實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)原理及應(yīng)用.ppt

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)及其應(yīng)用,提 綱,第一節(jié) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增原理 第二節(jié) PCR反應(yīng)體系和循環(huán)參數(shù)的優(yōu)化 第三節(jié) PCR反應(yīng)的問題與對(duì)策 第四節(jié) 一個(gè)常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì) 第五節(jié) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)類型 第六節(jié) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)應(yīng)用 第七節(jié) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用,聚合酶鏈反應(yīng) (Polymerase Chain Reaction ,PCR) 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)是近十幾年來發(fā)展和普及最迅速的分子生物學(xué)新技術(shù)之一。由于它具有強(qiáng)大的擴(kuò)增能力，并且可與其他分子生物學(xué)方法(如核酸雜交)和免疫學(xué)方法(如ELISA)相結(jié)合應(yīng)用，使其敏感性和特異性都大大增強(qiáng)，因而廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的各個(gè)學(xué)科，包括基因的克隆、修飾、改建、構(gòu)建cDNA文庫，遺傳病，傳染病的診斷，法醫(yī)學(xué)鑒定，物種起源，生物進(jìn)化分析，流行病學(xué)調(diào)查，等等。由于PCR對(duì)世界生物醫(yī)學(xué)研究的巨大推動(dòng)作用，其發(fā)明者M(jìn)ullis因而獲得1992年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。,最早報(bào)道的PCR是用大腸桿菌DNA聚合酶 經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理后獲得的Klenow片段來 催化DNA鏈的延伸。由于加熱變性時(shí)酶會(huì)失活， 需要補(bǔ)加一份酶催化下一輪合成。這樣不僅操 作復(fù)雜,而且由于酶反應(yīng)的溫度較低，DNA分子 會(huì)產(chǎn)生二級(jí)結(jié)構(gòu)或引物非特異退火，使反應(yīng)效 率低且易出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物，同時(shí)，會(huì)增加污 染的機(jī)會(huì)。耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使PCR得以完 善。這種酶在加熱95時(shí)不會(huì)變性，引物退火 和鏈的延伸可以在較高的溫度下進(jìn)行，因而使 得PCR的產(chǎn)率和特異性都大大提高。,PCR技術(shù)問世后，不僅迅速在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣 泛應(yīng)用，而且不斷衍生出許多新的技術(shù)，使其應(yīng)用范圍 不斷擴(kuò)大，特異性和敏感性也不斷提高。 比如反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)是以mRNA為模板，通過 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，再做PCR擴(kuò)增，因而可檢測(cè)特異 的mRNA或得到其cDNA克?。?如果僅有很少的序列資料，可通過錨式PCR對(duì)RNA 進(jìn)行分析； 差異顯示PCR（DD-PCR）可以鑒定和分離在不同條 件下(如機(jī)體或細(xì)胞受某種刺激或疾病時(shí))某些有表達(dá)差異 的基因，而無需確切的序列資料； 免疫PCR是將PCR的強(qiáng)大擴(kuò)增效力應(yīng)用于免疫學(xué)檢測(cè) 中，與傳統(tǒng)方法相比其靈敏性要提高幾個(gè)數(shù)量級(jí)； PCR- ELISA則是將PCR與核酸雜交、ELISA連為一 體，用ELISA鑒定PCR產(chǎn)物，避免了因使用Southern Blotting所帶來的放射性污染等等。,第一節(jié) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增原理 PCR是利用耐熱DNA聚合酶在體外條件下，催化一對(duì)引物間的特異DNA片段合成的 基因體外擴(kuò)增技術(shù)。它包括三個(gè)基本過程：,第一步 加熱變性,靶序列,靶序列,模板DNA經(jīng)94左右加熱一定時(shí)間后，雙鏈DNA解離成為單鏈。,第二步 引物與靶序列退火,模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，把溫度降至55 左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合。,第三步 引物延伸,DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以 靶序列為模板，dNTP為反應(yīng)原料，按堿基配對(duì)原則， 合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的單鏈。,第1個(gè) PCR 循環(huán)完成后 得到兩個(gè)拷貝的靶序列,靶序列,靶序列,30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量,No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824,1 cycle = 2 Amplicon,2 cycle = 4 Amplicon,3 cycle = 8 Amplicon,4 cycle = 16 Amplicon,5 cycle = 32 Amplicon,6 cycle = 64 Amplicon,7 cycle = 128 Amplicon,DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升 反應(yīng)最終的DNA擴(kuò)增量可用Y(1X)n計(jì)算。 Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表示每次擴(kuò)增效率的平均值，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%，但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。 反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)” ，這種效應(yīng)稱平臺(tái)期。,PCR產(chǎn)物合成過程,指數(shù)期,平臺(tái)期,第二節(jié) PCR反應(yīng)體系和循環(huán)參數(shù)的優(yōu)化,（一）PCR反應(yīng)體系 1、引物 2、耐熱Taq DNA聚合酶 3、三磷酸脫氧核苷酸（dNTP） 4、鎂離子 5、模板 6、緩沖液 （二）循環(huán)參數(shù) 1、變性的時(shí)間和溫度 2、引物退火的溫度與時(shí)間 3、延伸時(shí)間和溫度 4、平臺(tái)效應(yīng),（一）PCR反應(yīng)體系,1、引物 2、耐熱DNA聚合酶 3、脫氧核苷三磷酸 4、鎂離子 5、模板 6、PCR緩沖液 7、ddH2O,Mg2+,Mn2+,dCTP,dGTP,dUTP,dATP,Taq DNA 多 聚 酶,或Pfu DNA 多 聚 酶,生 物 素 標(biāo) 記 的 引 物,和 或 和,dNTP,1、引物 在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，要注意所用的引物濃度，一般引物控制在20200pmol,這種濃度通常足以保證進(jìn)行30輪以上的擴(kuò)增。