《食品生物化學第4章核酸.ppt》由會員分享，可在線閱讀，更多相關《食品生物化學第4章核酸.ppt（107頁珍藏版）》請在裝配圖網上搜索。
1、第四章 核酸,主要內容,核苷酸 脫氧核糖核酸和核糖核酸 核酸的理化性質及分離純化,一、核酸的分類與組成,核酸分為兩大類: 脫氧核糖核酸（DNA） 主要存在于細胞核內。 核糖核酸（RNA） 主要存在于細胞質中。,（一）核酸的分類,（二）核酸的組成,核酸（DNA和RNA）是一種線性多聚核苷酸，它的基本結構單元是核苷酸。 核苷酸本身由核苷和磷酸組成, 核苷則由戊糖和堿基形成 DNA與RNA結構相似，但在組成成份上略有不同。,核苷酸,磷酸,核苷,戊糖,堿基,核酸,1核苷酸,基本組成單位,嘌呤,嘧啶,（1）組成核苷酸的堿基,1核苷酸,腺嘌呤 A,鳥嘌呤 G,尿嘧啶 U,胞嘧啶 C,胸腺嘧啶 T,（2）戊
2、糖,組成核酸的戊糖有兩種。 DNA所含的糖為-D-2-脫氧核糖。 RNA所含的糖則為-D-核糖。,（3）核苷 nucleoside,堿基+戊糖=核苷 糖與堿基之間的C-N鍵，稱為C-N糖苷鍵。,（4）核苷酸nucleotide,核苷酸是核苷的磷酸酯。 5-磷酸-脫氧核糖核苷-DNA 5-磷酸-核糖核苷-RNA,核苷+磷酸=核苷酸 核苷酸 脫氧核苷酸 腺嘌呤核苷酸 脫氧腺嘌呤核苷酸 AMP dAMP 鳥嘌呤核苷酸 脫氧鳥嘌呤核苷酸 GMP dGMP 胞嘧啶核苷酸 脫氧胞嘧啶核苷酸 CMP dCMP 尿嘧啶核苷酸 脫氧胸腺嘧啶核苷酸 UMP dTMP,(5)修飾成分,核酸中也存在一些不常見的稀有堿
3、基。稀有堿基的種類很多，大部分是上述堿基的甲基化產物。,核苷酸的理化性質P89,堿基與紫外吸收：260 nm 疏水堆積作用 堿基互補配對,ATP是生物體內分布最廣和最重要的一種核苷酸衍生物。,ATP (腺嘌呤核糖核苷三磷酸),2核苷酸的衍生物,腺苷酸及其多磷酸化合物,AMP Adenosine monophosphate,ADP Adenosine diphosphate,ATP Adenosine triphosphate,ATP的性質,ATP 分子的最顯著特點是含有兩個高能磷酸鍵。 ATP水解時, 可以釋放出大量自由能。 ATP 水解釋放出來的能量用于推動生物體內各種需能的生化反應。 AT
4、P 是生物體內最重要的能量轉換中間體。,多聚核苷酸,多聚核苷酸是通過核苷酸的5-磷酸基與另一分子核苷酸的C3-OH形成磷酸二酯鍵相連而成的鏈狀聚合物。 由脫氧核糖核苷酸聚合而成的稱為DNA鏈； 由核糖核苷酸聚合而成的則稱為RNA鏈。,脫氧核糖核酸(DNA)的結構 核酸 核糖核酸(RNA)的結構,第二節(jié) 核酸的結構,一級結構: 由4種脫氧核苷酸通過3-5磷酸二酯鍵連接起來的直線形或環(huán)形多聚體。 二級結構: 核苷酸鏈內或鏈之間通過氫鍵折疊卷曲而成的雙螺旋結構。絕大多數為右旋。 三級結構: 是指DNA分子在二級結構的基礎上通過進一步的扭曲和折疊所形成的特定構象。,一、脫氧核糖核酸(DNA)的結構,D
5、NA的一級結構-堿基序列 由4種脫氧核苷酸通過3-5磷酸二酯鍵連接起來的直線形或環(huán)形多聚體。 一級結構的走向的一般為53。 不同的DNA分子具有不同的核苷酸排列順序，因此攜帶有不同的遺傳信息。,二、DNA的一級結構,5-磷酸端（常用5-P表示）；3-羥基端（常用3-OH表示） 多聚核苷酸鏈具有方向性，當表示一個多聚核苷酸鏈時，必須注明它的方向是53或是35。,多聚核苷酸的表示方式,5PdAPdCPdGPdTOH 3 或5ACGTGCGT 3 ACGTGCGT,線條式,字母式,DNA的一級結構,RNA的一級結構,DNA與RNA的一級結構對照,二、DNA的二級結構,1953年，J. Watson和
