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1、聚合酶鏈式反應技術及其應用,提 綱,第一節(jié) 聚合酶鏈式反應擴增原理 第二節(jié) PCR反應體系和循環(huán)參數(shù)的優(yōu)化 第三節(jié) PCR反應的問題與對策 第四節(jié) 一個常規(guī)PCR實驗的設計 第五節(jié) 聚合酶鏈式反應技術類型 第六節(jié) 聚合酶鏈式反應技術應用 第七節(jié) 實時熒光定量PCR技術的原理及應用,聚合酶鏈反應 (Polymerase Chain Reaction ,PCR) 聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)是近十幾年來發(fā)展和普及最迅速的分子生物學新技術之一。由于它具有強大的擴增能力，并且可與其他分子生物學方法(如核酸雜交)和免疫學方法(如ELISA)相結合應用，使其敏
2、感性和特異性都大大增強，因而廣泛地應用于生物醫(yī)學領域的各個學科，包括基因的克隆、修飾、改建、構建cDNA文庫，遺傳病，傳染病的診斷，法醫(yī)學鑒定，物種起源，生物進化分析，流行病學調(diào)查，等等。由于PCR對世界生物醫(yī)學研究的巨大推動作用，其發(fā)明者Mullis因而獲得1992年諾貝爾醫(yī)學獎。,最早報道的PCR是用大腸桿菌DNA聚合酶 經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理后獲得的Klenow片段來 催化DNA鏈的延伸。由于加熱變性時酶會失活， 需要補加一份酶催化下一輪合成。這樣不僅操 作復雜,而且由于酶反應的溫度較低，DNA分子 會產(chǎn)生二級結構或引物非特異退火，使反應效 率低且易出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物，同時，會增加污 染的機
3、會。耐熱DNA聚合酶的應用使PCR得以完 善。這種酶在加熱95時不會變性，引物退火 和鏈的延伸可以在較高的溫度下進行，因而使 得PCR的產(chǎn)率和特異性都大大提高。,PCR技術問世后，不僅迅速在生物醫(yī)學領域得到廣 泛應用，而且不斷衍生出許多新的技術，使其應用范圍 不斷擴大，特異性和敏感性也不斷提高。 比如反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)是以mRNA為模板，通過 反轉(zhuǎn)錄反應合成cDNA，再做PCR擴增，因而可檢測特異 的mRNA或得到其cDNA克??； 如果僅有很少的序列資料，可通過錨式PCR對RNA 進行分析； 差異顯示PCR（DD-PCR）可以鑒定和分離在不同條 件下(如機體或細胞受某種刺激或疾病時)
4、某些有表達差異 的基因，而無需確切的序列資料； 免疫PCR是將PCR的強大擴增效力應用于免疫學檢測 中，與傳統(tǒng)方法相比其靈敏性要提高幾個數(shù)量級； PCR- ELISA則是將PCR與核酸雜交、ELISA連為一 體，用ELISA鑒定PCR產(chǎn)物，避免了因使用Southern Blotting所帶來的放射性污染等等。,第一節(jié) 聚合酶鏈式反應擴增原理 PCR是利用耐熱DNA聚合酶在體外條件下，催化一對引物間的特異DNA片段合成的 基因體外擴增技術。它包括三個基本過程：,第一步 加熱變性,靶序列,靶序列,模板DNA經(jīng)94左右加熱一定時間后，雙鏈DNA解離成為單鏈。,第二步 引物與靶序列退火,模板DNA經(jīng)加
5、熱變性成單鏈后，把溫度降至55 左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合。,第三步 引物延伸,DNA模板-引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以 靶序列為模板，dNTP為反應原料，按堿基配對原則， 合成一條新的與模板DNA鏈互補的單鏈。,第1個 PCR 循環(huán)完成后 得到兩個拷貝的靶序列,靶序列,靶序列,30次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量,No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824,1 cycle = 2 Amplicon,2 cycle
6、 = 4 Amplicon,3 cycle = 8 Amplicon,4 cycle = 16 Amplicon,5 cycle = 32 Amplicon,6 cycle = 64 Amplicon,7 cycle = 128 Amplicon,DNA擴增量呈指數(shù)上升 反應最終的DNA擴增量可用Y(1X)n計算。 Y代表DNA片段擴增后的拷貝數(shù)，X表示每次擴增效率的平均值，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴增效率的理論值為100%，但在實際反應中平均效率達不到理論值。 反應初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)
7、“停滯效應” ，這種效應稱平臺期。,PCR產(chǎn)物合成過程,指數(shù)期,平臺期,第二節(jié) PCR反應體系和循環(huán)參數(shù)的優(yōu)化,（一）PCR反應體系 1、引物 2、耐熱Taq DNA聚合酶 3、三磷酸脫氧核苷酸（dNTP） 4、鎂離子 5、模板 6、緩沖液 （二）循環(huán)參數(shù) 1、變性的時間和溫度 2、引物退火的溫度與時間 3、延伸時間和溫度 4、平臺效應,（一）PCR反應體系,1、引物 2、耐熱DNA聚合酶 3、脫氧核苷三磷酸 4、鎂離子 5、模板 6、PCR緩沖液 7、ddH2O,Mg2+,Mn2+,dCTP,dGTP,dUTP,dATP,Taq DNA 多 聚 酶,或Pfu DNA 多 聚 酶,生 物 素