引物濃度偏高，會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增，同時(shí)增加生成引物二聚體的幾率。相反 ，如引物濃度不足，則聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的效率極低。 引物設(shè)計(jì)是否合理，是決定PCR反應(yīng)成敗的關(guān)鍵。引物設(shè)計(jì)的原則見下表：,引物3端互補(bǔ)后，經(jīng)Taq酶聚合，形成雙鏈的引物二聚體,引物自身的回文序列互補(bǔ)后產(chǎn)生的發(fā)夾結(jié)構(gòu),引物設(shè)計(jì)原則：,續(xù)上表,虛擬PCR可用于鑒定產(chǎn)物的唯一性,引物設(shè)計(jì)軟件介紹,1、Primer 5.0（附中文說明書） 2、Oligo 6.0,2、耐熱Taq DNA聚合酶 是一種耐熱的、依賴于DNA的 DNA聚合酶，最初是從極端嗜熱菌中純化出來的。 功能：具 5 3 DNA聚合酶活性，5 3 外切酶活性（在Q-PCR中此活性有用），但不具有3 5的外切酶活性（糾錯(cuò)功能），導(dǎo)致其堿基誤摻入率偏高，不適用于突變檢測(cè)、測(cè) 序分析和基因表達(dá)中（可用 Pfu 高保真聚合酶代替），另外，它還具有非模板依賴性聚合酶活性，在PCR合成終止后，在3端加一個(gè)A,所以PCR產(chǎn) 物并非我們通常所想象的是一個(gè)平末端。利用此 特點(diǎn)，我們可以將PCR產(chǎn)物克隆到載體中。 特點(diǎn)：高度耐熱，聚合反應(yīng)的最佳溫度為75 80; 價(jià)格相對(duì)便宜。在分子生物學(xué)中應(yīng)用廣泛。,3、三磷酸脫氧核苷酸 一般商品化供應(yīng)的dNTP溶液pH為7.0，各dNTP的 濃度為 10mmol/L，一般使用濃度控制在20200umol/L。四種各dNTP分子濃度必須相等，以減少錯(cuò)配。dNTP可與鎂離子螯合，濃度過高時(shí)，Taq酶活性降低，PCR產(chǎn)量會(huì)減少。,4、鎂離子 鎂離子濃度對(duì)PCR反應(yīng)影響很大，既影響到Taq DNA聚合酶的活性和真實(shí)性，又影響到引物退火、模板和PCR產(chǎn)物的解鏈溫度、產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體生成等。PCR體系中的鎂離子濃度一般在0.52.5mol/L。商品化的試劑盒中，鎂離子濃度一 般為1.5mol/L，不同反應(yīng)體系所要求的濃度會(huì)有差異。,隨著鎂離子濃度升高PCR 產(chǎn)率和特異性均降低。,鎂離子濃度與產(chǎn)物特異性和產(chǎn)率的關(guān)系,5、模板 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)的模板DNA可以是單鏈分子，也可以是雙鏈分子；可以是線狀分子，也可以是環(huán)狀分子，不過線狀分子比環(huán)狀分子的擴(kuò)增效果稍好。 就模板DNA而言，影響PCR的主要因素是模板的數(shù)量、純度以及目的片段的GC含量，當(dāng)擴(kuò)增GC富含區(qū)時(shí)，可使用專門的GC Buffer作為緩沖液。 不同來源的DNA所需模板量不同，可參考分子克隆。,6、緩沖液,1）Tris-HCl緩沖液 2）KCl 3）明膠 4）牛血清蛋白 5）非離子型生物去污劑 一般這些成分均由商家提供，并做過優(yōu)化處理，不需要自己配制。,（二）循環(huán)參數(shù) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）參數(shù)包括循環(huán)中三階段的溫度及持續(xù)時(shí)間控制，以及循環(huán)的次數(shù)，這在一定程度上影響著聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的成功與否 。通常PCR 反應(yīng)所采取的反應(yīng)參數(shù)為： 變性溫度 94 3060s 退火溫度 3865 3060s 延伸溫度 72 4560s 循環(huán)次數(shù) 3035次 復(fù)性溫度決定于所用引物的長短與堿基組成，一般需要通過預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定。,1、變性的時(shí)間和溫度 模板DNA的變性不充分是導(dǎo)致PCR失敗的一個(gè)重要原因。 一般在第一輪循環(huán)前先進(jìn)行94預(yù)變性35min，以便使模板DNA完全解鏈。,2、引物退火的溫度與時(shí)間 引物的退火溫度和所需時(shí)間長短取決于反應(yīng)體系中擴(kuò)增的基因組成及引物的長度、濃度和堿 基組成。 實(shí)際使用的退火溫度一般要比引物的Tm值低25 。 Tm4(G+C)2(A+T) 一般當(dāng)引物中G+C含量高、長度較長并與模板完全配對(duì)時(shí)，應(yīng)提高退火溫度。退火溫度越高，所得產(chǎn)物的特異性越高。 當(dāng)然， 退火溫度也不能過高 ，否則引物不能與模板很好得結(jié)合，得不到擴(kuò)增產(chǎn)物。退火通常需要3060s。,退火與產(chǎn)物特異性的關(guān)系,3、延伸時(shí)間和溫度 延伸的時(shí)間長短取決于目的序列的長度、使用的PCR儀等。 一般引物延伸是在72 下進(jìn)行。對(duì)2Kb以上長片段DNA的擴(kuò)增可適當(dāng)延長時(shí)間 。,4、平臺(tái)效應(yīng) 引起平臺(tái)效應(yīng)的因素： （1）dNTP或引物等消耗殆盡 （2）酶活性逐漸降低 （3）最終產(chǎn)物的阻化作用 （焦磷酸鹽、雙鏈DNA） （4）非特異性產(chǎn)物或引物的 二聚體與反應(yīng)模板的競(jìng)爭作用,第三節(jié) PCR反應(yīng)的問題與對(duì)策,問題一、無產(chǎn)物 問題二、非特異性擴(kuò)增 問題三、空白對(duì)照有擴(kuò)增（有污染）,問題1：無產(chǎn)物,問題2：非特異產(chǎn)物擴(kuò)增,問題3：空白對(duì)照有擴(kuò)增,利用尿嘧啶N-糖苷酶（UDG） 解決遺留污染的方法,原理：UDG可以切斷含有尿嘧啶核苷的DNA雙鏈。 方案一：dUTP方案 是在所有的PCR反應(yīng)中均用dUTP代替dTTP，這樣產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物中除引物位置外，dTTP處被dUTP代替，這并不影響對(duì)其進(jìn)行克隆等操作。在每次PCR之前，均將設(shè)置好的PCR反應(yīng)體系用UDG處理，那么其中的遺留污染DNA(假如有的話)將被破壞，不能作為下面PCR反應(yīng)的底物，由于在后續(xù)的熱變性過程中UDG將被滅活，所以事先加入的UDG不會(huì)對(duì)本反應(yīng)的產(chǎn)物構(gòu)成任何影響。,方案二：dU引物方案。 即在引物合成過程中用dUTP代替dTTP，用這類引物引導(dǎo)合成的PCR產(chǎn)物在兩條鏈的5端引物部位含有dU，用 UDG 處理后，該區(qū)段被破壞，剩余的部分在后續(xù)的PCR循環(huán)中不能作為有效模板被擴(kuò)增。 由于UDG對(duì)長于4核苷酸的DNA(單鏈或雙鏈)所含的dU都能進(jìn)行清除，所以在dU引物方案中需先將UDG滅活后再加入下一輪PCR的引物。