6、F. Crick 在前人研究工作的基礎上，根據DNA結晶的X-衍射圖譜和分子模型，提出了著名的DNA雙螺旋結構模型，并對模型的生物學意義作出了科學的解釋和預測。,DNA分子由兩條DNA單鏈組成。 雙螺旋結構是DNA二級結構的最基本形式。 DNA的雙螺旋結構是分子中兩條DNA單鏈之間基團相互識別和作用的結果。,1DNA雙螺旋結構的特點,DNA雙螺旋模型,B型結構 兩條鏈反向平行，右手螺旋， 有大溝和小溝。 Z型結構 磷酸基在多核苷酸骨架上的分布呈Z字形。 左手螺旋，只有小溝。,2.0 nm,小溝,大溝,三B-DNA的結構,左手螺旋Z-DNA(a)和右手螺旋B-DNA(b)的測試圖,DNA雙螺旋結
7、構的要點,(1) DNA分子由兩條多聚脫氧核糖核苷酸鏈(簡稱DNA單鏈)組成。兩條鏈沿著同一根軸平行盤繞，形成右手雙螺旋結構。螺旋中的兩條鏈方向相反，即其中一條鏈的方向為53，而另一條鏈的方向為35。,（2）嘌呤堿和嘧啶堿基位于螺旋的內側，糖基位于螺旋的外側，堿基環(huán)平面與螺旋軸垂直。,DNA雙螺旋結構的要點,（3）螺旋橫截面的直徑約為2 nm，每條鏈相鄰兩個堿基平面之間的距離為0.34 nm，每10個核苷酸形成一個螺旋，其螺矩（即螺旋旋轉一圈）高度為3.4 nm。,（4）兩條DNA鏈相互結合以及形成雙螺旋的力是鏈間的堿基對所形成的氫鍵。 堿基的相互結合具有嚴格的配對規(guī)律，即腺嘌呤（A）與胸腺嘧
8、啶（T）結合，鳥嘌呤（G）與胞嘧啶（C）結合，這種配對關系，稱為堿基互補。 A和T之間形成兩個氫鍵，G與C之間形成三個氫鍵。 在DNA分子中，嘌呤堿基的總數與嘧啶堿基的總數相等。,DNA二級結構的多樣性,回文序列,發(fā)夾式結構,十字形結構,中心區(qū)域,DNA回文序列及幾種結構形式,DNA的雙螺旋結構的意義,該模型揭示了DNA作為遺傳物質的穩(wěn)定性特征，最有價值的是確認了堿基配對原則，這是DNA復制、轉錄和反轉錄的分子基礎，亦是遺傳信息傳遞和表達的分子基礎。,三、DNA的三級結構,在細胞內，由于DNA分子與其它分子（主要是蛋白質）的相互作用，使DNA雙螺旋進一步扭曲或再螺旋形成的高級結構. 實例：超螺
9、旋 染色體（ chromosome） 病毒（virus）,超螺旋,一個環(huán)形雙螺旋DNA分子，通過細胞內旋轉酶的作用，或在體外EB染料的作用下，可在環(huán)形分子內部引進張力。這種新產生的張力在DNA分子內部促使原子的位置重排，造成雙螺旋的再螺旋，形狀似麻花，稱為超螺旋。 如果引起的張力的方向與原先的右手螺旋方向相同，則超螺旋的方向是左手螺旋，稱為正超螺旋。正超螺旋是旋緊雙螺旋后形成的。正超螺旋為雙螺旋旋轉過度，通過分子整體的左旋來解去過度的螺旋。 反之，如果引起的張力的方向與原先的右手螺旋方向相反，則超螺旋的方向是右手螺旋，稱為負超螺旋。負超螺旋是放松雙螺旋后形成的。,DNA超螺旋結構的形成,核小體
10、盤繞及染色質示意圖,真核生物染色體DNA組裝 不同層次的結構,DNA （2 nm）,核小體鏈（ 11 nm，每個核小體200 bp）,纖絲（ 30 nm，每圈6個核小體）,突環(huán)（ 150 nm，每個突環(huán)大約75000 bp）,玫瑰花結（ 300 nm ，6個突環(huán)）,螺旋圈（ 700 nm，每圈30個玫瑰花）,染色體（ 1400 nm， 每個染色體含10個玫瑰花200 bp）,動物病毒切面模式圖,被膜（脂蛋白、碳水化合物）,衣殼（蛋白質）,核酸,突起（糖蛋白）,病毒粒,（DNA或RNA）,二、 RNA的分子結構,一、 RNA一級結構和類別 二、 tRNA 的分子結構 三、 rRNA的分子結構 四
