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1、,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),*,第十四章,基因重組與基因工程,基因重組,：,genomic,recombination,重組,DNA,：recombinant DNA,第一節(jié)、自然界的基因重組,轉(zhuǎn)化：,transformation,整合：,integration,轉(zhuǎn)導(dǎo)：,transduction,轉(zhuǎn)位：,transposition,轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化,：由外來(lái),DNA,引起生物類(lèi)型改變的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)化。,細(xì)菌的轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化,病毒癌基因感染宿主細(xì)胞后，可整合到宿主染色體上，從而使宿主細(xì)胞癌變。,轉(zhuǎn)染：,噬菌體感染宿主菌后，核酸進(jìn)入菌體內(nèi)的過(guò)程。,細(xì)胞
2、的轉(zhuǎn)化,整合,整合：,噬菌體感染大腸桿菌的第一步,噬菌體粘附于細(xì)胞壁上，將自身的,DNA,注入菌體中。此,DNA,可,與細(xì)菌染色體重組，成為細(xì)菌染色體的一部分。,溶原菌：,整合了噬菌體基因組的細(xì)菌。,裂解：,噬菌體感染大腸桿菌的第二步,DNA,利用菌體的酶系統(tǒng)，復(fù)制自身及外殼蛋白，組裝成大量新 噬菌體，并將細(xì)菌漲破。,整合,溶原,和,裂解,可以相互轉(zhuǎn)變。,轉(zhuǎn)導(dǎo),溶原菌中,DNA,可以原樣地切離出來(lái)，也可以,把鄰近的宿主,DNA,在切離時(shí)帶走一部分。后者稱,轉(zhuǎn)導(dǎo),。,帶有宿主,DNA,的噬菌體稱,轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體,。,來(lái)源于宿主的基因稱,轉(zhuǎn)導(dǎo)基因,。,轉(zhuǎn)位,轉(zhuǎn)位,：一個(gè)或一組基因從一處轉(zhuǎn)到基因組的另一
3、個(gè)位置。,這些游動(dòng)的基因稱為,轉(zhuǎn)位子(,transposon,),。,轉(zhuǎn)位,第二節(jié)、基因工程,基因工程,：是用分離純化或人工合成的,DNA,在體外與載體,DNA,結(jié)合，成為重組,DNA，,用以轉(zhuǎn)化宿主，篩選出能表達(dá)重組,DNA,的活細(xì)胞，加以純化、傳代、擴(kuò)增，成為,克隆,。也叫,基因克隆,或,重組,DNA,技術(shù),。,分子水平上操作，細(xì)胞水平上表達(dá)。,賦予重組,DNA,以新的生命力。,基因工程,腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與細(xì)胞表面的糖鏈類(lèi)型有關(guān)，而后者又與糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)相關(guān)。,已經(jīng)證實(shí),GnT,-,與轉(zhuǎn)移有關(guān)。,轉(zhuǎn)入,GnT,-,基因,肝癌細(xì)胞株,SMMC7721,觀察其遷移、侵襲、粘附等生物學(xué)行為,轉(zhuǎn)入
4、反義,GnT,-,基因,轉(zhuǎn)移,轉(zhuǎn)移,基因克隆,分,切,接,轉(zhuǎn),篩,載體和目的基因,載體,：,vector,在宿主細(xì)胞內(nèi)可獨(dú)立復(fù)制的完整,DNA,分子。但必須利用宿主的酶系統(tǒng)，才能有進(jìn)一步的基因表達(dá)能力。,常用的載體有：質(zhì)粒、,噬菌體、,M13,噬菌體 逆轉(zhuǎn)錄病毒,DNA、,昆蟲(chóng)病毒,DNA,載體與宿主共培育可大量生成，經(jīng)純化后可用于基因工程。,質(zhì)粒,質(zhì)粒,：,plasmid,環(huán)形雙鏈,DNA，,大小約為數(shù)千堿基對(duì)，存在于大多數(shù)細(xì)菌的胞質(zhì)中。,拷貝數(shù),：每個(gè)細(xì)菌能容納的質(zhì)粒數(shù)目。,質(zhì)粒的性質(zhì)：,易于從一個(gè)細(xì)菌轉(zhuǎn)移入另一個(gè)細(xì)菌。,有兩三個(gè)抗藥性基因。,有一個(gè)限制性內(nèi)切酶切口。,質(zhì)粒,pBR322：