,第四節(jié) 一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)PCR實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì),第一步 設(shè)計(jì)引物 引物設(shè)計(jì)是否合理，是決定PCR反應(yīng)成敗的關(guān)鍵。一步走錯(cuò)，全盤皆錯(cuò)。所以，在這方面我們應(yīng)多花點(diǎn)時(shí)間，可以避免以后少走彎路。 1）根據(jù)自己所要研究的基因，在Gene bank中找到相應(yīng)的基因序列。 2）用Primer 5.0或Oligo 6.0 進(jìn)行引物探針的設(shè)計(jì)。或者采用參考文獻(xiàn)中的引物設(shè)計(jì)。 根據(jù)我的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，最好參考國外的文獻(xiàn)，等級(jí)越高可靠性越高。 （引物設(shè)計(jì)原則參見前面部分）,第二步、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備階段,1）通過e-mail向公司提交引物合成申請(qǐng)單； 2）購買實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑或試劑盒以 及各種低值易耗品； 3）對(duì)實(shí)驗(yàn)所需的EP管、Tip頭進(jìn)行滅菌處 理（RNA提取和反應(yīng)還需特別處理，請(qǐng) 參考分子克?。粚?duì)引物參照說明 書進(jìn)行稀釋。 4）細(xì)讀試劑盒說明書、熟悉操作步驟、制定 具體可行的操作方案。,第三步 實(shí)驗(yàn)操作階段,基因組DNA、質(zhì)粒DNA或總RNA的提取 用紫外分光光度計(jì)或熒光計(jì)檢測(cè)DNA或RNA 的濃度、純度，用瓊脂糖凝膠檢測(cè)是否降解 PCR（RT-PCR）反應(yīng) 電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,第五節(jié) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)類型,1、 增效PCR 6、 RT-PCR 2、 熱啟動(dòng)PCR 7、 PCR-VNTR 3、 降落PCR 8、 PCR-SSCP 4、 巢式PCR 9、 免疫-PCR 5、 多重PCR 10、PCR-ELISA ,1、增效PCR（booster PCR） 當(dāng)擴(kuò)增少于1000拷貝的模板DNA時(shí)會(huì)遇到兩個(gè)問題：一是形成引物二聚體，一是非特異擴(kuò)增，消耗了引物和酶，而特異擴(kuò)增片段產(chǎn)量降低。對(duì)于這種情況，可設(shè)置二步PCR，先用較低濃度的引物進(jìn)行初級(jí)PCR，此時(shí)由于引物少，形成引物二聚體的可能減少，但它并不影響靶序列的擴(kuò)增，只是由于引物少產(chǎn)量不高。約經(jīng)1520個(gè)循環(huán)后，再以稀釋后的初級(jí)PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行次級(jí)擴(kuò)增，靶序列的產(chǎn)量將會(huì)相應(yīng)增加。,2、熱啟動(dòng)PCR（Hot start PCR）,熱啟動(dòng)是一種在PCR反應(yīng)中優(yōu)化目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物的方法， 同時(shí)也能抑制非特異產(chǎn)物的擴(kuò)增。 它通過控制PCR反應(yīng)的必須組分，如DNA聚合酶或鎂離 子，直到反應(yīng)混合物被加熱到可以阻止非特異引導(dǎo)和引物聚 合的溫度，才加入以上成分來啟動(dòng)PCR反應(yīng)的一種方法。 在PCR反應(yīng)第一個(gè)循環(huán)之前的加溫步驟可去除并降低寡 核苷酸引物非特異性復(fù)性的可能性，而DNA聚合酶活性的缺 失則阻止了錯(cuò)配引物的延伸。,熱啟動(dòng)PCR 常規(guī)PCR,方 法 介 紹,1）升溫后手工加酶：不方便、容易污染。 2）PE公司的蠟?zāi)じ綦x法：更適用于不帶熱蓋的PCR儀。如PE TC1、PE480。 3）單克隆抗體法：抗體與Taq酶結(jié)合抑制其活性。隨 著溫度的升高，抗體從酶上解離下來并在首輪PCR 循環(huán)的變性階段被滅活，而酶的活性釋放。此法適 用于各種PCR儀。 4）另一個(gè)改進(jìn)方法：把Mg2+嵌入到蠟珠中，并隨著 蠟的熔化而釋放到反應(yīng)混合液中 。,應(yīng) 用,熱啟動(dòng)PCR對(duì)于已優(yōu)化的單個(gè)PCR反應(yīng)沒有必要。然而當(dāng)非特異擴(kuò)增較為嚴(yán)重時(shí)，熱啟動(dòng)PCR就派上了用場(chǎng)。 例如當(dāng)反應(yīng)中的模板DNA少于10 個(gè)拷貝數(shù) 時(shí)，或當(dāng)模板DNA復(fù)雜度非常高時(shí)（如哺乳動(dòng)物基因組DNA），或當(dāng)PCR包括幾對(duì)寡核苷酸引物時(shí)， 即多重PCR (multiplex PCR) ，在這些情況下，熱啟動(dòng)PCR和降落PCR結(jié)合有著很好的應(yīng)用價(jià)值。,4,3、降落PCR （Touch Down-PCR）,降落PCR是一個(gè)很簡單、實(shí)用的方法，當(dāng)應(yīng) 用新的引物和模板組合時(shí)，降落PCR是優(yōu)化PCR最迅速的方法，當(dāng)遇到諸如引導(dǎo)效率低，錯(cuò)誤引 導(dǎo)和形成引物二聚體等問題時(shí)，降落PCR和熱啟 動(dòng)PCR配合應(yīng)用或加入GC-melt是解決問題的首選方法。,原 理,該方法是指在一次PCR過程中把復(fù)性溫度設(shè)定在由高變低的一定范圍內(nèi)。擴(kuò)增的前兩個(gè)循環(huán)的復(fù)性溫度應(yīng)設(shè)計(jì)在比退火溫度較高的那條引物的熔解溫度（Tm）高大約3 左右, 在隨后的循環(huán)中復(fù)性溫度在每個(gè)循環(huán)中降低1 。當(dāng)達(dá)到引物特異引導(dǎo)的許可溫度時(shí)，目的序列開始擴(kuò)增。而非特異性擴(kuò)增則會(huì)延遲幾個(gè)循環(huán)，直到復(fù)性溫度降到非特異產(chǎn)物可以進(jìn)行引導(dǎo)時(shí)擴(kuò)增才開始。然而，這時(shí)特異性產(chǎn)物此時(shí)已占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)并且能有效地抑制非特異擴(kuò)增產(chǎn)物的積累。該方法可與熱啟動(dòng)PCR或增效PCR技術(shù)聯(lián)用，作為PCR實(shí)驗(yàn)的常規(guī)技術(shù)。,TouchDown PCR 中溫度變化規(guī)律,TouchDown PCR 中溫度變化規(guī)律,4、巢式PCR（nest PCR）,此時(shí)也是進(jìn)行二步PCR，與上面不同的是，第二級(jí)PCR需另行設(shè)置反應(yīng)體系，并應(yīng)用另外的PCR引物，此時(shí)引物的位置位于初級(jí)PCR引物的內(nèi)側(cè)，用初級(jí)PCR產(chǎn)物做模板，進(jìn)行第二步PCR，這樣只有初級(jí)PCR中特異的擴(kuò)增片段才能被二級(jí)引物擴(kuò)增。 除了達(dá)到增效PCR同樣的目的外，還提高了最終產(chǎn)物的特異性。,在同一PCR體系中加入數(shù)對(duì)PCR引物，如 果這些引物的退火溫度相近，并且所覆蓋的 區(qū)域不重疊，這樣的反應(yīng)體系可同時(shí)擴(kuò)增多 個(gè)DNA片段。 