11、、 mRNA的分子結構,一、 RNA的一級結構和類別,RNA與DNA的差異 DNA RNA 糖 脫氧核糖 核糖 堿基 AGCT AGCU 不含稀有堿基 含稀有堿基,1、RNA的一級結構,1、分子較小，一級結構為直線型多核苷酸鏈，因此，在RNA分子中，并不遵守堿基種類的數量比例關系，即分子中的嘌呤堿基總數不一定等于嘧啶堿基的總數。 2、基本單位主要是CMP、GMP、AMP和UMP四種核苷酸 3、磷酸二酯鍵，5端向3端延伸,局部為雙螺旋結構，是RNA分子通過自身回折使互補的堿基對相遇，形成氫鍵結合而成，同時形成雙螺旋。這種結構可以形象地稱為“發(fā)夾型”結構。 不能配對的區(qū)域形成突環(huán)（loop），被排
12、斥在雙螺旋之外。 RNA中的雙螺旋結構為A-DNA類型的結構。 一般來說，雙螺旋結構占RNA分子的50%。,發(fā)卡式結構 A-U, C-G配對,2、RNA的類別,信使RNA（messenger RNA，mRNA）：在蛋白質合成中起模板作用； 核糖體RNA（ribosoal RNA，rRNA）：與蛋白質結合構成核糖體（ribosome），核糖體是蛋白質合成的場所； 轉移RNA（transfor RNA，tRNA）：在蛋白質合成時起著攜帶活化氨基酸的作用。 小RNA（small nuclear RNA, snRNA），存在真核細胞中,分子量25000左右，大約由7090個核苷酸組成，沉降系數為4S左
13、右。 分子中含有較多的修飾成分，稀有堿基。 3-末端都具有CpCpAOH的結構，用于接受活化的氨基酸，也稱接受末端。 tRNA占全部RNA的16%，tRNA的生物功能是在蛋白質生物合成過程中轉運氨基酸和識別密碼子。 細胞內tRNA的種類很多，估計有50多種。每一種氨基酸都有與其相對應的一種或幾種tRNA。,二、tRNA 的結構,生物大分子在單位離心力場作用下的沉降速度稱為沉降系數。量綱為秒。一個svedberg單位，簡寫為S， 是110-13秒，8S即為810-13秒。相對分子量越大，S越大。 當一種新發(fā)現的大分子的結構、性質和功能等都處在研究階段中時，其名稱未定，為了描述方便，常用其沉降系數
14、S來表示。 蛋白質的沉降系數在1200 S之間。,沉降系數,二級結構特征： 三葉草形 四臂四環(huán),三級結構 特征： 在二級結構基礎上 進一步折疊扭曲形成倒 L型,tRNA的二級結構,tRNA的二級結構都呈” 三葉草” 形狀。 一般可將其分為五部分：包括氨基酸臂、反密碼環(huán)、二氫尿嘧啶環(huán)、TC環(huán)和可變環(huán)（額外環(huán)）。,攜帶氨基酸,辨認并結合氨基酰tRNA合成酶,識別mRNA上的密碼,識別并結合核蛋白體,氨基酸臂,二氫尿嘧啶環(huán),反密碼環(huán),可變環(huán),TC環(huán),(1) 氨基酸臂 包含有tRNA的3-末端和5-末端， 3 -末端的最后3個核苷酸殘基都是CCA。氨基酸可與其成酯，該區(qū)在蛋白質合成中起攜帶氨基酸的作用