8、標 記 的 引 物,和 或 和,dNTP,1、引物 在聚合酶鏈式反應中，要注意所用的引物濃度，一般引物控制在20200pmol,這種濃度通常足以保證進行30輪以上的擴增。引物濃度偏高，會引起錯配和非特異性產(chǎn)物的擴增，同時增加生成引物二聚體的幾率。相反 ，如引物濃度不足，則聚合酶鏈式反應的效率極低。 引物設計是否合理，是決定PCR反應成敗的關鍵。引物設計的原則見下表：,引物3端互補后，經(jīng)Taq酶聚合，形成雙鏈的引物二聚體,引物自身的回文序列互補后產(chǎn)生的發(fā)夾結構,引物設計原則：,續(xù)上表,虛擬PCR可用于鑒定產(chǎn)物的唯一性,引物設計軟件介紹,1、Primer 5.0（附中文說明書） 2、Oligo 6
9、.0,2、耐熱Taq DNA聚合酶 是一種耐熱的、依賴于DNA的 DNA聚合酶，最初是從極端嗜熱菌中純化出來的。 功能：具 5 3 DNA聚合酶活性，5 3 外切酶活性（在Q-PCR中此活性有用），但不具有3 5的外切酶活性（糾錯功能），導致其堿基誤摻入率偏高，不適用于突變檢測、測 序分析和基因表達中（可用 Pfu 高保真聚合酶代替），另外，它還具有非模板依賴性聚合酶活性，在PCR合成終止后，在3端加一個A,所以PCR產(chǎn) 物并非我們通常所想象的是一個平末端。利用此 特點，我們可以將PCR產(chǎn)物克隆到載體中。 特點：高度耐熱，聚合反應的最佳溫度為75 80; 價格相對便宜。在分子生物學中應用廣泛。
10、,3、三磷酸脫氧核苷酸 一般商品化供應的dNTP溶液pH為7.0，各dNTP的 濃度為 10mmol/L，一般使用濃度控制在20200umol/L。四種各dNTP分子濃度必須相等，以減少錯配。dNTP可與鎂離子螯合，濃度過高時，Taq酶活性降低，PCR產(chǎn)量會減少。,4、鎂離子 鎂離子濃度對PCR反應影響很大，既影響到Taq DNA聚合酶的活性和真實性，又影響到引物退火、模板和PCR產(chǎn)物的解鏈溫度、產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體生成等。PCR體系中的鎂離子濃度一般在0.52.5mol/L。商品化的試劑盒中，鎂離子濃度一 般為1.5mol/L，不同反應體系所要求的濃度會有差異。,隨著鎂離子濃度升高PC
11、R 產(chǎn)率和特異性均降低。,鎂離子濃度與產(chǎn)物特異性和產(chǎn)率的關系,5、模板 聚合酶鏈式反應（PCR)的模板DNA可以是單鏈分子，也可以是雙鏈分子；可以是線狀分子，也可以是環(huán)狀分子，不過線狀分子比環(huán)狀分子的擴增效果稍好。 就模板DNA而言，影響PCR的主要因素是模板的數(shù)量、純度以及目的片段的GC含量，當擴增GC富含區(qū)時，可使用專門的GC Buffer作為緩沖液。 不同來源的DNA所需模板量不同，可參考分子克隆。,6、緩沖液,1）Tris-HCl緩沖液 2）KCl 3）明膠 4）牛血清蛋白 5）非離子型生物去污劑 一般這些成分均由商家提供，并做過優(yōu)化處理，不需要自己配制。,（二）循環(huán)參數(shù) 聚合酶鏈式反
12、應（PCR）參數(shù)包括循環(huán)中三階段的溫度及持續(xù)時間控制，以及循環(huán)的次數(shù)，這在一定程度上影響著聚合酶鏈式反應的成功與否 。通常PCR 反應所采取的反應參數(shù)為： 變性溫度 94 3060s 退火溫度 3865 3060s 延伸溫度 72 4560s 循環(huán)次數(shù) 3035次 復性溫度決定于所用引物的長短與堿基組成，一般需要通過預實驗來確定。,1、變性的時間和溫度 模板DNA的變性不充分是導致PCR失敗的一個重要原因。 一般在第一輪循環(huán)前先進行94預變性35min，以便使模板DNA完全解鏈。,2、引物退火的溫度與時間 引物的退火溫度和所需時間長短取決于反應體系中擴增的基因組成及引物的長度、濃度和堿 基組成
13、。 實際使用的退火溫度一般要比引物的Tm值低25 。 Tm4(G+C)2(A+T) 一般當引物中G+C含量高、長度較長并與模板完全配對時，應提高退火溫度。退火溫度越高，所得產(chǎn)物的特異性越高。 當然， 退火溫度也不能過高 ，否則引物不能與模板很好得結合，得不到擴增產(chǎn)物。退火通常需要3060s。,退火與產(chǎn)物特異性的關系,3、延伸時間和溫度 延伸的時間長短取決于目的序列的長度、使用的PCR儀等。 一般引物延伸是在72 下進行。對2Kb以上長片段DNA的擴增可適當延長時間 。,4、平臺效應 引起平臺效應的因素： （1）dNTP或引物等消耗殆盡 （2）酶活性逐漸降低 （3）最終產(chǎn)物的阻化作用 （焦磷酸鹽
14、、雙鏈DNA） （4）非特異性產(chǎn)物或引物的 二聚體與反應模板的競爭作用,第三節(jié) PCR反應的問題與對策,問題一、無產(chǎn)物 問題二、非特異性擴增 問題三、空白對照有擴增（有污染）,問題1：無產(chǎn)物,問題2：非特異產(chǎn)物擴增,問題3：空白對照有擴增,利用尿嘧啶N-糖苷酶（UDG） 解決遺留污染的方法,原理：UDG可以切斷含有尿嘧啶核苷的DNA雙鏈。 方案一：dUTP方案 是在所有的PCR反應中均用dUTP代替dTTP，這樣產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物中除引物位置外，dTTP處被dUTP代替，這并不影響對其進行克隆等操作。在每次PCR之前，均將設置好的PCR反應體系用UDG處理，那么其中的遺留污染DNA(假如有的話)