多重PCR常用來檢測(cè)同一基因的多個(gè)外 顯子缺失；或檢測(cè)某基因是否缺失或不表達(dá) 時(shí)，需同時(shí)與內(nèi)對(duì)照一起擴(kuò)增；另外，在法 醫(yī)學(xué)鑒定中， 經(jīng)常采用多重PCR同時(shí)擴(kuò)增多 個(gè)STR位點(diǎn)來進(jìn)行親子鑒定或個(gè)體識(shí)別， 以 提高檢測(cè)的效率。,5、多重PCR (Multiplex PCR),利用多重PCR對(duì)缺失突變型 DMD進(jìn)行基因診斷,實(shí)線代表缺失區(qū)，虛線代表可能缺失區(qū),6、RT-PCR,RT-PCR是以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶作用合成cDNA。使微量的mRNA（pg水平）得以迅速擴(kuò)增（達(dá)ngug水平），大大提高mRNA的檢出靈敏度。應(yīng)用于基因表達(dá)與調(diào)控的研究。,（1）基本步驟,1）RNA變性：65 75，2分鐘 2）逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA： 依次加入各種反應(yīng)混合物后，37，1小時(shí) cDNA合成效率可通過檢測(cè)摻入放性標(biāo)記 物的比反射活 性來確定；cDNA分子大小可用堿性瓊脂糖凝膠電泳來 鑒定。 3） 95 變性，逆轉(zhuǎn)錄酶滅活、RNA-cDNA雜合物變性。 4） 調(diào)整引物量（兩引物的量應(yīng)相等）和模板的量（一般取 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的1/10），在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增 目的DNA。為提高特異性可采用熱啟動(dòng)或降落-PCR技術(shù) 5） 電泳檢測(cè)結(jié)果。,RT-PCR的步驟一,oligo(dT)n,RT-PCR的步驟二,合成的 cDNA,（2）RT-PCR引物設(shè)計(jì)注意事項(xiàng),1）依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，針?duì)單鏈cDNA第一鏈 合成的引物可以不同，主要有三類：基因特異性引物（GSP）;多聚胸腺嘧啶核苷酸通用型引物Oligo（dT）;隨機(jī)六核苷酸引物（Random Hexamers)。多數(shù)情況下使用Oligo（dT），但對(duì)不含Poly(A)尾的mRNA（如組蛋白）不適用。 2）除了要遵循常規(guī)PCR引物設(shè)計(jì)的原則之外，RT-PCR引物設(shè)計(jì)時(shí)，正向和反向引物最好結(jié)合到不同外顯子的不同區(qū)域。這樣可以很容易地把來源于cDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物和來源于污染的基因組DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)分開（片段大小不同）。,（3）問題與對(duì)策,1）每完成一步都要檢測(cè)，通過后再開始下一 步操作； 2）當(dāng)出現(xiàn)非特異性帶，而通過改變參數(shù)結(jié)果 仍然不理想時(shí)，可使用TD-PCR； 3）如果TD-PCR也沒有擴(kuò)增出特異性片段， 重新設(shè)計(jì)引物； 4）每個(gè)PCR反應(yīng)都應(yīng)設(shè)內(nèi)對(duì)照。,7、VNTR-PCR技術(shù),數(shù)目變異串聯(lián)重復(fù)（variable number tendom repeats, VNTR）序列以各自的核心序列（通常為6bp的重復(fù)單元，如(CGG)n等，稱為微衛(wèi)星DNA）首尾相連多次重復(fù)，由于其重復(fù)數(shù)在人群中呈高度變異，故稱為數(shù)目變異串聯(lián)重復(fù)序列。它們散在地分布于染色體上，以插入/缺失方式形成多態(tài)性。 這種多態(tài)性可以通過在VNTR重復(fù)序列的兩側(cè)保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)引物對(duì)變異區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。電泳檢測(cè)，可見到長短不一的等位片段，稱之為擴(kuò)增片段長度多態(tài)（amplified fragment length polymorphism, AFLP）,PCR-VNTR應(yīng)用于遺傳病的連鎖分析,PCR-VNTR技術(shù)應(yīng)用于親子鑒定,是指單鏈DNA由于堿基序列不同可引起構(gòu)象差異，這種構(gòu)象差異將造成相同或相近長度的單鏈DNA電泳遷移率不同。據(jù)此，可檢測(cè)出DNA中單個(gè)堿基的替代、微缺失或插入。 通常與PCR技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，稱為PCR-SSCP技術(shù)。在疑有突變的DNA片段附近設(shè)計(jì)一對(duì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物經(jīng)甲酰胺等變性，并在聚丙烯酰胺凝膠中電泳（中性膠），突變所引起的DNA構(gòu)象差異將表現(xiàn)為電泳條帶位置的差異，從而作出判斷。,8、PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性 (single strand conformation polymorphism,SSCP),PCR-SSCP過程,- primer - PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物 甲酰胺變性 單鏈構(gòu)象DNA 中性聚丙烯酰胺凝膠電泳 1 2 3 4 5 銀染 1.為正常 結(jié)果分析 2、4、5純合患者 3.為雜合子 .,解鏈,快速降溫后形成特定的構(gòu)像,DNA,原 理,過 程,快速置冰浴中,特 點(diǎn) PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)(PCR-SSCP)的優(yōu)點(diǎn)是簡單、快速、靈敏度高、成本低，可同時(shí)處理多個(gè)樣本。但受溫度的影響大，所以，最好用帶恒溫裝置的電泳儀跑膠，往往可得到較理想的結(jié)果。,應(yīng) 用,PCR-SSCP技術(shù)通常與測(cè)序相結(jié)合，從而構(gòu)成PCR-SSCP-Sequence三聯(lián)檢測(cè)，可用于發(fā)現(xiàn)基因的未知突變或SNP。在現(xiàn)代分子生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。,9、免疫PCR,免疫PCR是將PCR的強(qiáng)大擴(kuò)增效力應(yīng)用于免疫學(xué)檢測(cè)中，它與傳統(tǒng)方法ELISA、放射免疫法相比其靈敏度要提高幾個(gè)數(shù)量級(jí)。,10、PCR-ELISA技術(shù),PCR- ELISA是將PCR與核酸雜交、ELISA 連為一體， 用ELISA鑒定PCR產(chǎn)物的一種方法， 它避免了因使用Southern Blotting所帶來的放射性污染。,11、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù) (Real time Quantitative PCR),第六節(jié) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的應(yīng)用,一、核酸的基礎(chǔ)研究（目的基因的檢測(cè)及獲取、突變體的構(gòu)建、 T/A載體克隆PCR產(chǎn)物等） 二、突變檢測(cè)和序列分析（PCR-SSCP、PCR-Sequence等） 三、檢測(cè)基因表達(dá)（RT-PCR、DD-PCR、SSH、基因芯片等) 四、從cDNA文庫中放大特定序列（利用PCR對(duì)cDNA文庫的 差式篩選） 五、研究已知片段鄰近基因或未知DNA片段（基于錨定-PCR 的RACE技術(shù)來獲取cDNA全長） 六、進(jìn)化分析（利用PCR技術(shù)擴(kuò)增rRNA基因可對(duì)各物種進(jìn)行 遺傳聚類分析，從而確定各物種之間的親緣和進(jìn)化關(guān)系。) 