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1、,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,*,第十四章,基因重組與基因工程,基因重組,：,genomic,recombination,重組,DNA,：recombinant DNA,第一節(jié)、自然界的基因重組,轉化：,transformation,整合：,integration,轉導：,transduction,轉位：,transposition,轉化,轉化,：由外來,DNA,引起生物類型改變的過程稱為轉化。,細菌的轉化,轉化,病毒癌基因感染宿主細胞后，可整合到宿主染色體上，從而使宿主細胞癌變。,轉染：,噬菌體感染宿主菌后，核酸進入菌體內的過程。,細胞
2、的轉化,整合,整合：,噬菌體感染大腸桿菌的第一步,噬菌體粘附于細胞壁上，將自身的,DNA,注入菌體中。此,DNA,可,與細菌染色體重組，成為細菌染色體的一部分。,溶原菌：,整合了噬菌體基因組的細菌。,裂解：,噬菌體感染大腸桿菌的第二步,DNA,利用菌體的酶系統(tǒng)，復制自身及外殼蛋白，組裝成大量新 噬菌體，并將細菌漲破。,整合,溶原,和,裂解,可以相互轉變。,轉導,溶原菌中,DNA,可以原樣地切離出來，也可以,把鄰近的宿主,DNA,在切離時帶走一部分。后者稱,轉導,。,帶有宿主,DNA,的噬菌體稱,轉導噬菌體,。,來源于宿主的基因稱,轉導基因,。,轉位,轉位,：一個或一組基因從一處轉到基因組的另一
3、個位置。,這些游動的基因稱為,轉位子(,transposon,),。,轉位,第二節(jié)、基因工程,基因工程,：是用分離純化或人工合成的,DNA,在體外與載體,DNA,結合，成為重組,DNA，,用以轉化宿主，篩選出能表達重組,DNA,的活細胞，加以純化、傳代、擴增，成為,克隆,。也叫,基因克隆,或,重組,DNA,技術,。,分子水平上操作，細胞水平上表達。,賦予重組,DNA,以新的生命力。,基因工程,腫瘤細胞的轉移與細胞表面的糖鏈類型有關，而后者又與糖基轉移酶的表達相關。,已經(jīng)證實,GnT,-,與轉移有關。,轉入,GnT,-,基因,肝癌細胞株,SMMC7721,觀察其遷移、侵襲、粘附等生物學行為,轉入
4、反義,GnT,-,基因,轉移,轉移,基因克隆,分,切,接,轉,篩,載體和目的基因,載體,：,vector,在宿主細胞內可獨立復制的完整,DNA,分子。但必須利用宿主的酶系統(tǒng)，才能有進一步的基因表達能力。,常用的載體有：質粒、,噬菌體、,M13,噬菌體 逆轉錄病毒,DNA、,昆蟲病毒,DNA,載體與宿主共培育可大量生成，經(jīng)純化后可用于基因工程。,質粒,質粒,：,plasmid,環(huán)形雙鏈,DNA，,大小約為數(shù)千堿基對，存在于大多數(shù)細菌的胞質中。,拷貝數(shù),：每個細菌能容納的質粒數(shù)目。,質粒的性質：,易于從一個細菌轉移入另一個細菌。,有兩三個抗藥性基因。,有一個限制性內切酶切口。,質粒,pBR322：
5、,常用的質粒,噬菌體載體,噬菌體、,M13,噬菌體,易于感染大腸桿菌,噬菌體,DNA,比質粒大，對限制性內切酶有不止一個切口，需經(jīng)過改造。,一個切口：插入型載體。,二個切口：置換型載體。,噬菌體載體,目的基因的來源,直接從染色體,DNA,中分離：原核生物,人工合成：簡單的多肽,從,mRNA,合成,cDNA,：,真核生物,基因文庫：,(,gene library）,G,文庫：用基因組的全部,DNA,制備。,c,文庫：用細胞的全部,mRNA,制備出全套,cDNA,后建庫。,從,mRNA,合成,cDNA,限制性內切酶的應用,限制性內切酶可辨認46個核苷酸：回文結構,回文結構,：,palindrome
6、 DNA,雙鏈具有方向相反順序一致的結構。,平端：,blunt end,在同一水平上切斷兩條鏈。(鈍型末端),粘性末端：,sticky end,堿基序列被酶以錯開幾個核苷酸的形式切開。,限制性內切酶的應用,Alu,I .AGCT.AG CT.,平端,.,TCGA.TC GA.,BamH,I GGATCC .G GATTC,粘性,.,CCTAGG,CCTAAG,G,末端,限制性內切酶的應用,切載體,切目的基因,限制性內切酶,相同粘性末端,兩者相連,要點：避免切斷目的基因,載體和目的基因的連接,人工連接器,：,linker,人工合成的寡核苷酸，安置有限制性內切酶的識別序列。,DNA,連接酶,：可用
7、于連接堿基互補的二段核酸鏈。,連接方式：,粘端連接方式,尾接法,粘端連接,尾接法,重組體的轉化,基因的轉移：重組體進入宿主細胞的過程，已開發(fā)了很多方法。,化學法：,CaCl,2,轉移法、堿金屬離子轉移法,物理法：顯微注射法、基因槍法、電穿孔法,生物學法：逆轉錄病毒載體、腺病毒載體,重組體的轉化,轉化：重組載體導入宿主后，利用宿主的酶系統(tǒng)表達的過程。即改變宿主性狀的過程。,基因工程的表達體系的發(fā)展,DNA,重組體的篩選與鑒定,根據(jù)重組載體的表型進行篩選：如質粒的抗藥性、營養(yǎng)素的依賴型,DNA,限制酶切圖譜分析：提取經(jīng)粗選后的宿主,DNA，,用限制性內切酶切割后與原來載體比較。,利用核酸雜交和放射
8、自顯影進行鑒定：用目的基因作探針監(jiān)測宿主,DNA,是否重組體。,DNA,重組體的篩選與鑒定,滅活法篩選重組體。,提取轉化細胞,DNA,限制性內切酶,瓊脂糖凝膠電泳,與原來載體及重組體比較,DNA,重組體的篩選與鑒定,DNA,重組體的篩選與鑒定,菌落,硝酸纖維素濾膜,探針,X,線底片,顯影,平板,基因工程策略,第三節(jié)、基因工程的應用,生命科學研究趨勢,基因診斷和基因治療,基因工程產(chǎn)品的開發(fā)和應用,生命科學研究趨勢,基因的結構與功能研究,基因表達的調控,各種生物大分子之間的識別及結合,了解生命的奧秘,基因診斷和基因治療,基因工程產(chǎn)品的開發(fā)和應用,基因工程疫苗：安全廉價 乙肝疫苗、甲肝疫苗 巨細胞病毒、流行性出血熱、輪狀病毒、,基因工程生產(chǎn)激素類：胰島素、生長激素,細胞因子：生長因子、腫瘤壞死因子、造血因子、干擾素,第五節(jié)、聚合酶鏈反應,聚合酶鏈反應：,PCR,polymerase,chain reaction,耐熱細菌：,DNA,聚合酶能耐高溫，在7080有很高的催化力。,原理：以目的,DNA,為模板，快速合成大量的,DNA，,用于檢測、制備、研究。,第五節(jié)、聚合酶鏈反應,變性：,95、15,s,引物粘合：,55、30,s,引物延伸：,72、1.5,m,
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