三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用

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1、 三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的研究與應(yīng)用 【摘要】 三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是在二維細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷幕A(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的簡(jiǎn)單、有效的細(xì)胞培養(yǎng)方式。利用三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可以更好的模擬體內(nèi)微環(huán)境，為相關(guān)研究領(lǐng)域提供新的手段。目前，三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在組織工程、腫瘤學(xué)、再生醫(yī)學(xué)和干細(xì)胞生物學(xué)等研究領(lǐng)域均有應(yīng)用。該文就近年來(lái)三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用進(jìn)行綜述。 【關(guān)鍵詞】單層細(xì)胞培養(yǎng);三維細(xì)胞培養(yǎng);人工脈管 自Willhelm Roux于1885年從雞胚中分離細(xì)胞首次建立體外細(xì)胞培養(yǎng)，單層細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)己有百余年的歷史。一個(gè)多世紀(jì)以來(lái)，單層細(xì)胞培養(yǎng)有了蓬勃的發(fā)展，特別是在制藥或者疫苗合成等產(chǎn)業(yè)化

2、領(lǐng)域，通過(guò)細(xì)胞的快速分裂，從而高效率地制造產(chǎn)品。但在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，對(duì)于細(xì)胞的體外培養(yǎng)，關(guān)注的不僅僅是它們的分裂生長(zhǎng)，而更為重要的是它們經(jīng)過(guò)傳代后能否維持體內(nèi)的性狀。在很多情況下，單層細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)所取到的研究結(jié)果和體內(nèi)的情況不符合，因?yàn)榧?xì)胞在體外改變的環(huán)境下增生，逐漸喪失了原有的性狀。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)完全在體內(nèi)講行,但由干體內(nèi)的名種因素制約以及體內(nèi)和外界環(huán)境相互影響而變得復(fù)雜化，難以研究單一過(guò)程。另外，我們?cè)趧?dòng)物身上所觀(guān)察到的結(jié)果，往往是最終呈現(xiàn)的表現(xiàn)，而非研究者最為關(guān)心的中間過(guò)程。顯然，如何填補(bǔ)單層細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的鴻溝，一直是生命科學(xué)家思索的問(wèn)題。尤其是在發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域，迫切需要建立一套細(xì)

3、胞培養(yǎng)技術(shù)，既能生長(zhǎng)傳代，還能最大程度地維持體內(nèi)性狀，并分化產(chǎn)生新的組織結(jié)構(gòu)，以便全面研究發(fā)育過(guò)程。隨著組織工程的新興發(fā)展，三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)就應(yīng)運(yùn)而生了. 1什么是三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 體外細(xì)胞培養(yǎng)的一個(gè)重要原則是需模擬體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境，該模擬系統(tǒng)中最重要的核心因素是細(xì)胞與培養(yǎng)環(huán)境之間的相互作用。不同于傳統(tǒng)的二維化單層細(xì)胞培養(yǎng)，三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)(TDCC)是指將具有三維結(jié)構(gòu)不同材料的載體與各種不同種類(lèi)的細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)，使細(xì)胞能夠在載體的三維立體空間結(jié)構(gòu)中遷移、生長(zhǎng)，構(gòu)成三維的細(xì)胞載體復(fù)合物。三維細(xì)胞培養(yǎng)是將細(xì)胞培植在一定的細(xì)胞外基質(zhì)中，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白充當(dāng)生長(zhǎng)支架，使得細(xì)胞能夠分化

4、產(chǎn)生一定的三維組織特異性結(jié)構(gòu)，所創(chuàng)建的細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境，則最大程度地模擬體內(nèi)環(huán)境.TDCC作為體外無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)及單層細(xì)胞系統(tǒng)的研究與組織器官及整體研究的橋梁，顯示了它既能保留體內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境的物質(zhì)及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，又能展現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的直觀(guān)性及條件可控性的優(yōu)勢(shì)。近幾年三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在組織形成、血管發(fā)育和器官再造等發(fā)育生物學(xué)的分支領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用;同時(shí)在篩選新藥的療效分析和毒理實(shí)驗(yàn)方面，利用三維培養(yǎng)獲得了和二維單層培養(yǎng)完全不同的結(jié)果，引起了藥物學(xué)家的極大興趣。 2三維細(xì)胞培養(yǎng)支架材料 現(xiàn)有的第1代三維培養(yǎng)系統(tǒng)運(yùn)用人工合成的生物高分子微纖維支架，比如聚乳酸輕基乙酸、殼多糖等，從而模擬三維微型生活環(huán)