七、醫(yī)學(xué)應(yīng)用（遺傳病診斷、惡性腫瘤診斷及預(yù)后、各種病原 體的檢測(cè)、移植配型等） 八、獲取生物學(xué)證據(jù)（親子鑒定、個(gè)體識(shí)別等） 九、性別控制（SRY基因的PCR檢測(cè)，用于兩性畸形診斷及性 連鎖疾病的性別控制） 十、轉(zhuǎn)基因檢測(cè)（應(yīng)用Q-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的GMO基因）,第七節(jié) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的 原理及應(yīng)用 (Real time Quantitative PCR),通過前面的學(xué)習(xí)，我們已經(jīng)知道PCR可對(duì)特定核苷酸片斷進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增。在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束之后，我們?cè)缙诓捎玫姆椒ㄊ峭ㄟ^凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定性分析，也可以通過對(duì)光密度掃描來進(jìn)行半定量的分析。無論定性還是半定量分析，分析的都是PCR終產(chǎn)物。但是在絕大多數(shù)情況下，我們所感興趣的是未經(jīng)PCR信號(hào)放大之前的起始模板量。而起始模板量與PCR終產(chǎn)物的量并不存在明顯的線性關(guān)系，甚至經(jīng)常是背離的。,同一個(gè)樣品在96孔反應(yīng)板中同時(shí)擴(kuò)增，所得終產(chǎn)物產(chǎn)量差異明顯。,低原始模板量的樣品到平臺(tái)期時(shí)產(chǎn) 量反而高。,例如我們想知道某一特定基因在特定組織中的表達(dá)量，顯然普通PCR已不能滿足我們的需求，在這種需求下熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。 熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)最早于1992年由一位日本人提出的，他當(dāng)時(shí)的初衷很簡單，就是想實(shí)時(shí)地看到PCR反應(yīng)的整個(gè)過程，由于當(dāng)時(shí)EB（溴化乙錠）的廣泛使用，最直接想到的標(biāo)記染料就是EB， EB可以插入到雙鏈核酸中受激發(fā)產(chǎn)生熒光。這樣，在普通PCR儀的基礎(chǔ)上再配備一個(gè)激發(fā)和檢測(cè)的裝置，第一臺(tái)實(shí)時(shí)定量PCR儀就誕生了。但真正意義上的熒光定量PCR儀由美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司于1996年全球首次推出。,提 綱,一、實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 二、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的幾種標(biāo)記方法 三、實(shí)時(shí)熒光定量PCR醫(yī)學(xué)和科研中的應(yīng)用,一、實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理,（一）實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 （二）如何對(duì)起始模板定量？,（一）實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理,在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。 每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線。,實(shí)時(shí)搜集熒光信號(hào),熒光擴(kuò)增曲線可以分三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，我們無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加。PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始DNA拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。,熒光背景信號(hào)階段,熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段,平臺(tái)期,（二）如何對(duì)起始模板定量？,通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。 下面介紹四個(gè)概念： 擴(kuò)增曲線、熒光閾值、Ct值、標(biāo)準(zhǔn)曲線,1、擴(kuò) 增 曲 線,熒光基團(tuán),橫坐標(biāo)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cycle）；縱坐標(biāo)：熒光強(qiáng)度； 每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號(hào)的收集。,擴(kuò)增曲線指在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物過程中，由定量PCR儀搜集熒光信號(hào)，并通過計(jì)算機(jī)分析后，用于描述擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的熒光量隨循環(huán)數(shù)增加而呈幾何級(jí)數(shù)增長的一條曲線。,2、熒 光 閾 值（Threshold）,熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè) 定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍左右。,3、Ct值,C(t) value,Ct值的定義： PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。,Ct值的重現(xiàn)性,Ct值的特點(diǎn)： 相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定； Ct值則具有極好的重現(xiàn)性。,4、定量的計(jì)算原理,理想的PCR反應(yīng)： X=X02n 非理想的PCR反應(yīng)： X=X0(1+Ex)n n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù) X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量 X0：初始模板量 Ex：擴(kuò)增效率（0100之間）,C(t) value,擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值線時(shí)： XCt=X0(1+Ex)Ct =M (1) XCt:熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量。