15、將被破壞，不能作為下面PCR反應的底物，由于在后續(xù)的熱變性過程中UDG將被滅活，所以事先加入的UDG不會對本反應的產(chǎn)物構成任何影響。,方案二：dU引物方案。 即在引物合成過程中用dUTP代替dTTP，用這類引物引導合成的PCR產(chǎn)物在兩條鏈的5端引物部位含有dU，用 UDG 處理后，該區(qū)段被破壞，剩余的部分在后續(xù)的PCR循環(huán)中不能作為有效模板被擴增。 由于UDG對長于4核苷酸的DNA(單鏈或雙鏈)所含的dU都能進行清除，所以在dU引物方案中需先將UDG滅活后再加入下一輪PCR的引物。,第四節(jié) 一個標準PCR實驗的設計,第一步 設計引物 引物設計是否合理，是決定PCR反應成敗的關鍵。一步走錯，全盤
16、皆錯。所以，在這方面我們應多花點時間，可以避免以后少走彎路。 1）根據(jù)自己所要研究的基因，在Gene bank中找到相應的基因序列。 2）用Primer 5.0或Oligo 6.0 進行引物探針的設計。或者采用參考文獻中的引物設計。 根據(jù)我的實驗經(jīng)驗，最好參考國外的文獻，等級越高可靠性越高。 （引物設計原則參見前面部分）,第二步、實驗準備階段,1）通過e-mail向公司提交引物合成申請單； 2）購買實驗所需要的各種試劑或試劑盒以 及各種低值易耗品； 3）對實驗所需的EP管、Tip頭進行滅菌處 理（RNA提取和反應還需特別處理，請 參考分子克?。?；對引物參照說明 書進行稀釋。 4）細讀試劑盒說明
17、書、熟悉操作步驟、制定 具體可行的操作方案。,第三步 實驗操作階段,基因組DNA、質(zhì)粒DNA或總RNA的提取 用紫外分光光度計或熒光計檢測DNA或RNA 的濃度、純度，用瓊脂糖凝膠檢測是否降解 PCR（RT-PCR）反應 電泳檢測PCR產(chǎn)物,第五節(jié) 聚合酶鏈式反應技術類型,1、 增效PCR 6、 RT-PCR 2、 熱啟動PCR 7、 PCR-VNTR 3、 降落PCR 8、 PCR-SSCP 4、 巢式PCR 9、 免疫-PCR 5、 多重PCR 10、PCR-ELISA ,1、增效PCR（booster PCR） 當擴增少于1000拷貝的模板DNA時會遇到兩個問題：一是形成引物二聚體，一是
18、非特異擴增，消耗了引物和酶，而特異擴增片段產(chǎn)量降低。對于這種情況，可設置二步PCR，先用較低濃度的引物進行初級PCR，此時由于引物少，形成引物二聚體的可能減少，但它并不影響靶序列的擴增，只是由于引物少產(chǎn)量不高。約經(jīng)1520個循環(huán)后，再以稀釋后的初級PCR產(chǎn)物為模板進行次級擴增，靶序列的產(chǎn)量將會相應增加。,2、熱啟動PCR（Hot start PCR）,熱啟動是一種在PCR反應中優(yōu)化目標擴增產(chǎn)物的方法， 同時也能抑制非特異產(chǎn)物的擴增。 它通過控制PCR反應的必須組分，如DNA聚合酶或鎂離 子，直到反應混合物被加熱到可以阻止非特異引導和引物聚 合的溫度，才加入以上成分來啟動PCR反應的一種方法。
19、在PCR反應第一個循環(huán)之前的加溫步驟可去除并降低寡 核苷酸引物非特異性復性的可能性，而DNA聚合酶活性的缺 失則阻止了錯配引物的延伸。,熱啟動PCR 常規(guī)PCR,方 法 介 紹,1）升溫后手工加酶：不方便、容易污染。 2）PE公司的蠟膜隔離法：更適用于不帶熱蓋的PCR儀。如PE TC1、PE480。 3）單克隆抗體法：抗體與Taq酶結合抑制其活性。隨 著溫度的升高，抗體從酶上解離下來并在首輪PCR 循環(huán)的變性階段被滅活，而酶的活性釋放。此法適 用于各種PCR儀。 4）另一個改進方法：把Mg2+嵌入到蠟珠中，并隨著 蠟的熔化而釋放到反應混合液中 。,應 用,熱啟動PCR對于已優(yōu)化的單個PCR反應
20、沒有必要。然而當非特異擴增較為嚴重時，熱啟動PCR就派上了用場。 例如當反應中的模板DNA少于10 個拷貝數(shù) 時，或當模板DNA復雜度非常高時（如哺乳動物基因組DNA），或當PCR包括幾對寡核苷酸引物時， 即多重PCR (multiplex PCR) ，在這些情況下，熱啟動PCR和降落PCR結合有著很好的應用價值。,4,3、降落PCR （Touch Down-PCR）,降落PCR是一個很簡單、實用的方法，當應 用新的引物和模板組合時，降落PCR是優(yōu)化PCR最迅速的方法，當遇到諸如引導效率低，錯誤引 導和形成引物二聚體等問題時，降落PCR和熱啟 動PCR配合應用或加入GC-melt是解決問題的首
21、選方法。,原 理,該方法是指在一次PCR過程中把復性溫度設定在由高變低的一定范圍內(nèi)。擴增的前兩個循環(huán)的復性溫度應設計在比退火溫度較高的那條引物的熔解溫度（Tm）高大約3 左右, 在隨后的循環(huán)中復性溫度在每個循環(huán)中降低1 。當達到引物特異引導的許可溫度時，目的序列開始擴增。而非特異性擴增則會延遲幾個循環(huán)，直到復性溫度降到非特異產(chǎn)物可以進行引導時擴增才開始。然而，這時特異性產(chǎn)物此時已占據(jù)絕對優(yōu)勢并且能有效地抑制非特異擴增產(chǎn)物的積累。該方法可與熱啟動PCR或增效PCR技術聯(lián)用，作為PCR實驗的常規(guī)技術。,TouchDown PCR 中溫度變化規(guī)律,TouchDown PCR 中溫度變化規(guī)律,4、巢式
22、PCR（nest PCR）,此時也是進行二步PCR，與上面不同的是，第二級PCR需另行設置反應體系，并應用另外的PCR引物，此時引物的位置位于初級PCR引物的內(nèi)側，用初級PCR產(chǎn)物做模板，進行第二步PCR，這樣只有初級PCR中特異的擴增片段才能被二級引物擴增。 除了達到增效PCR同樣的目的外，還提高了最終產(chǎn)物的特異性。,在同一PCR體系中加入數(shù)對PCR引物，如 果這些引物的退火溫度相近，并且所覆蓋的 區(qū)域不重疊，這樣的反應體系可同時擴增多 個DNA片段。 多重PCR常用來檢測同一基因的多個外 顯子缺失；或檢測某基因是否缺失或不表達 時，需同時與內(nèi)對照一起擴增；另外，在法 醫(yī)學鑒定中， 經(jīng)常采用