5、境，自三維培養(yǎng)系統(tǒng)問(wèn)世以來(lái)就投入實(shí)際運(yùn)用。但合成高分子的降解產(chǎn)物可能危害細(xì)胞生長(zhǎng)。后來(lái)主要以更接近體內(nèi)的ECM如膠原蛋白作為生長(zhǎng)支架，并且多用含有血清的培養(yǎng)基孵育細(xì)胞，由于ECM和血清中包含大量未鑒定組分，尤其是目前實(shí)驗(yàn)室大量運(yùn)用的ECM是商業(yè)上所獲得的Matrigel，Matrigel是從小鼠腫瘤組織中提取的抽提物，這為三維培養(yǎng)介導(dǎo)的針對(duì)人體的干細(xì)胞臨床治療帶來(lái)了風(fēng)險(xiǎn)。最近，作者所在的研究組在世界上首創(chuàng)植入人體后無(wú)任何副作用并能被降解的聚脂羊毛作為“人工脈 管”代替ECM生長(zhǎng)支架，且運(yùn)用完全不含血清的DMEM化學(xué)培養(yǎng)基培植干細(xì)胞，從而建立了完全可控制的生長(zhǎng)環(huán)境。這種第2代三維培養(yǎng)技術(shù)，排除

6、了Matrigel和血清(由于未經(jīng)過(guò)徹底檢測(cè)而可能污染prion)帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)因素，為干細(xì)胞臨床治療奠定了安全前提。人工脈管模擬體內(nèi)環(huán)境，由細(xì)小的纖維、間隙和孔洞組成，氧氣、激素和營(yíng)養(yǎng)成分得以通過(guò)，而廢物 可以從里面過(guò)濾出來(lái)。所創(chuàng)建的這種和ECM有相同功用的新型三維“腳手架”，使干細(xì)胞能夠在上面生長(zhǎng)、繁殖，在加入特定的形態(tài)發(fā)生素或生長(zhǎng)因子后，還使干細(xì)胞定向分化。利用我們所創(chuàng)建的這種新穎的三維培養(yǎng)系統(tǒng)培植兔腎干細(xì)胞，在精確可控制的生長(zhǎng)環(huán)境下，加入鹽皮質(zhì)激素醛固酮后發(fā)現(xiàn)能成功地分化有功能作用的腎小管，其分化的結(jié)構(gòu)能夠維持4周以上而不崩解。這些獨(dú)創(chuàng)性工作，首次發(fā)現(xiàn)醛固酮能誘導(dǎo)腎小管的發(fā)育，不僅在腎的

7、發(fā)育生物學(xué)基礎(chǔ)研究，而且在組織工程領(lǐng)域均作出了獨(dú)特貢獻(xiàn)。 3三維細(xì)胞培養(yǎng)的運(yùn)用 3.1腫瘤生物學(xué) 三維細(xì)胞培養(yǎng)己被廣泛運(yùn)用到腫瘤學(xué)研究，在腫瘤的實(shí)驗(yàn)性治療、腫瘤的侵襲性、轉(zhuǎn)移和中心壞死的機(jī)制、腫瘤的血管形成和營(yíng)養(yǎng)供給、體內(nèi)基因表達(dá)的模擬等方面發(fā)揮了不可替代的作用。人們觀(guān)察到，腫瘤細(xì)胞不僅能夠在普通培養(yǎng)皿上形成單層，還能通過(guò)胞間信息傳遞離開(kāi)基底面，而向空間發(fā)展成三維組織。因此，腫瘤學(xué)家專(zhuān)門(mén)建立了一套回旋三維培養(yǎng)技術(shù)，以研究在沒(méi)有血管提供營(yíng)養(yǎng)的情況下，能最大程度產(chǎn)生多少細(xì)胞聚集體而又不發(fā)生壞死現(xiàn)象。并將腫瘤細(xì)胞和來(lái)自前列腺或口腔豁膜的上皮細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，觀(guān)察兩種不同的細(xì)胞類(lèi)型是否融合或是不相

8、關(guān)地各自生長(zhǎng)。另外，利用三維培養(yǎng)還可以有效地測(cè)試藥物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和向鄰近組織轉(zhuǎn)移的抑制效果。在很多情況下，腫瘤不是由單一細(xì)胞類(lèi)型而是由多種不同類(lèi)型組成的異原化類(lèi)群。為了研究周?chē)徑慕】到M織如何受到異原化腫瘤細(xì)胞增生行為的影響，常將成纖維細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和各種上皮細(xì)胞加入到腫瘤組織中，觀(guān)察腫瘤細(xì)胞的侵入和正常細(xì)胞生長(zhǎng)行為的改變。 3.2軟骨和骨組織 成熟的軟骨細(xì)胞和干細(xì)胞被廣泛用于三維細(xì)胞培養(yǎng)，以再生損傷的軟骨、骨、韌帶、肌鍵和膝關(guān)節(jié)半月板。在培養(yǎng)系統(tǒng)中常加入一些生長(zhǎng)因子，以刺激分化，產(chǎn)生組織。Spitzer將兔造骨前體細(xì)胞在附有7. 5 %磷酸三鈣(alpha-TCP)的血纖維蛋白內(nèi)培養(yǎng)53