在閾值線設(shè)定以后,它是一個(gè)常數(shù),我們?cè)O(shè)為M 方程式(1)兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)得: logM=logX0(1+Ex)Ct (2) 整理方程式(2)得: logX0= -log(1+Ex)Ct+logM (3) Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性、負(fù)相關(guān)，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計(jì)算出樣品中所含的模板量。,5、標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線,模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小 Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn) 品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量。,確定未知樣品的 C(t)值 。 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量。,6、定量結(jié)果,Log of DNA concentration,模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少。 Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品Ct值，就可以 計(jì)算出樣品中所含的模板量。,非特異性熒光染料標(biāo)記： 1、 SYBR Green 特異性熒光探針標(biāo)記： 2、 TaqMan 3、Molecular Beacon 4、雙探針法,二、熒光標(biāo)記的不同方法,方法1：SYBR Green 法,SYBR Green,小溝,大溝,SYBR Green法 工作原理,SYBR Green能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位。,SYBR Green只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光。 變性時(shí)，DNA雙鏈分開無熒光。復(fù)性和延伸時(shí)， 形成雙鏈DNA，SYBR Green發(fā)熒光，在此階段采 集熒光信號(hào)。,SYBR Green,SYBR Green I 工作原理,Emission,Excitation,Excitation,由于SYBR Green 與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，因此由引物二聚體、單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)以及非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物引起的假陽性會(huì)影響定量的精確性。 通過測(cè)量升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產(chǎn)物的影響。 由熔解曲線來分析產(chǎn)物的均一性有助于更準(zhǔn)確地分析SYBR Green PCR定量結(jié)果。,在PCR結(jié)束后，我們可以根據(jù)變性過程 中的熒光值變化繪出每個(gè)樣品的熔解曲線。繪制熔解曲線時(shí)，Real-Time PCR 儀連續(xù)監(jiān)測(cè)每個(gè)樣品在從雙鏈完全配對(duì) 到完全解鏈的升溫過程中熒光值的變化 過程。,不同的擴(kuò)增產(chǎn)物因?yàn)槠溟L度和GC含量不同而 在不一樣的溫度下解鏈，當(dāng)產(chǎn)物解鏈時(shí)，SYBR Green 的熒光值將迅速降低并被儀器監(jiān)測(cè)到。 熒光強(qiáng)度變化的拐點(diǎn)即為熔解峰值。Tm值是DNA解鏈一半時(shí)的溫度。熔解曲線是擴(kuò)增反應(yīng)的質(zhì)控途徑，當(dāng)圖中沒有出現(xiàn)雜峰，也未出現(xiàn)主峰的異常增寬，表明實(shí)驗(yàn)中未出現(xiàn)污染、引物二聚體和非特異性擴(kuò)增。,SYBR Green I 熔解曲線分析,Tm值：DNA解鏈一半時(shí)的溫度,溫 度,Tm值,SYBR Green I 熔解曲線分析,對(duì)熒光強(qiáng)度與溫度的變化求副導(dǎo)數(shù)。(-dF/dT) 并以其作為縱座標(biāo)，溫度作為橫座標(biāo)。,Tm,-dF/dT,SYBR Green 法融解曲線分析,融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰 其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性 熒光，因此定量不準(zhǔn)確,-dF/dT,-dF/dT,SYBR Green 法PCR的建立和優(yōu)化,1. SYBR Green 使用濃度:太高抑制Taq酶活性，太低熒光信號(hào)太弱，不易檢測(cè)。 2. Primer：引物的特異性高，否則擴(kuò)增有雜帶，定量不準(zhǔn) 可采用TD-PCR方法，提高產(chǎn)物的特異性。 3. MgCl2的濃度:可以降低到1.5mM,以減少非特異性產(chǎn)物。 4. 反應(yīng)Buffer體系的優(yōu)化。 5. 反應(yīng)溫度和時(shí)間參數(shù):由酶、引物、擴(kuò)增片段長度及模板的種類等因素決定。 6. 其他與常規(guī)PCR相同，,SYBR Green 法應(yīng)用范圍,起始模板的測(cè)定。 基因型的分析。 融解曲線分析可以優(yōu)化PCR反應(yīng)的條件，對(duì)常規(guī)PCR有指 導(dǎo)意義，如對(duì)primer的評(píng)價(jià)；可以區(qū)分單一引物、引物 二聚體、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物。,SYBR Green 法的特點(diǎn),A、相對(duì)雜交探針方法，插入染料法相對(duì)較便宜。 B、不需要特別設(shè)計(jì)探針。 C、SYBR Green 是最常用的插入染料。 D、SYBR Green 染料插入雙鏈DNA，檢測(cè)靈 敏度提高200倍。 E、和雜交探針方法相比，插入染料法特異性低。 F、不能做多重PCR。 G、在延伸反應(yīng)結(jié)束時(shí)搜集熒光信號(hào)。,方法2：TaqMan法,TaqMan-水解型雜交探針,5端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter) ，如FAM、VIC等。 3端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán) (Quencher)。 探針完整時(shí)，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收 ，無熒光； R與Q分開，發(fā)熒光。,TaqMan法工作原理,Taq酶有 53外切核酸酶活性，當(dāng)其接近探針時(shí)可水解探針。將探針5端連 接的熒光基團(tuán)從探針上切割下來，游離于反應(yīng)體系中，從而脫離3端熒光淬滅基 團(tuán)的屏蔽，接受光刺激發(fā)出熒光信號(hào)。每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子游離出來，實(shí)現(xiàn)了每擴(kuò)增一條DNA分子，釋放一個(gè)熒光信號(hào)。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，不斷積累熒光信號(hào)?？梢栽谘h(huán)過程中任一點(diǎn)檢測(cè)熒光。,TaqMan 法PCR反應(yīng)的建立,1、引物、探針的設(shè)計(jì)： 探針Tm為68-70 ，30 bp, 5不能有G，G可能會(huì)淬滅熒 光素，引物盡量靠近探針，擴(kuò)增片段400 bp，引物Tm為5960 。 