23、多重PCR同時擴增多 個STR位點來進行親子鑒定或個體識別， 以 提高檢測的效率。,5、多重PCR (Multiplex PCR),利用多重PCR對缺失突變型 DMD進行基因診斷,實線代表缺失區(qū)，虛線代表可能缺失區(qū),6、RT-PCR,RT-PCR是以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶作用合成cDNA。使微量的mRNA（pg水平）得以迅速擴增（達ngug水平），大大提高mRNA的檢出靈敏度。應用于基因表達與調(diào)控的研究。,（1）基本步驟,1）RNA變性：65 75，2分鐘 2）逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA： 依次加入各種反應混合物后，37，1小時 cDNA合成效率可通過檢測摻入放性標記 物的比反射活 性來確定
24、；cDNA分子大小可用堿性瓊脂糖凝膠電泳來 鑒定。 3） 95 變性，逆轉(zhuǎn)錄酶滅活、RNA-cDNA雜合物變性。 4） 調(diào)整引物量（兩引物的量應相等）和模板的量（一般取 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的1/10），在一個標準PCR反應體系中擴增 目的DNA。為提高特異性可采用熱啟動或降落-PCR技術 5） 電泳檢測結果。,RT-PCR的步驟一,oligo(dT)n,RT-PCR的步驟二,合成的 cDNA,（2）RT-PCR引物設計注意事項,1）依據(jù)實驗目的不同，針對單鏈cDNA第一鏈 合成的引物可以不同，主要有三類：基因特異性引物（GSP）;多聚胸腺嘧啶核苷酸通用型引物Oligo（dT）;隨機六核苷酸引物（Ran
25、dom Hexamers)。多數(shù)情況下使用Oligo（dT），但對不含Poly(A)尾的mRNA（如組蛋白）不適用。 2）除了要遵循常規(guī)PCR引物設計的原則之外，RT-PCR引物設計時，正向和反向引物最好結合到不同外顯子的不同區(qū)域。這樣可以很容易地把來源于cDNA的擴增產(chǎn)物和來源于污染的基因組DNA的擴增產(chǎn)物區(qū)分開（片段大小不同）。,（3）問題與對策,1）每完成一步都要檢測，通過后再開始下一 步操作； 2）當出現(xiàn)非特異性帶，而通過改變參數(shù)結果 仍然不理想時，可使用TD-PCR； 3）如果TD-PCR也沒有擴增出特異性片段， 重新設計引物； 4）每個PCR反應都應設內(nèi)對照。,7、VNTR-PCR
26、技術,數(shù)目變異串聯(lián)重復（variable number tendom repeats, VNTR）序列以各自的核心序列（通常為6bp的重復單元，如(CGG)n等，稱為微衛(wèi)星DNA）首尾相連多次重復，由于其重復數(shù)在人群中呈高度變異，故稱為數(shù)目變異串聯(lián)重復序列。它們散在地分布于染色體上，以插入/缺失方式形成多態(tài)性。 這種多態(tài)性可以通過在VNTR重復序列的兩側保守區(qū)域設計一對引物對變異區(qū)進行擴增。電泳檢測，可見到長短不一的等位片段，稱之為擴增片段長度多態(tài)（amplified fragment length polymorphism, AFLP）,PCR-VNTR應用于遺傳病的連鎖分析,PCR-VNT
27、R技術應用于親子鑒定,是指單鏈DNA由于堿基序列不同可引起構象差異，這種構象差異將造成相同或相近長度的單鏈DNA電泳遷移率不同。據(jù)此，可檢測出DNA中單個堿基的替代、微缺失或插入。 通常與PCR技術聯(lián)合應用，稱為PCR-SSCP技術。在疑有突變的DNA片段附近設計一對引物，進行PCR擴增，其產(chǎn)物經(jīng)甲酰胺等變性，并在聚丙烯酰胺凝膠中電泳（中性膠），突變所引起的DNA構象差異將表現(xiàn)為電泳條帶位置的差異，從而作出判斷。,8、PCR-單鏈構象多態(tài)性 (single strand conformation polymorphism,SSCP),PCR-SSCP過程,- primer - PCR擴增 產(chǎn)物
28、 甲酰胺變性 單鏈構象DNA 中性聚丙烯酰胺凝膠電泳 1 2 3 4 5 銀染 1.為正常 結果分析 2、4、5純合患者 3.為雜合子 .,解鏈,快速降溫后形成特定的構像,DNA,原 理,過 程,快速置冰浴中,特 點 PCR-單鏈構象多態(tài)(PCR-SSCP)的優(yōu)點是簡單、快速、靈敏度高、成本低，可同時處理多個樣本。但受溫度的影響大，所以，最好用帶恒溫裝置的電泳儀跑膠，往往可得到較理想的結果。,應 用,PCR-SSCP技術通常與測序相結合，從而構成PCR-SSCP-Sequence三聯(lián)檢測，可用于發(fā)現(xiàn)基因的未知突變或SNP。在現(xiàn)代分子生物學領域應用廣泛。,9、免疫PCR,免疫PCR是將PCR的強
29、大擴增效力應用于免疫學檢測中，它與傳統(tǒng)方法ELISA、放射免疫法相比其靈敏度要提高幾個數(shù)量級。,10、PCR-ELISA技術,PCR- ELISA是將PCR與核酸雜交、ELISA 連為一體， 用ELISA鑒定PCR產(chǎn)物的一種方法， 它避免了因使用Southern Blotting所帶來的放射性污染。,11、實時熒光定量PCR技術 (Real time Quantitative PCR),第六節(jié) 聚合酶鏈式反應技術的應用,一、核酸的基礎研究（目的基因的檢測及獲取、突變體的構建、 T/A載體克隆PCR產(chǎn)物等） 二、突變檢測和序列分析（PCR-SSCP、PCR-Sequence等） 三、檢測基因表達