15、。 (2)反密碼環(huán) 與氨基酸接受區(qū)相對的一般含有7個核苷酸殘基的區(qū)域，其中正中的3個核苷酸殘基稱為反密碼。 反密碼子與結合在核糖體上的mRNA中的核苷酸（密碼子）根據堿基配對原則互補成對，因此在蛋白質合成過程中，攜帶特定氨基酸的tRNA憑借自身的反密碼子識別mRNA上的密碼子，把所攜帶的氨基酸摻入到多肽鏈的一定位置上。 I次黃嘌呤核苷酸，也稱肌苷酸，常出現在反密碼子中。,（3）二氫尿嘧啶環(huán) 由812個核苷酸組成，因為含有兩個而氫尿嘧啶而得名。通過由34對堿基組成的雙螺旋區(qū)（也稱二氫尿嘧啶臂）與tRNA分子的其它部分相連。 (4)可變環(huán)（額外環(huán)） 位于反密碼區(qū)與TC區(qū)之間，不同的tRNA具有大小
16、不同的額外環(huán)，所以是tRNA分類的重要指標。,（5）TC環(huán) 該區(qū)與二氫尿嘧啶區(qū)相對， 假尿嘧啶核苷胸腺嘧啶核糖核苷環(huán)(TC)由7個核苷酸組成，通過由5對堿基組成的雙螺旋區(qū)(TC臂)與tRNA的其余部分相連。除個別例外，幾乎所有tBNA在此環(huán)中都含有TC 。 T-胸腺嘧啶核糖核苷酸 -假尿嘧啶核苷酸,tRNA的三級結構,在三葉草型二級結構的基礎上，突環(huán)上未配對的堿基由于整個分子的扭曲而配成對，目前已知的tRNA的三級結構均為倒L型。,tRNA的三級結構,倒 L 型,三、rRNA的分子結構,特征： 單鏈，螺旋化程度較tRNA低 與蛋白質組成核糖體后方能發(fā)揮其功能,5sRNA的二級結構,rRNA,動
17、物細胞核糖體rRNA有四類：5S rRNA，5.8S rRNA，18S rRNA，28S rRNA。 大腸桿菌核糖體中的rRNA有三類：5S rRNA，16S rRNA，23S rRNA。這些不同的rRNA的核苷酸排列順序是不同的，它們能與細菌染色體DNA的不同部位雜交。 rRNA約占全部RNA的80%左右。 rRNA的功能是構成核糖體的骨架。,四、mRNA的分子結構,原核生物mRNA特征： 先導區(qū)+翻譯區(qū)（多順反子）+末端序列 真核生物mRNA特征： “帽子”+單順反子+“尾巴”,順反子，是遺傳學名詞，指mRNA分子中對應于 DNA上一個完整基因的一段核苷酸序列。,多順反子，即一條mRNA鏈
18、含有指導合成幾種蛋白質分子的信息，可作為模板翻譯出幾種蛋白質。,單順反子，即一條mRNA鏈只能翻譯產生一種蛋白質。,原核細胞mRNA的結構特點,真核細胞mRNA一級結構的特點,真核細胞mRNA的3-末端有一段長達200個核苷酸左右的聚腺苷酸(poly A)，稱為 “尾結構” 。 真核細胞mRNA的5-末端有一個甲基化的鳥苷酸，稱為 “帽結構 ” 。,3 -非編碼區(qū),5 -非編碼區(qū),編碼區(qū)（單順反子）,5 帽子,3 poly A尾,5帽子：m7G-5ppp-Nm-3p,G鳥苷 N任意核苷 m在字母左側代表堿基被甲基化，右上角的數字代表甲基化的位置 m在字母右側表示核糖被甲基化,原核生物的mRNA
19、一般無poly A，但某些病毒mRNA也有3-poly A。 poly A可能有多方面功能： 與mRNA從細胞核到細胞質的轉移有關； 與mRNA的壽命有關，新合成的mRNA的poly A鏈較長，而衰老的mRNA的poly A鏈縮短。,化學結構決定物理化學性質 水解核酸的糖苷鍵、磷酸二酯鍵 酸堿性質磷酸基、堿基 紫外吸收堿基 核酸的變性、復性雙螺旋結構,第三節(jié) 核酸的性質,（一）一般性質： 分子大?。篋NA Mr 1061012或更大，RNA Mr 104105或更大 性狀： DNA為白色纖維狀固體（絮狀），而RNA為白色粉末。 溶解度：DNA和RNA均微溶于水，不溶于一般的有機溶劑，所以常用乙
