(xué)習(xí)要求】 蛋白質(zhì)的提取和分離（A） 【知識(shí)梳理】 1．凝膠色譜法也稱做 ，是根據(jù) 分離蛋白質(zhì)的有效方法。凝膠實(shí)際上是一些由 構(gòu)成的多孔球體，在小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道，相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子通過凝膠時(shí)速度不同。相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì) 進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程 ，移動(dòng)速度 ；而相對(duì)分子質(zhì)量 的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在 移動(dòng)，路程

2、 ，移動(dòng)速率 。 2．緩沖溶液作用是 。 3．電泳是指 。 電泳利用了待分離樣品中各分子 以及分子本身的 、 的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的 ，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。兩種常用的電泳方法是 和 。在測(cè)定蛋白

3、質(zhì)分子量時(shí)通常使用 。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于 以及 等因素。 4．蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步： 、 、 和 。 5．樣品處理 (1)紅細(xì)胞的洗滌：洗滌紅細(xì)胞的目的是 ，采集的血樣要及時(shí)采用 分離紅細(xì)胞，然后用膠頭吸管吸出上層透明的 ，將下層

4、暗紅色的 倒入燒杯，再加入 ，緩慢攪拌 ，低速短時(shí)間離心，如此重復(fù)洗滌三次，直至 ，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。 (2)血紅蛋白的釋放：在 和 作用下，紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。 (3)分離血紅蛋白溶液：將攪拌好的混合溶液離心后，試管中的溶液分為4層。第1層為無色透明的 ，第2層為白色薄層固體，是 ，第3層是紅色透明液體，這是 ，第4層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管

5、中的液體用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。 (4)透析：取1 mL的血紅蛋白溶液裝入 中，將透析袋放入盛有300 mL的物質(zhì)的量的濃度為20 mmol／L的 中，透析12 h。透析可以去除樣品中 的雜質(zhì)，或用于更換樣品的 。 6．凝膠色譜操作：首先要制作 ；第二步是 ，因?yàn)? ，所以裝柱前需要根據(jù)色譜柱的內(nèi)體

6、積計(jì)算所需要的凝膠量。在裝填凝膠柱時(shí)，不 得 有 存在，避免降低分離效果；第三步是 。 【課時(shí)練習(xí)】 1．相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)在凝膠中的進(jìn)行過程可表示為圖中哪一個(gè) ( ) 2．蛋白質(zhì)提取和分離分為哪幾步 ( ) A．樣品處理、凝膠色譜操作、SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳 B．樣品處理、凝膠色譜操作、純化 C．樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定 D．樣品處理、純化、粗分離

7、、純度鑒定 3．將經(jīng)處理破裂后的紅細(xì)胞混合液以2 000 r／min的速度離心10 min后，離心管中的溶液分為四層，從上到下的順序依次是 ( ) A．血紅蛋白、甲苯層、脂類物質(zhì)層、沉淀層 B．甲苯層、沉淀層、血紅蛋白、脂類物質(zhì)層 C．脂類物質(zhì)層、血紅蛋白、甲苯層、沉淀層 D．甲苯層、脂類物質(zhì)層、血紅蛋白、沉淀層 4．下列操作正確的是 ( ) A．分離紅細(xì)胞時(shí)采用低速長(zhǎng)時(shí)間離心

8、 B．分離血紅蛋白溶液是低速短時(shí)間離心 C．紅細(xì)胞釋放出血紅蛋白只需要加入蒸餾水就可． D．透析時(shí)要用20 mmol／L的磷酸緩沖液，透析12 h 二、多選題 5．凝膠色譜操作不正確的是 ( ) A．將橡皮塞上部用刀切出鍋底狀的凹穴 B．將橡皮塞下部用刀切出凹穴 C．插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面 D．將尼龍網(wǎng)剪成與橡皮塞下部一樣大小的圓片 6．選用紅細(xì)胞作分離蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)材料，下列不是其優(yōu)點(diǎn)的是 ( )