30、（RT-PCR、DD-PCR、SSH、基因芯片等) 四、從cDNA文庫中放大特定序列（利用PCR對cDNA文庫的 差式篩選） 五、研究已知片段鄰近基因或未知DNA片段（基于錨定-PCR 的RACE技術來獲取cDNA全長） 六、進化分析（利用PCR技術擴增rRNA基因可對各物種進行 遺傳聚類分析，從而確定各物種之間的親緣和進化關系。) 七、醫(yī)學應用（遺傳病診斷、惡性腫瘤診斷及預后、各種病原 體的檢測、移植配型等） 八、獲取生物學證據(jù)（親子鑒定、個體識別等） 九、性別控制（SRY基因的PCR檢測，用于兩性畸形診斷及性 連鎖疾病的性別控制） 十、轉(zhuǎn)基因檢測（應用Q-PCR檢測轉(zhuǎn)基因生物的GMO基因）
31、,第七節(jié) 實時熒光定量PCR技術的 原理及應用 (Real time Quantitative PCR),通過前面的學習，我們已經(jīng)知道PCR可對特定核苷酸片斷進行指數(shù)擴增。在擴增反應結束之后，我們早期采用的方法是通過凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行定性分析，也可以通過對光密度掃描來進行半定量的分析。無論定性還是半定量分析，分析的都是PCR終產(chǎn)物。但是在絕大多數(shù)情況下，我們所感興趣的是未經(jīng)PCR信號放大之前的起始模板量。而起始模板量與PCR終產(chǎn)物的量并不存在明顯的線性關系，甚至經(jīng)常是背離的。,同一個樣品在96孔反應板中同時擴增，所得終產(chǎn)物產(chǎn)量差異明顯。,低原始模板量的樣品到平臺期時產(chǎn) 量反而高。,例如我們
32、想知道某一特定基因在特定組織中的表達量，顯然普通PCR已不能滿足我們的需求，在這種需求下熒光定量PCR技術應運而生。 熒光實時定量PCR技術最早于1992年由一位日本人提出的，他當時的初衷很簡單，就是想實時地看到PCR反應的整個過程，由于當時EB（溴化乙錠）的廣泛使用，最直接想到的標記染料就是EB， EB可以插入到雙鏈核酸中受激發(fā)產(chǎn)生熒光。這樣，在普通PCR儀的基礎上再配備一個激發(fā)和檢測的裝置，第一臺實時定量PCR儀就誕生了。但真正意義上的熒光定量PCR儀由美國應用生物系統(tǒng)公司于1996年全球首次推出。,提 綱,一、實時熒光定量PCR原理 二、實時熒光定量PCR的幾種標記方法 三、實時熒光定量
33、PCR醫(yī)學和科研中的應用,一、實時熒光定量PCR原理,（一）實時熒光定量PCR原理 （二）如何對起始模板定量？,（一）實時熒光定量PCR原理,在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。 每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線。,實時搜集熒光信號,熒光擴增曲線可以分三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，我們無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加。PCR
34、的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計算出起始DNA拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關系，我們可以選擇在這個階段進行定量分析。,熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段,平臺期,（二）如何對起始模板定量？,通過Ct值和標準曲線對起始模板進行定量分析。 下面介紹四個概念： 擴增曲線、熒光閾值、Ct值、標準曲線,1、擴 增 曲 線,熒光基團,橫坐標：擴增循環(huán)數(shù)（Cycle）；縱坐標：熒光強度； 每個循環(huán)進行一次熒光信號的收集。,擴增曲線指在PCR擴增產(chǎn)物過程中，由定量PCR儀搜集熒光信號，并通過計算機分析后，用于描述擴
35、增反應產(chǎn)物的熒光量隨循環(huán)數(shù)增加而呈幾何級數(shù)增長的一條曲線。,2、熒 光 閾 值（Threshold）,熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設 定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍左右。,3、Ct值,C(t) value,Ct值的定義： PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)。,Ct值的重現(xiàn)性,Ct值的特點： 相同模板進行96次擴增，終點處產(chǎn)物量不恒定； Ct值則具有極好的重現(xiàn)性。,4、定量的計算原理,理想的PCR反應： X=X02n 非理想的PCR反應： X=X0(1+Ex
36、)n n：擴增反應的循環(huán)次數(shù) X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量 X0：初始模板量 Ex：擴增效率（0100之間）,C(t) value,擴增產(chǎn)物達到閾值線時： XCt=X0(1+Ex)Ct =M (1) XCt:熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產(chǎn)物的量。在閾值線設定以后,它是一個常數(shù),我們設為M 方程式(1)兩邊同時取對數(shù)得: logM=logX0(1+Ex)Ct (2) 整理方程式(2)得: logX0= -log(1+Ex)Ct+logM (3) Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性、負相關，根據(jù)樣品擴增達到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計算出樣品中所含的模板量。,5、標 準 曲 線,模板DNA量越多，熒光達到域值的