20、醇做沉淀劑，使其從溶液中析出。,與蛋白質相似，核酸分子中既含有酸性基團（磷酸基）也含有堿性基團（氨基），因而核酸也具有兩性性質。 由于核酸分子中的磷酸是一個中等強度的酸，而堿性（氨基）是一個弱堿，所以核酸的等電點較低。如DNA的等電點為44.5，RNA的等電點為22.5。 RNA的等電點比DNA低的原因，是RNA分子中核糖基2-OH通過氫鍵促進了磷酸基上質子的解離，而DNA沒有這種作用。,（二）核酸的兩性性質及等電點,堿基與戊糖形成的糖苷鍵、以及磷酸酯鍵均能被酸、堿和酶水解。 酸水解 糖苷鍵比磷酸鍵更容易被水解; 嘌呤堿的糖苷鍵比嘧啶堿的糖苷鍵更容易被水解; 水解嘧啶堿需要較高的溫度. 比如：
21、DNA在pH1.6于37 對水透析，可完全除去嘌呤堿；在pH 2.8于100 加熱1 h也可完全除去嘌呤。,（三）核酸的水解,堿水解,RNA的磷酸酯鍵易被堿水解成核苷酸，DNA的磷酸酯鍵則不易被堿水解。 這是因為RNA核糖上2-OH在堿的作用下形成的磷酸三酯極不穩(wěn)定，容易水解。 DNA的脫氧核糖沒有2-OH，不能形成堿水解的中間產物，因而對堿有一定的抗性。 用于水解RNA的堿有KOH，NaOH等。,堿水解RNA：堿濃度一般為0.31 mol/L，在室溫至37 下水解1824 h，產物為2-和3-單核苷酸。 堿水解DNA：1 mol/L NaOH于100 加熱4 h，可得到小分子的寡聚脫氧核苷酸
22、。,酶水解,磷酸二酯酶：非特異性水解磷酸二酯鍵 核酸酶：專一水解核酸的磷酸二酯鍵 分類 1）按底物專一性：核糖核酸酶（RNase），脫氧核糖核酸酶（DNase） 2）按作用方式：內切酶，外切酶 核酸外切酶的作用方式是從多聚核苷酸鏈的一端（3-端或5-端）開始，逐個水解切除核苷酸。 核酸內切酶的作用方式剛好和外切酶相反，它從多聚核苷酸鏈中間開始，在某個位點切斷磷酸二酯鍵。 3）其它：限制性核酸內切酶，雙鏈酶，單鏈酶 在分子生物學研究中最有應用價值的是限制性核酸內切酶。這種酶可以特異性的水解核酸中某些特定堿基順序部位。,(四)核酸的紫外吸收,在核酸分子中，由于嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵體系，因而具
23、有獨特的紫外線吸收光譜（240290 nm），一般在260 nm左右有最大吸收峰。 不同堿基的紫外吸收特性不同；同一種堿基在不同pH、不同波長下的紫外吸收也不同，據此，可以作為核酸及其組份定性和定量測定的依據。,紫外吸收是實驗室最常用的定量測定DNA或RNA的方法。 鑒定DNA和RNA的純度： 待測樣品的純度可用它們的A260/A280來判斷。純DNA的A260/A280為 1.8，而純RNA的A260/A280為 2.0。 樣品中若含有蛋白質-? 則：A260/A280值要下降，因為蛋白質的最大吸收在A280。,核酸溶液的紫外吸收還可以摩爾磷的吸光度來表示，摩爾磷相當于摩爾核苷酸。 單鏈核酸
24、的摩爾磷吸收值高于雙鏈核酸的摩爾磷吸收值，這是因為雙螺旋結構使堿基對的電子云發(fā)生重疊，因而減少了對紫外光的吸收。 所以，核酸發(fā)生變性時，核酸的摩爾磷吸收值升高約25%，這種現象成為增色效應；復性后，摩爾磷值又降低，這種現象叫做減色效應。,（五）核酸的變性、復性與雜交,(1) 核酸的變性 核酸的變性是指核酸雙螺旋區(qū)的多聚核苷酸鏈間的氫鍵斷裂，變成單鏈結構的過程。 變性核酸將失去其部分或全部的生物活性。核酸的變性并不涉及磷酸二酯鍵的斷裂，所以它的一級結構(堿基順序)保持不變。 能夠引起核酸變性的因素很多。溫度升高、酸堿度改變pH（11.3或5.0）；甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的變性。,DNA變