2、反應(yīng)參數(shù)的確定： 一般為：94 ，10-20秒；60，30-60秒（Taq酶53 外切核酸酶活性在60 最高），也可通過TD-PCR程序優(yōu)化退 火溫度；72 ，45秒。 3、優(yōu)化引物和探針濃度： 引物濃度：50-900nM 探針濃度：50-250nM 4、其他與常規(guī)PCR相同,TaqMan法特點(diǎn),A、產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光信號(hào)； B、容易設(shè)計(jì)和合成； C、可以做多重檢測(cè)； D、能夠進(jìn)行SNP檢測(cè)； E、比插入染料貴。,方法 3：分子信標(biāo)法,標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針 環(huán)與目標(biāo)序列互補(bǔ) 莖由互補(bǔ)配對(duì)序列組成,發(fā)夾型雜交探針,Molecular beacon(分子信標(biāo))工作原理,標(biāo)記熒光的探針與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合后即直接產(chǎn)生熒光。 它本質(zhì)上是一種標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針，當(dāng)探針分子 呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)，結(jié)合在其兩端的熒光基團(tuán)距離上接 近， 使得產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，而不發(fā)生熒光。當(dāng)互 補(bǔ)序列出現(xiàn)時(shí)，探針與DNA雜交， 探針轉(zhuǎn)變成一個(gè) 開放的結(jié)構(gòu)，呈線性，報(bào)告熒光基團(tuán)與淬滅熒光基 團(tuán)彼此在空間 上產(chǎn)生足夠的分離，熒光基團(tuán)脫離了 淬滅基團(tuán)的影響，從而產(chǎn)生可被檢測(cè)到的熒光。,分子信標(biāo)的原理圖,熒光素,淬滅基團(tuán),熒光淬滅,與模板退火形成局部雙鏈,Molecular beacon(分子信標(biāo))應(yīng)用范圍,起始模板的定量 基因型分析 產(chǎn)物鑒定 SNP（單核苷酸多態(tài)性）分析,Molecular beacon (分子信標(biāo))特點(diǎn),A、SNP檢測(cè)。 B、多重PCR。 C、難設(shè)計(jì)、合成。 D、產(chǎn)生的熒光信號(hào)較低。 E、價(jià)格昂貴 。 F、在退火時(shí)搜集熒光信號(hào)。,方法4：FRET探針法,FRET探針由兩條相鄰探針組成，在一條探針的5 端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)， 另一探針的3端標(biāo)記Red 640 （或Red 705）熒光基團(tuán)。當(dāng)復(fù)性時(shí)，探針結(jié)合在模板 上FAM 基團(tuán)和Red 640基團(tuán)相鄰，激發(fā)FAM產(chǎn)生的熒 光，作為Red 640基團(tuán)的激發(fā)光被吸收，使Red 640發(fā) 出波長為640 nm的熒光。當(dāng)變性時(shí)，探針游離，兩基 團(tuán)距離遠(yuǎn)，不能產(chǎn)生640 nm波長的熒光。由于FRET探 針是靠近發(fā)光，所以檢測(cè)的信號(hào)是實(shí)時(shí)信號(hào)，非累積信號(hào)。,熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理（FRET）,熒光,FRET探針法的特點(diǎn),A、特異性好； B、SNP檢測(cè)； C、難設(shè)計(jì)； D、費(fèi)用昂貴。 E、在退火時(shí)搜集熒光信號(hào)。,實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)點(diǎn),1 特異性好 使用特異性探針對(duì)定量分子進(jìn)行識(shí)別，具有很高的準(zhǔn)確性。同時(shí)， 靶序列由引物和探針雙重控制(插入染料法除外)，特異性好，假 陽性低。 2靈敏度高 熒光PCR檢測(cè)技術(shù)是綜合了PCR技術(shù)、熒光標(biāo)記技術(shù)、激光技術(shù)、 數(shù)碼顯像技術(shù)為一體的技術(shù)，因此它的檢測(cè)靈敏度很高。 3線性關(guān)系好、線性范圍寬 由于熒光信號(hào)的產(chǎn)生和每次擴(kuò)增產(chǎn)物成一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，通過熒光 信號(hào)的檢測(cè)可以直接對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量；定量范圍可在010 拷貝 毫升。 4操作簡單、安全、自動(dòng)化程度高、防污染。 擴(kuò)增和檢測(cè)可以在同一管內(nèi)進(jìn)行，不需要開蓋，不易污染；同時(shí)擴(kuò)增 和檢測(cè)一步完成，不需要后期處理，不再需要擔(dān)心EB和放射性污染。 5速度快、高通量 可在23小時(shí)完成96個(gè)樣品的定量分析。,10,第四節(jié) 定量PCR實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì),1、根據(jù)自己所要研究的基因，在gene bank中找到相應(yīng) 的基因序列。 2、應(yīng)用相應(yīng)的引物探針軟件，進(jìn)行引物探針的設(shè)計(jì)。 引物設(shè)計(jì)原則： A、引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)； B、引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)； C、引物設(shè)計(jì)的特異性要好； D、引物長度通常在20-25bp，Tm值在5565，GC含 量在4060； E、引物3端避免使用堿基A與出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基； F、為鑒定出現(xiàn)基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)最好能跨2個(gè)外 顯子。,探針設(shè)計(jì)原則： A、探針位置盡可能地靠近上游引物； B、探針長度通常在20-30bp，Tm值在65-70， 通常比引物高5-10 ，GC含量在40-70。 C、探針地5端應(yīng)避免使用堿基G； D、整條探針中，C的含量要明顯高于G地含量； E、設(shè)計(jì)的探針特異性要好。 3、根據(jù)儀器的特點(diǎn)與要求，選擇不同標(biāo)記的熒光素。 4、引物與探針的合成及相關(guān)試劑的準(zhǔn)備。 5、標(biāo)準(zhǔn)品地制備。 6、先做普通PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)，找出最佳的PCR反應(yīng)條件。,7、PCR反應(yīng)體系：通常使用混合好的試劑，只需加入 引物、探針、模板與PCR水： MIXTRUE 適量 引物 0.3-0.5UM 探針 0.1-0.3UM 模板 2-5ul 水 至20-50ul 以上濃度均為終濃度，插入染料法不需要加入探針。 8、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：根據(jù)情況進(jìn)行10倍數(shù)的濃度稀釋， 做35個(gè)梯度。 9、樣本的檢測(cè)，每個(gè)樣本做兩個(gè)復(fù)孔，每次實(shí)驗(yàn)均設(shè) 空白對(duì)照。 