37、循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小 Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關系，通過已知起始拷貝數(shù)的標準 品可作出標準曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量。,確定未知樣品的 C(t)值 。 通過標準曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量。,6、定量結果,Log of DNA concentration,模板DNA量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少。 Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關系，根據(jù)樣品Ct值，就可以 計算出樣品中所含的模板量。,非特異性熒光染料標記： 1、 SYBR Green 特異性熒光探針標記： 2、 TaqMan 3、Molecular Beacon 4、雙探針法,二、熒光標記的不同方法,方法
38、1：SYBR Green 法,SYBR Green,小溝,大溝,SYBR Green法 工作原理,SYBR Green能結合到雙鏈DNA的小溝部位。,SYBR Green只有和雙鏈DNA結合后才發(fā)熒光。 變性時，DNA雙鏈分開無熒光。復性和延伸時， 形成雙鏈DNA，SYBR Green發(fā)熒光，在此階段采 集熒光信號。,SYBR Green,SYBR Green I 工作原理,Emission,Excitation,Excitation,由于SYBR Green 與所有的雙鏈DNA相結合，因此由引物二聚體、單鏈二級結構以及非特異性擴增產(chǎn)物引起的假陽性會影響定量的精確性。 通過測量升高溫度后熒光的
39、變化可以幫助降低非特異產(chǎn)物的影響。 由熔解曲線來分析產(chǎn)物的均一性有助于更準確地分析SYBR Green PCR定量結果。,在PCR結束后，我們可以根據(jù)變性過程 中的熒光值變化繪出每個樣品的熔解曲線。繪制熔解曲線時，Real-Time PCR 儀連續(xù)監(jiān)測每個樣品在從雙鏈完全配對 到完全解鏈的升溫過程中熒光值的變化 過程。,不同的擴增產(chǎn)物因為其長度和GC含量不同而 在不一樣的溫度下解鏈，當產(chǎn)物解鏈時，SYBR Green 的熒光值將迅速降低并被儀器監(jiān)測到。 熒光強度變化的拐點即為熔解峰值。Tm值是DNA解鏈一半時的溫度。熔解曲線是擴增反應的質(zhì)控途徑，當圖中沒有出現(xiàn)雜峰，也未出現(xiàn)主峰的異常增寬，表明
40、實驗中未出現(xiàn)污染、引物二聚體和非特異性擴增。,SYBR Green I 熔解曲線分析,Tm值：DNA解鏈一半時的溫度,溫 度,Tm值,SYBR Green I 熔解曲線分析,對熒光強度與溫度的變化求副導數(shù)。(-dF/dT) 并以其作為縱座標，溫度作為橫座標。,Tm,-dF/dT,SYBR Green 法融解曲線分析,融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰 其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性 熒光，因此定量不準確,-dF/dT,-dF/dT,SYBR Green 法PCR的建立和優(yōu)化,1. SYBR Green 使用濃度:太高抑制Taq酶活性，太低熒光信號太弱，不易檢測。 2. Primer：引物的特異性高，否則擴增有雜帶，
41、定量不準 可采用TD-PCR方法，提高產(chǎn)物的特異性。 3. MgCl2的濃度:可以降低到1.5mM,以減少非特異性產(chǎn)物。 4. 反應Buffer體系的優(yōu)化。 5. 反應溫度和時間參數(shù):由酶、引物、擴增片段長度及模板的種類等因素決定。 6. 其他與常規(guī)PCR相同，,SYBR Green 法應用范圍,起始模板的測定。 基因型的分析。 融解曲線分析可以優(yōu)化PCR反應的條件，對常規(guī)PCR有指 導意義，如對primer的評價；可以區(qū)分單一引物、引物 二聚體、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物。,SYBR Green 法的特點,A、相對雜交探針方法，插入染料法相對較便宜。 B、不需要特別設計探針。 C、SYBR Gree
42、n 是最常用的插入染料。 D、SYBR Green 染料插入雙鏈DNA，檢測靈 敏度提高200倍。 E、和雜交探針方法相比，插入染料法特異性低。 F、不能做多重PCR。 G、在延伸反應結束時搜集熒光信號。,方法2：TaqMan法,TaqMan-水解型雜交探針,5端標記有報告基團(Reporter) ，如FAM、VIC等。 3端標記有熒光淬滅基團 (Quencher)。 探針完整時，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收 ，無熒光； R與Q分開，發(fā)熒光。,TaqMan法工作原理,Taq酶有 53外切核酸酶活性，當其接近探針時可水解探針。將探針5端連 接的熒光基團從探針上切割下來，游離于反應體系中，從而脫