25、性的特征,DNA的變性過程是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)間內完成。因此，通常把加熱變性使DNA的雙螺旋結構失去一半時的溫度稱為融點，用Tm表示。 一般DNA的Tm值在70-85 C之間。DNA的Tm值與分子中的G和C的含量有關。 G和C的含量高，Tm值高。因而測定Tm值，可反映DNA分子中G, C含量，可通過經驗公式計算： （G + C)%=(Tm - 69.3) 2.44,淬火：如當溫度高于Tm約5 時，DNA的兩條鏈由于布朗運動而完全分開。如果此熱溶液迅速冷卻，則兩條鏈繼續(xù)保持分開，稱為淬火。 退火：若將此溶液緩慢冷卻，到適當的低溫，則兩條鏈可發(fā)生特異性的重新組合而恢復到原來的雙螺旋結構，稱
26、退火。 變性的因素：加熱、酸堿、乙醇、丙酮等有機溶劑、尿素、酰胺等試劑。,當DNA的稀鹽溶液加熱到80-100 時，雙螺旋結構即發(fā)生解體，兩條鏈彼此分開，形成無規(guī)線團。 DNA變性后，它的一系列性質也隨之發(fā)生變化，如紫外吸收(260 nm)值升高, 粘度降低等。,粘度 天然DNA分子的長度可達到幾個厘米，而分子的直徑只有2 nm，所以即使是極稀的DNA溶液，也有極大的粘度。RNA的粘度要小得多，當核酸溶液因受熱或在其他因素作用下發(fā)生螺旋線團轉變時，則粘度降低。,(2) 核酸的復性,變性DNA在適當的條件下，兩條彼此分開的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結構，這一過程稱為復性。DNA復性后，一系列性質
27、將得到恢復，但是生物活性一般只能得到部分的恢復。 DNA復性的程度、速率與復性過程的條件有關。 將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時，DNA不可能復性。但是將變性的DNA緩慢冷卻時，可以復性。分子量越大復性越難。濃度越大，復性越容易。此外，DNA的復性也與它本身的組成和結構有關。,(3) 核酸的雜交,熱變性的DNA單鏈，在復性時并不一定與同源DNA互補鏈形成雙螺旋結構，它也可以與在某些區(qū)域有互補序列的異源DNA單鏈形成雙螺旋結構。這樣形成的新分子稱為雜交DNA分子。 DNA單鏈與互補的RNA鏈之間也可以發(fā)生雜交。 核酸的雜交在分子生物學和遺傳學的研究中具有重要意義。,核酸的雜交,一、DNA的復制與
28、生物遺傳信息的保持 DNA復制的要點是： 1）在復制開始階段，DNA的雙螺旋拆分成兩條單鏈。,2）以DNA單鏈為模板，按照堿基互補配對的原則, 在DNA聚合酶催化下，合成與模板DNA完全互補的新鏈，并形成一個新的DNA分子。,3) 通過DNA復制形成的新DNA分子, 與原來的DNA分子完全相同。 經過一個 復制周期后，子代DNA分子的兩條鏈中，一條來自親代DNA分子，另一條是新合成的，所以又稱為半保留復制。,核酸的研究方法,核酸的分離和提純 超速離心 瓊脂糖凝膠電泳,核酸的分離、提純,DNA的分離 RNA的分離 制備DNA需要注意的問題：防止核酸的降解和變性。 制備條件：溫和，低溫（04 ），