10、基線或閾值的設(shè)定。,Lightcycler 熒光定量PCR系統(tǒng)介紹,機(jī)器構(gòu)造,配件,上機(jī)前操作過程,準(zhǔn)備反應(yīng)混和物,上機(jī)前離心,將反應(yīng)毛細(xì)管插入反應(yīng)盤中,上機(jī),實(shí)驗(yàn)完成后傾倒毛細(xì)管的方法,特 點(diǎn) 1、可使用外標(biāo)法定量，可加內(nèi)對(duì)照，可做熔點(diǎn)曲線分析。 2、單一光路的三個(gè)檢測(cè)點(diǎn)對(duì)樣本同時(shí)進(jìn)行三個(gè)波長的熒 光檢測(cè)，擴(kuò)增與檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，提供實(shí)時(shí)分析和在線 監(jiān)測(cè)。引入獨(dú)特的顏色補(bǔ)償試劑和軟件以消除個(gè)檢測(cè) 通道其它染料熒光的干擾。 3、一次可做32個(gè)樣本。 4、共用熱室，保證單次PCR每個(gè)樣本的狀況連續(xù)一致。循 環(huán)速度快，20-30分鐘完成30-40個(gè)循環(huán)，一次檢測(cè)樣本 數(shù)32個(gè)。,Lightcycler 熒光定量PCR系統(tǒng),清潔和維護(hù) 反應(yīng)槽和內(nèi)壁均可用家用洗滌劑清潔，但反應(yīng)槽必須在取出后才能進(jìn)行清潔。 當(dāng)毛細(xì)管破碎時(shí)，首先用儀器廠家提供的毛刷將碎片去除，再用70%乙醇清洗反應(yīng)槽。 光路部分須用無水乙醇清潔。,實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的醫(yī)學(xué)應(yīng)用,臨床疾病檢測(cè) 定量分析：各種病毒，細(xì)菌，衣源體，支原體，病毒載量。 Her2基因、白血病融合基因等腫瘤標(biāo)志物基因 檢測(cè)對(duì)疾病進(jìn)行診斷、療效觀察及預(yù)后。 基因分型： 病原耐藥性點(diǎn)突變的檢測(cè)(MGB)、腫瘤耐藥基因 檢測(cè)，避免盲目用藥。 各種基因的定量表達(dá)分析: 大樣本量，快速方便，線性范圍寬，重現(xiàn)性好，定量準(zhǔn)確。 SNP和基因突變分析： 疾病相關(guān)基因型與臨床表型的關(guān)系 。 SNP檢測(cè)與臨床表現(xiàn)的相關(guān)性：抗高血壓藥物療效個(gè)體差異、 藥物副反應(yīng)的預(yù)防。,目的：利用核酸檢測(cè)，縮短檢驗(yàn)時(shí)間，提高靈敏度，為診斷 用藥提供依據(jù)。 方法：從血液中提取病毒DNA，擴(kuò)增病毒基因，以TaqMan探針 進(jìn)行檢測(cè)。 對(duì)照：濃度為106、105 、104 103 的標(biāo)準(zhǔn)樣品各一個(gè)，設(shè)陰 性和空白對(duì)照。 實(shí)驗(yàn)步驟：提取HBV DNA 配制反應(yīng)Mixture，加模板DNA 上機(jī)擴(kuò)增 軟件結(jié)果分析 結(jié)果：獲取血液樣品中HBV-DNA的精確copy數(shù)。,利用FRET探針法檢測(cè)血液中的HBV,利用LightCycler雙探針法 檢測(cè)血液中的HBV含量,第一步 編輯反應(yīng)程序,補(bǔ)充說明：熒光定量方法不同所選熒光通道不同,程序運(yùn)行界面,結(jié)果分析,熔鏈分析,突變分析,突變分析,TaqMan法在基因表達(dá)研究中的應(yīng)用,應(yīng)用TaqMan法研究ERBB2在乳腺腫瘤組織標(biāo)本中的表達(dá)差異,標(biāo)記探針,使用 TaqMan 探針進(jìn)行雙通道熒光定量,Fam標(biāo)記目標(biāo)基因探針 VIC標(biāo)記看家基因探針,1、材料準(zhǔn)備,從正常乳腺組織中提取的總RNA。 從乳腺癌組織中提取的總RNA。 含ERBB2 and GAPDH 的質(zhì)粒用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。 單雙通道同時(shí)進(jìn)行，獨(dú)立分析。 Controls no RNA：陰性對(duì)照 RNA + no reverse transcriptase：基因組對(duì)照,反應(yīng)程序,RT-QPCR 反應(yīng)程序：,癌癥標(biāo)記物表達(dá),Color 2 - VIC detection for GAPDH,Color 1 FAM detection for ERBB2,實(shí)驗(yàn)結(jié)果,Copies ng/ l Total RNA,實(shí)驗(yàn)結(jié)果,ERBB2 copies / GAPDH copies,1095 / 95500 = 0.011 1052 / 85730 = 0.012,2130/136000 = 0.017 2492/130800 = 0.019,Healthy RNA,Tumor RNA,0.0115,0.018,Copies ng/ l Total RNA,實(shí)驗(yàn)結(jié)果,Healthy Tissue,Carc. Tissue,Relative Expression,ERBB2的表達(dá)差異,討 論,1、通過RT-QPCR成功檢測(cè)了ERBB2基因在不同組織的 表達(dá)差異；在乳腺癌組織中，ERBB2的表達(dá)量是正常水平的1.8倍。 2、熒光實(shí)時(shí)定量中的內(nèi)標(biāo)的作用：常用的內(nèi)標(biāo)有-actin、GAPDH等看家基因。這些基因在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)相對(duì)恒定，受環(huán)境因素影響小。內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞的數(shù)量。因此可把目的表達(dá)基因與相應(yīng)的內(nèi)標(biāo)基因的比值用于消除不同樣品間總RNA在量上的差異。,SYBR Green I法舉例,利用SYBR Green 1進(jìn)行GMO定量,相對(duì)定量中內(nèi)標(biāo)的作用,對(duì)定量中的內(nèi)標(biāo)通常是-actin、GAPDH等看家基因。這些基因在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)相對(duì)恒定，受環(huán)境因素影響小。內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組數(shù)量相。,Lightcycler 熒光定量PCR系統(tǒng),原理和特點(diǎn) 1、可使用外標(biāo)法定量，可加內(nèi)對(duì)照，可做熔點(diǎn)曲線分析。 2、單一光路的三個(gè)檢測(cè)點(diǎn)對(duì)樣本同時(shí)進(jìn)行三個(gè)波長的熒 光檢測(cè)，擴(kuò)增與檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，提供實(shí)時(shí)分析和在線監(jiān)測(cè)。引入獨(dú)特的顏色補(bǔ)償試劑和軟件以消除個(gè)檢測(cè)通道其它染 料熒光的干擾。 3、一次可做32個(gè)樣本。 4、共用熱室，保證單次PCR每個(gè)樣本的狀況連續(xù)一致。循 環(huán)速度快，20-30分鐘完成30-40個(gè)循環(huán)，一次檢測(cè)樣本數(shù) 32個(gè)。,Lightcycler 熒光定量PCR系統(tǒng),清潔和維護(hù) 反應(yīng)槽和內(nèi)壁均可用家用洗滌劑清潔，但反應(yīng)槽必須在取出后才能進(jìn)行清潔。 當(dāng)毛細(xì)管破碎時(shí)，首先用儀器廠家提供的毛刷將碎片去除，再用70%乙醇清洗反應(yīng)槽。 光路部分須用無水乙醇清潔。,Thanks!,