43、離3端熒光淬滅基 團的屏蔽，接受光刺激發(fā)出熒光信號。每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子游離出來，實現(xiàn)了每擴增一條DNA分子，釋放一個熒光信號。隨著反應的進行，不斷積累熒光信號。可以在循環(huán)過程中任一點檢測熒光。,TaqMan 法PCR反應的建立,1、引物、探針的設計： 探針Tm為68-70 ，30 bp, 5不能有G，G可能會淬滅熒 光素，引物盡量靠近探針，擴增片段400 bp，引物Tm為5960 。 2、反應參數(shù)的確定： 一般為：94 ，10-20秒；60，30-60秒（Taq酶53 外切核酸酶活性在60 最高），也可通過TD-PCR程序優(yōu)化退 火溫度；72 ，45秒。 3、優(yōu)化引物和探針濃
44、度： 引物濃度：50-900nM 探針濃度：50-250nM 4、其他與常規(guī)PCR相同,TaqMan法特點,A、產(chǎn)生很強的熒光信號； B、容易設計和合成； C、可以做多重檢測； D、能夠進行SNP檢測； E、比插入染料貴。,方法 3：分子信標法,標記熒光的發(fā)夾探針 環(huán)與目標序列互補 莖由互補配對序列組成,發(fā)夾型雜交探針,Molecular beacon(分子信標)工作原理,標記熒光的探針與擴增產(chǎn)物結合后即直接產(chǎn)生熒光。 它本質(zhì)上是一種標記熒光的發(fā)夾探針，當探針分子 呈發(fā)夾結構時，結合在其兩端的熒光基團距離上接 近， 使得產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移效應，而不發(fā)生熒光。當互 補序列出現(xiàn)時，探針與DNA雜交， 探
45、針轉(zhuǎn)變成一個 開放的結構，呈線性，報告熒光基團與淬滅熒光基 團彼此在空間 上產(chǎn)生足夠的分離，熒光基團脫離了 淬滅基團的影響，從而產(chǎn)生可被檢測到的熒光。,分子信標的原理圖,熒光素,淬滅基團,熒光淬滅,與模板退火形成局部雙鏈,Molecular beacon(分子信標)應用范圍,起始模板的定量 基因型分析 產(chǎn)物鑒定 SNP（單核苷酸多態(tài)性）分析,Molecular beacon (分子信標)特點,A、SNP檢測。 B、多重PCR。 C、難設計、合成。 D、產(chǎn)生的熒光信號較低。 E、價格昂貴 。 F、在退火時搜集熒光信號。,方法4：FRET探針法,FRET探針由兩條相鄰探針組成，在一條探針的5 端標
46、記FAM熒光基團， 另一探針的3端標記Red 640 （或Red 705）熒光基團。當復性時，探針結合在模板 上FAM 基團和Red 640基團相鄰，激發(fā)FAM產(chǎn)生的熒 光，作為Red 640基團的激發(fā)光被吸收，使Red 640發(fā) 出波長為640 nm的熒光。當變性時，探針游離，兩基 團距離遠，不能產(chǎn)生640 nm波長的熒光。由于FRET探 針是靠近發(fā)光，所以檢測的信號是實時信號，非累積信號。,熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理（FRET）,熒光,FRET探針法的特點,A、特異性好； B、SNP檢測； C、難設計； D、費用昂貴。 E、在退火時搜集熒光信號。,實時熒光定量PCR的優(yōu)點,1 特異性好 使用特
47、異性探針對定量分子進行識別，具有很高的準確性。同時， 靶序列由引物和探針雙重控制(插入染料法除外)，特異性好，假 陽性低。 2靈敏度高 熒光PCR檢測技術是綜合了PCR技術、熒光標記技術、激光技術、 數(shù)碼顯像技術為一體的技術，因此它的檢測靈敏度很高。 3線性關系好、線性范圍寬 由于熒光信號的產(chǎn)生和每次擴增產(chǎn)物成一一對應的關系，通過熒光 信號的檢測可以直接對產(chǎn)物進行定量；定量范圍可在010 拷貝 毫升。 4操作簡單、安全、自動化程度高、防污染。 擴增和檢測可以在同一管內(nèi)進行，不需要開蓋，不易污染；同時擴增 和檢測一步完成，不需要后期處理，不再需要擔心EB和放射性污染。 5速度快、高通量 可在23
48、小時完成96個樣品的定量分析。,10,第四節(jié) 定量PCR實驗的設計,1、根據(jù)自己所要研究的基因，在gene bank中找到相應 的基因序列。 2、應用相應的引物探針軟件，進行引物探針的設計。 引物設計原則： A、引物與模板的序列要緊密互補； B、引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結構； C、引物設計的特異性要好； D、引物長度通常在20-25bp，Tm值在5565，GC含 量在4060； E、引物3端避免使用堿基A與出現(xiàn)3個以上的連續(xù)堿基； F、為鑒定出現(xiàn)基因組的擴增，引物設計最好能跨2個外 顯子。,探針設計原則： A、探針位置盡可能地靠近上游引物； B、探針長度通常在20-30bp，T
49、m值在65-70， 通常比引物高5-10 ，GC含量在40-70。 C、探針地5端應避免使用堿基G； D、整條探針中，C的含量要明顯高于G地含量； E、設計的探針特異性要好。 3、根據(jù)儀器的特點與要求，選擇不同標記的熒光素。 4、引物與探針的合成及相關試劑的準備。 5、標準品地制備。 6、先做普通PCR預實驗，找出最佳的PCR反應條件。,7、PCR反應體系：通常使用混合好的試劑，只需加入 引物、探針、模板與PCR水： MIXTRUE 適量 引物 0.3-0.5UM 探針 0.1-0.3UM 模板 2-5ul 水 至20-50ul 以上濃度均為終濃度，插入染料法不需要加入探針。 8、標準曲線的制