9、 A．血紅蛋白是有色蛋白 B．紅細(xì)胞無細(xì)胞核 C．紅細(xì)胞蛋白質(zhì)含量高 D．紅細(xì)胞DNA含量高 7．下面關(guān)于對(duì)血紅蛋白提取和分離的樣品的處理措施中，正確的是 ( ) A．采集血樣后要高速短時(shí)間離心獲得血細(xì)胞 B．洗滌三次后如上清液仍有黃色，可增加洗滌次數(shù)，否則血漿蛋白無法除凈 C．在蒸餾水和甲苯的作用下，細(xì)胞破裂，釋放出血紅蛋白 D．釋放血紅蛋白后再經(jīng)過離心，就可以使血紅蛋白和其他雜質(zhì)分離開來 三、簡(jiǎn)答題 8．紅細(xì)胞含有大最血紅蛋白，紅細(xì)胞的機(jī)能主要是由血紅蛋

10、白完成，血紅蛋白的主要功能是攜O2或CO2，我們可以選用豬、牛、羊或其他脊椎動(dòng)物的血液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，來提取和分離血紅蛋白。請(qǐng)回答下列有關(guān)問題： (1) 實(shí)驗(yàn)前取新鮮的血液，要切記在采血容器中預(yù)先加入檸檬酸鈉，取血回來，馬上進(jìn)行離心，收集血紅蛋白溶液。 以上所述的過程即樣品處理，它包括 、 、收集血紅蛋白溶液。 (2) 收集的血紅蛋白溶液在透析袋中經(jīng)過透析，這就是樣品的粗分離。 ①透析的目的是 。 ②透析的原理是

11、 。 (3) 通過凝膠色譜法將樣品進(jìn)一步純化，最后經(jīng)SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。 樣品純化的目的是什么? 。 附參考資料：蛋白質(zhì)的分離與純化（蘇教） 蛋白質(zhì)存在于生物體的組織細(xì)胞中，不同的生物體組織細(xì)胞所含的蛋白質(zhì)種類、數(shù)量也不盡相同。要研究某種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能，就必須將這種蛋白質(zhì)從組織細(xì)胞中分離、純化出來。因此，蛋白質(zhì)的分離與純化技術(shù)便成為蛋白質(zhì)研究的重要技術(shù)。 在分

12、離與純化蛋白質(zhì)之前，必須采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ沟鞍踪|(zhì)呈溶解狀態(tài)釋放出來。通常先將生物組織進(jìn)行機(jī)械破碎，再根據(jù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選擇不同的破碎細(xì)胞方法(常用的有研磨法、超聲波法、酶解法等)破碎細(xì)胞，待細(xì)胞破碎后，各種蛋白質(zhì)被釋放出來，再根據(jù)蛋白質(zhì)的不同特性，選擇不同的溶劑進(jìn)行抽提。例如，酸性蛋白質(zhì)可以用稀堿性溶液抽提，水溶性蛋白質(zhì)可以用透析液(中性緩沖液)抽提，脂溶性蛋白質(zhì)則可以用有機(jī)溶劑抽提等。抽提出來的粗提取物，經(jīng)過離心去除固體雜質(zhì)后，再通過物理學(xué)和化學(xué)的方法處理，即可得到蛋白質(zhì)的粗制品。 蛋白質(zhì)的粗制品可能是多種蛋白質(zhì)的混合物，其中還可能混有許多小分子化合物，所以必須進(jìn)一步純化。純化主要

13、是根據(jù)蛋白質(zhì)之間以及蛋白質(zhì)與其他物質(zhì)之間在分子大小、溶解度、所帶電荷的多少、吸附性質(zhì)等方面存在的差異進(jìn)行的。例如，利用蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜的特性，可采用透析法(圖4一1)使蛋白質(zhì)與其他小分子化合物如無機(jī)鹽、單糖、雙糖、氨基酸等分離開來。常用的半透膜有天然的如腸衣，人工合成的如玻璃紙等。在透析時(shí)將待純化的蛋白質(zhì)溶液裝入用半透膜制成的透析袋內(nèi)，再將透析袋放入透析液中便可進(jìn)行透析。又如，離心沉降法也是純化蛋白質(zhì)的一種方法，它通過控制離心速率，使得分子大小、密度不同的蛋白質(zhì)發(fā)生沉降分層，從而達(dá)到分離出不同種類蛋白質(zhì)的目的(圖4-2)。 帶電顆粒在電場(chǎng)作用下向著與其電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象