9、d，用無(wú)alpha-TCP組作對(duì)照，結(jié)果顯示這種系統(tǒng)能有利于體外骨的形。近來(lái)實(shí)驗(yàn)也揭示經(jīng)過(guò)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子處理的牛的軟骨細(xì)胞在三維支架上培養(yǎng)更有利，在細(xì)胞的數(shù)量、結(jié)構(gòu)、功能等方面都明顯優(yōu)于二維培養(yǎng)。在三維載體上培養(yǎng)骨髓細(xì)胞，能夠?yàn)榧?xì)胞生長(zhǎng)提供最適宜的環(huán)境，維持骨髓細(xì)胞長(zhǎng)期存活。目前函待解決的核心問(wèn)題是如何理解干細(xì)胞在不同生長(zhǎng)支架上的發(fā)育能力;如何獲得具備機(jī)械耐受力的細(xì)胞外基質(zhì);外植體如何和相鄰組織最佳整合;復(fù)合組織的培育問(wèn)題。關(guān)于復(fù)合組織的培育，例如為了體外構(gòu)建氣管，必須使呼吸性上皮組織，透明軟骨和平滑肌能夠和疏松結(jié)締組織共生。再比如，構(gòu)建外耳廓時(shí)僅僅獲得彈性軟骨組織是不夠的，還必須考慮皮膚

10、和而管的徘應(yīng)對(duì)茸牛書(shū)的影響。 3.3循環(huán)系統(tǒng)和心臟 除了上皮組織和軟骨組織外，其它組織都配備有大小各異的血管。如何在成熟的組織中及時(shí)產(chǎn)生血管網(wǎng)絡(luò)是組織工程的重要課題;在治療領(lǐng)域，所關(guān)心的也是如何有目的地改變血管形成，比如，使用血管發(fā)生抑制劑封鎖住血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體( VEGFR 2)從而阻止腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。一個(gè)十分有用的體外工具是用腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行三維輔培養(yǎng)，從而觀(guān)察血管發(fā)生抑制劑對(duì)腫瘤血管化的抑制效應(yīng)。還有報(bào)道利用三維培養(yǎng)研究心內(nèi)膜炎，心肌炎的病理過(guò)程。另外，用三維培養(yǎng)研究移植到體內(nèi)的非細(xì)胞形式的心臟瓣膜如何適應(yīng)周邊細(xì)胞環(huán)境。 3.4神經(jīng)干細(xì)胞 從培植單一神經(jīng)元成為多細(xì)胞聚集

11、體，到海馬體活標(biāo)本切片后測(cè)試神經(jīng)元電勢(shì)，都有使用三維培養(yǎng)的實(shí)例。另一個(gè)熱點(diǎn)是選用神經(jīng)干細(xì)胞取代Alzheiner病，Paninson病或硬化病中損傷的神經(jīng)組織。為了獲得最佳化治療，首先將神經(jīng)干細(xì)胞培植在三維培養(yǎng)系統(tǒng)中，觀(guān)察干細(xì)胞的戮附行為、在不同培植條件下的發(fā)育潛力和它們與毗鄰組織的功能整合性。 4三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展前景 三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)、分化以及細(xì)胞間相互作用機(jī)制的研究具有巨大的意義，同時(shí)將會(huì)有更多的應(yīng)用價(jià)值被發(fā)掘。在支架材料、操作方法和抗腫瘤藥物篩選及組織工程應(yīng)用等方面三維細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)都取得了一定的成就。但是三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展還面臨許多困難，如細(xì)胞在三維培養(yǎng)體系中未

12、達(dá)到最好的生長(zhǎng)狀態(tài)，與體內(nèi)的真實(shí)情況還有一定的差別幾支架材料的選擇、輔助的培養(yǎng)方式等不夠完善等。相信隨著三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與微流控、微制造、微芯片等前沿技術(shù)的融合以及相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，這些問(wèn)題將會(huì)逐一解決。三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在腫瘤學(xué)、干細(xì)胞生物學(xué)、組織形成、血管發(fā)育、器官再造等領(lǐng)域的應(yīng)用將會(huì)取得巨大的成就，是目前值得深入研究的課題。 【參考文獻(xiàn)】 [1]胡康洪,姚穎. 三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的研究與應(yīng)用[J]. 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志,2008,02:185-188. [2]滕偉,郭志坤. 細(xì)胞三維培養(yǎng)的研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述,2008,12:1767-1770. [3]Hiroshi Kik

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