50、作：根據(jù)情況進行10倍數(shù)的濃度稀釋， 做35個梯度。 9、樣本的檢測，每個樣本做兩個復孔，每次實驗均設 空白對照。 10、基線或閾值的設定。,Lightcycler 熒光定量PCR系統(tǒng)介紹,機器構造,配件,上機前操作過程,準備反應混和物,上機前離心,將反應毛細管插入反應盤中,上機,實驗完成后傾倒毛細管的方法,特 點 1、可使用外標法定量，可加內(nèi)對照，可做熔點曲線分析。 2、單一光路的三個檢測點對樣本同時進行三個波長的熒 光檢測，擴增與檢測同時進行，提供實時分析和在線 監(jiān)測。引入獨特的顏色補償試劑和軟件以消除個檢測 通道其它染料熒光的干擾。 3、一次可做32個樣本。 4、共用熱室，保證單次PCR
51、每個樣本的狀況連續(xù)一致。循 環(huán)速度快，20-30分鐘完成30-40個循環(huán)，一次檢測樣本 數(shù)32個。,Lightcycler 熒光定量PCR系統(tǒng),清潔和維護 反應槽和內(nèi)壁均可用家用洗滌劑清潔，但反應槽必須在取出后才能進行清潔。 當毛細管破碎時，首先用儀器廠家提供的毛刷將碎片去除，再用70%乙醇清洗反應槽。 光路部分須用無水乙醇清潔。,實時熒光定量PCR儀的醫(yī)學應用,臨床疾病檢測 定量分析：各種病毒，細菌，衣源體，支原體，病毒載量。 Her2基因、白血病融合基因等腫瘤標志物基因 檢測對疾病進行診斷、療效觀察及預后。 基因分型： 病原耐藥性點突變的檢測(MGB)、腫瘤耐藥基因 檢測，避免盲目用藥。
52、各種基因的定量表達分析: 大樣本量，快速方便，線性范圍寬，重現(xiàn)性好，定量準確。 SNP和基因突變分析： 疾病相關基因型與臨床表型的關系 。 SNP檢測與臨床表現(xiàn)的相關性：抗高血壓藥物療效個體差異、 藥物副反應的預防。,目的：利用核酸檢測，縮短檢驗時間，提高靈敏度，為診斷 用藥提供依據(jù)。 方法：從血液中提取病毒DNA，擴增病毒基因，以TaqMan探針 進行檢測。 對照：濃度為106、105 、104 103 的標準樣品各一個，設陰 性和空白對照。 實驗步驟：提取HBV DNA 配制反應Mixture，加模板DNA 上機擴增 軟件結果分析 結果：獲取血液樣品中HBV-DNA的精確copy數(shù)。,利用
53、FRET探針法檢測血液中的HBV,利用LightCycler雙探針法 檢測血液中的HBV含量,第一步 編輯反應程序,補充說明：熒光定量方法不同所選熒光通道不同,程序運行界面,結果分析,熔鏈分析,突變分析,突變分析,TaqMan法在基因表達研究中的應用,應用TaqMan法研究ERBB2在乳腺腫瘤組織標本中的表達差異,標記探針,使用 TaqMan 探針進行雙通道熒光定量,Fam標記目標基因探針 VIC標記看家基因探針,1、材料準備,從正常乳腺組織中提取的總RNA。 從乳腺癌組織中提取的總RNA。 含ERBB2 and GAPDH 的質(zhì)粒用于生成標準曲線。 單雙通道同時進行，獨立分析。 Contro
54、ls no RNA：陰性對照 RNA + no reverse transcriptase：基因組對照,反應程序,RT-QPCR 反應程序：,癌癥標記物表達,Color 2 - VIC detection for GAPDH,Color 1 FAM detection for ERBB2,實驗結果,Copies ng/ l Total RNA,實驗結果,ERBB2 copies / GAPDH copies,1095 / 95500 = 0.011 1052 / 85730 = 0.012,2130/136000 = 0.017 2492/130800 = 0.019,Healthy RNA,
55、Tumor RNA,0.0115,0.018,Copies ng/ l Total RNA,實驗結果,Healthy Tissue,Carc. Tissue,Relative Expression,ERBB2的表達差異,討 論,1、通過RT-QPCR成功檢測了ERBB2基因在不同組織的 表達差異；在乳腺癌組織中，ERBB2的表達量是正常水平的1.8倍。 2、熒光實時定量中的內(nèi)標的作用：常用的內(nèi)標有-actin、GAPDH等看家基因。這些基因在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數(shù)相對恒定，受環(huán)境因素影響小。內(nèi)標定量結果代表了樣本中所含細胞的數(shù)量。因此可把目的表達基因與相應的內(nèi)標基因的比值用于消除不
56、同樣品間總RNA在量上的差異。,SYBR Green I法舉例,利用SYBR Green 1進行GMO定量,相對定量中內(nèi)標的作用,對定量中的內(nèi)標通常是-actin、GAPDH等看家基因。這些基因在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數(shù)相對恒定，受環(huán)境因素影響小。內(nèi)標定量結果代表了樣本中所含細胞或基因組數(shù)量相。,Lightcycler 熒光定量PCR系統(tǒng),原理和特點 1、可使用外標法定量，可加內(nèi)對照，可做熔點曲線分析。 2、單一光路的三個檢測點對樣本同時進行三個波長的熒 光檢測，擴增與檢測同時進行，提供實時分析和在線監(jiān)測。引入獨特的顏色補償試劑和軟件以消除個檢測通道其它染 料熒光的干擾。 3、一次可做32個樣本。 4、共用熱室，保證單次PCR每個樣本的狀況連續(xù)一致。循 環(huán)速度快，20-30分鐘完成30-40個循環(huán)，一次檢測樣本數(shù) 32個。,Lightcycler 熒光定量PCR系統(tǒng),清潔和維護 反應槽和內(nèi)壁均可用家用洗滌劑清潔，但反應槽必須在取出后才能進行清潔。 當毛細管破碎時，首先用儀器廠家提供的毛刷將碎片去除，再用70%乙醇清洗反應槽。 光路部分須用無水乙醇清潔。,Thanks!,
實時定量PCR技術原理及應用.ppt