14、，稱為電泳。電泳現(xiàn)象早在19世紀(jì)就被發(fā)現(xiàn)了，而電泳技術(shù)的廣泛應(yīng)用卻始于20世紀(jì)40年代。目前，電泳技術(shù)已成為生物科學(xué)研究以及醫(yī)、農(nóng)、林、牧、漁、制藥等領(lǐng)域必不可少的分析手段。 不同的物質(zhì)在同一電場(chǎng)中的泳動(dòng)速度不同。泳動(dòng)速度主要取決于帶電顆粒的性質(zhì)，即顆粒的大小、形狀和所帶凈電荷的多少。一般來說，帶電顆粒直徑越小，越接近于球形，所帶凈電荷越多，則在電場(chǎng)中泳動(dòng)速度越快；反之，則越慢。此外，電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液的pH等因素對(duì)泳動(dòng)速度也有影響。 支持物電泳是目前應(yīng)用較為普遍的純化蛋白質(zhì)的一種方法，支持物有濾紙、醋酸纖維薄膜、大分子凝膠等。采用醋酸纖維薄膜作為支持物的電泳方法具有簡(jiǎn)單、快速、分離清晰、靈敏

15、度高、樣品用量少：沒有吸附現(xiàn)象、電泳后區(qū)帶界限清晰等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)、臨床化驗(yàn)和生化產(chǎn)品分析(如血清蛋白、血紅蛋白、糖蛋白等的分離和鑒定)等方面。 血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳 1．配制試劑：按照試劑配方(見第62頁“附錄”)，選擇相應(yīng)的化學(xué)試劑，配制巴比妥緩沖液、染色液、漂洗液、透明液等。 2．架濾紙橋：按照支架的大小裁剪合適的濾紙條，取雙層濾紙條，一端與支架前沿對(duì)齊，另一端浸入電泳槽的緩)中液，待濾紙條濕潤(rùn)后，驅(qū)除氣泡，使濾紙緊貼于支架上，即是濾紙橋(圖4-3)。 3．浸泡薄膜：用鑷子夾取醋酸纖維薄膜，識(shí)別出光澤面，并在光澤面的一角用筆做上記號(hào)，然后放在巴比妥緩沖

16、液中浸泡20 min(圖4-4)。 4．細(xì)心點(diǎn)樣：取出薄膜，吸去多余的液體，平鋪在玻璃板上，有記號(hào)的一面朝下。點(diǎn)樣時(shí)用蓋玻片在血清中蘸一下，在離薄膜一端2~3 cm處輕輕按下，隨即提起(圖4-5)。 5．平懸薄膜：用鑷子夾取薄膜將點(diǎn)樣端平貼在電泳槽負(fù)極支架的“濾紙橋”上，有記號(hào)的面朝上，另一端平貼于正極，呈繃直狀態(tài)(圖4-6)。 6．實(shí)施電泳：蓋上電泳槽蓋，在薄膜平衡約l0min后通上電源，電壓調(diào)至160 V，膜寬電流強(qiáng)度0．4~0．8 mA／cm，電泳時(shí)間60~90 min(圖4-7)。 7．染色：電泳完畢后取下薄膜，放入染色液中浸

17、泡l0 min。 8．漂洗：從染色液中取出薄膜，在漂洗液中漂洗數(shù)次，直至蛋白質(zhì)區(qū)底色脫凈為止，即可得到色帶清晰的電泳圖譜(圖4-8)。 9．脫色：用濾紙壓平并吸干薄膜后，再浸入透明液中約5 min，取出后平貼于玻璃板上，待完全干燥后便成透明膜，可長(zhǎng)期保存。 討論： 1．點(diǎn)樣是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟之一，為什么? 2．點(diǎn)樣前要將薄膜表面多余的緩沖液吸去，但又不能吸得太干，為什么? 課后練習(xí)： 1.根據(jù)血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳圖譜示意圖，所帶負(fù)電荷最多的球蛋白是（ ） A．α1—球蛋白 B．α2—球蛋白 C．β—球蛋白 D．γ—球蛋白 2.根據(jù)血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳圖譜示意圖，血清中含量最多的球蛋白是（ ） A．α1—球蛋白 B．α2—球蛋白 C．β—球蛋白 D．γ—球蛋白