5、,常用的質(zhì)粒,噬菌體載體,噬菌體、,M13,噬菌體,易于感染大腸桿菌,噬菌體,DNA,比質(zhì)粒大，對(duì)限制性內(nèi)切酶有不止一個(gè)切口，需經(jīng)過(guò)改造。,一個(gè)切口：插入型載體。,二個(gè)切口：置換型載體。,噬菌體載體,目的基因的來(lái)源,直接從染色體,DNA,中分離：原核生物,人工合成：簡(jiǎn)單的多肽,從,mRNA,合成,cDNA,：,真核生物,基因文庫(kù)：,(,gene library）,G,文庫(kù)：用基因組的全部,DNA,制備。,c,文庫(kù)：用細(xì)胞的全部,mRNA,制備出全套,cDNA,后建庫(kù)。,從,mRNA,合成,cDNA,限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用,限制性內(nèi)切酶可辨認(rèn)46個(gè)核苷酸：回文結(jié)構(gòu),回文結(jié)構(gòu),：,palindrome
6、 DNA,雙鏈具有方向相反順序一致的結(jié)構(gòu)。,平端：,blunt end,在同一水平上切斷兩條鏈。(鈍型末端),粘性末端：,sticky end,堿基序列被酶以錯(cuò)開(kāi)幾個(gè)核苷酸的形式切開(kāi)。,限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用,Alu,I .AGCT.AG CT.,平端,.,TCGA.TC GA.,BamH,I GGATCC .G GATTC,粘性,.,CCTAGG,CCTAAG,G,末端,限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用,切載體,切目的基因,限制性內(nèi)切酶,相同粘性末端,兩者相連,要點(diǎn)：避免切斷目的基因,載體和目的基因的連接,人工連接器,：,linker,人工合成的寡核苷酸，安置有限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列。,DNA,連接酶,：可用
7、于連接堿基互補(bǔ)的二段核酸鏈。,連接方式：,粘端連接方式,尾接法,粘端連接,尾接法,重組體的轉(zhuǎn)化,基因的轉(zhuǎn)移：重組體進(jìn)入宿主細(xì)胞的過(guò)程，已開(kāi)發(fā)了很多方法。,化學(xué)法：,CaCl,2,轉(zhuǎn)移法、堿金屬離子轉(zhuǎn)移法,物理法：顯微注射法、基因槍法、電穿孔法,生物學(xué)法：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體,重組體的轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化：重組載體導(dǎo)入宿主后，利用宿主的酶系統(tǒng)表達(dá)的過(guò)程。即改變宿主性狀的過(guò)程。,基因工程的表達(dá)體系的發(fā)展,DNA,重組體的篩選與鑒定,根據(jù)重組載體的表型進(jìn)行篩選：如質(zhì)粒的抗藥性、營(yíng)養(yǎng)素的依賴型,DNA,限制酶切圖譜分析：提取經(jīng)粗選后的宿主,DNA，,用限制性內(nèi)切酶切割后與原來(lái)載體比較。,利用核酸雜交和放射
8、自顯影進(jìn)行鑒定：用目的基因作探針監(jiān)測(cè)宿主,DNA,是否重組體。,DNA,重組體的篩選與鑒定,滅活法篩選重組體。,提取轉(zhuǎn)化細(xì)胞,DNA,限制性內(nèi)切酶,瓊脂糖凝膠電泳,與原來(lái)載體及重組體比較,DNA,重組體的篩選與鑒定,DNA,重組體的篩選與鑒定,菌落,硝酸纖維素濾膜,探針,X,線底片,顯影,平板,基因工程策略,第三節(jié)、基因工程的應(yīng)用,生命科學(xué)研究趨勢(shì),基因診斷和基因治療,基因工程產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用,生命科學(xué)研究趨勢(shì),基因的結(jié)構(gòu)與功能研究,基因表達(dá)的調(diào)控,各種生物大分子之間的識(shí)別及結(jié)合,了解生命的奧秘,基因診斷和基因治療,基因工程產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用,基因工程疫苗：安全廉價(jià) 乙肝疫苗、甲肝疫苗 巨細(xì)胞病毒、流行性出血熱、輪狀病毒、,基因工程生產(chǎn)激素類(lèi)：胰島素、生長(zhǎng)激素,細(xì)胞因子：生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子、造血因子、干擾素,第五節(jié)、聚合酶鏈反應(yīng),聚合酶鏈反應(yīng)：,PCR,polymerase,chain reaction,耐熱細(xì)菌：,DNA,聚合酶能耐高溫，在7080有很高的催化力。,原理：以目的,DNA,為模板，快速合成大量的,DNA，,用于檢測(cè)、制備、研究。,第五節(jié)、聚合酶鏈反應(yīng),變性：,95、15,s,引物粘合：,55、30,s,引物延伸：,72、1.5,m,
基因重組與基因工程課件