29、防止過酸、過堿、避免劇烈攪拌；防止核酸酶的作用（加入十二烷基硫酸鈉SDS、乙二胺四乙酸EDTA、檸檬酸鈉等抑制核酸酶活性）,DNA的分離,原理：真核生物中的染色體DNA與堿性蛋白（組蛋白）結合成核蛋白（DNP）存在細胞核中。DNP溶于水和濃鹽溶液（如1 mol/L NaCl），但是不溶于生理鹽水(0.14 mol/L NaCl)。 DNA分離方法： 1.破碎細胞后，用濃鹽溶液提取。 2.用水稀釋至0.14 mol/L 鹽溶液，使DNP沉淀出來。 3. 除去蛋白質 用氯仿-戊醇溶液抽提：將DNP溶于高氯酸鈉溶液，再與等體積的氯仿-戊醇溶液混合，振蕩，離心，溶液分為三層，上層為核酸，中層為類脂，下
30、層為蛋白質。 如此反復操作多次除凈蛋白。 4. 除去少量RNA：用核糖核酸酶溶液50 g/ml于37 保溫30 min。 5. 將含DNA的水相合并，用7090%的乙醇洗去鹽分。 保存：將提純的DNA溶于緩沖液，于4 保存。,RNA的分離,RNA比DNA更不穩(wěn)定，而且RNase又無處不在。 注意： 1）所有用于制備RNA的玻璃器皿都要經過高溫焙烤，塑料用具經過高壓滅菌，不能滅菌的用具要用0.1%焦炭酸二乙酯（DEPC）處理，再煮沸以除凈DEPC。DEPC能破壞 RNase。 2）在破碎細胞同時加入強變性劑（如胍鹽）使RNase失活。 3）在RNA反應體系中加入RNase抑制劑。,tRNA：占1
31、5%，pH 5沉淀 mRNA：占5%，很不穩(wěn)定，提取條件嚴格 rRNA：占80%，一般提取的RNA主要是rRNA。 提取方法： 1）稀鹽溶液提取 細胞破碎，用0.14 mol/L NaCl反復抽提，得到核糖核蛋白提取液，再進一步分離蛋白、多糖等，得RNA。 2）苯酚水溶液提取 細胞破碎，加入等體積90%苯酚水溶液，振蕩，DNA和蛋白質沉淀在苯酚層，RNA和多糖溶于水層。,核酸的超速離心,超速離心機的轉速高達2.51048104 r/min，最大離心力達5105 g甚至更高。 常速：8000 r/min以內，1104 g以下 高速： 11042.5104 r/min， 1104 1105 g,等
32、密度離心-氯化銫,目的：分離的不同顆粒的密度范圍在離心介質的密度梯度范圍內。 在離心力作用下，不同浮力密度的物質顆?；蛳蛳鲁两?，或向上漂浮，一直移動到與他們各自浮力密度恰好相等的位置，形成區(qū)帶。這種方法稱為等密度梯度離心，或稱為平衡等密度離心。 常用的離心介質是銫鹽，如氯化銫、硫酸銫、溴化銫等。,離心操作時，將一定濃度的介質溶液與樣品混合均勻，在選用的離心力的作用下，經過足夠時間的離心分離，銫鹽在離心場中沉降，自動形成密度梯度，樣品中不同浮力密度的顆粒在其各自的等密度點位置上形成區(qū)帶。,瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 Agarose Gel Electrophoresis,應 用,1. 適用于大分
33、子的核酸、核蛋白等的分離、鑒定及純化 2. 臨床生化檢驗中常用于LDH、CK等同工酶的分離與檢測 3. 為不同類型的高脂蛋白血癥、冠心病等提供生化指標,DNA序列分析,化學法測序 雙脫氧法測序,化學法測序,將待測DNA片段的一端用32P標記，將標記的DNA分成4份。 每份樣品用一種堿基特異性試劑處理，它能特異性地破壞DNA中某種特定的堿基，使鏈在該種堿基處斷裂，產生一系列標記片段。 經凝膠電泳后，再進行放射自顯影，可測出DNA序列。放射自顯影條帶的位置由標記末端到拆開的堿基之間的距離決定。,雙脫氧法測序,該法是利用了2, 3-雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）可特異性的終止DNA鏈延長這一特點。 在DNA聚合酶不斷形成二酯鍵使DNA延伸的過程中，當ddNTP摻入其中，則鏈的延長終止。,
食品生物化學第4章核酸.ppt
