三維細胞培養(yǎng)技術的發(fā)展與應用

《三維細胞培養(yǎng)技術的發(fā)展與應用》由會員分享，可在線閱讀，更多相關《三維細胞培養(yǎng)技術的發(fā)展與應用（6頁珍藏版）》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。

1、 三維細胞培養(yǎng)技術的研究與應用 【摘要】 三維細胞培養(yǎng)技術是在二維細胞培養(yǎng)和動物實驗模型的基礎上發(fā)展起來的簡單、有效的細胞培養(yǎng)方式。利用三維細胞培養(yǎng)技術可以更好的模擬體內(nèi)微環(huán)境，為相關研究領域提供新的手段。目前，三維細胞培養(yǎng)技術在組織工程、腫瘤學、再生醫(yī)學和干細胞生物學等研究領域均有應用。該文就近年來三維細胞培養(yǎng)技術的發(fā)展及應用進行綜述。 【關鍵詞】單層細胞培養(yǎng);三維細胞培養(yǎng);人工脈管 自Willhelm Roux于1885年從雞胚中分離細胞首次建立體外細胞培養(yǎng)，單層細胞培養(yǎng)技術己有百余年的歷史。一個多世紀以來，單層細胞培養(yǎng)有了蓬勃的發(fā)展，特別是在制藥或者疫苗合成等產(chǎn)業(yè)化

2、領域，通過細胞的快速分裂，從而高效率地制造產(chǎn)品。但在生命科學基礎研究領域，對于細胞的體外培養(yǎng)，關注的不僅僅是它們的分裂生長，而更為重要的是它們經(jīng)過傳代后能否維持體內(nèi)的性狀。在很多情況下，單層細胞培養(yǎng)技術所取到的研究結(jié)果和體內(nèi)的情況不符合，因為細胞在體外改變的環(huán)境下增生，逐漸喪失了原有的性狀。動物實驗完全在體內(nèi)講行,但由干體內(nèi)的名種因素制約以及體內(nèi)和外界環(huán)境相互影響而變得復雜化，難以研究單一過程。另外，我們在動物身上所觀察到的結(jié)果，往往是最終呈現(xiàn)的表現(xiàn)，而非研究者最為關心的中間過程。顯然，如何填補單層細胞培養(yǎng)和動物實驗的鴻溝，一直是生命科學家思索的問題。尤其是在發(fā)育生物學領域，迫切需要建立一套細

3、胞培養(yǎng)技術，既能生長傳代，還能最大程度地維持體內(nèi)性狀，并分化產(chǎn)生新的組織結(jié)構(gòu)，以便全面研究發(fā)育過程。隨著組織工程的新興發(fā)展，三維細胞培養(yǎng)技術就應運而生了. 1什么是三維細胞培養(yǎng)技術 體外細胞培養(yǎng)的一個重要原則是需模擬體內(nèi)細胞生長環(huán)境，該模擬系統(tǒng)中最重要的核心因素是細胞與培養(yǎng)環(huán)境之間的相互作用。不同于傳統(tǒng)的二維化單層細胞培養(yǎng)，三維細胞培養(yǎng)技術(TDCC)是指將具有三維結(jié)構(gòu)不同材料的載體與各種不同種類的細胞在體外共同培養(yǎng)，使細胞能夠在載體的三維立體空間結(jié)構(gòu)中遷移、生長，構(gòu)成三維的細胞載體復合物。三維細胞培養(yǎng)是將細胞培植在一定的細胞外基質(zhì)中，細胞外基質(zhì)(ECM)蛋白充當生長支架，使得細胞能夠分化

4、產(chǎn)生一定的三維組織特異性結(jié)構(gòu)，所創(chuàng)建的細胞生長環(huán)境，則最大程度地模擬體內(nèi)環(huán)境.TDCC作為體外無細胞系統(tǒng)及單層細胞系統(tǒng)的研究與組織器官及整體研究的橋梁，顯示了它既能保留體內(nèi)細胞微環(huán)境的物質(zhì)及結(jié)構(gòu)基礎，又能展現(xiàn)細胞培養(yǎng)的直觀性及條件可控性的優(yōu)勢。近幾年三維細胞培養(yǎng)技術在組織形成、血管發(fā)育和器官再造等發(fā)育生物學的分支領域得到了廣泛的應用;同時在篩選新藥的療效分析和毒理實驗方面，利用三維培養(yǎng)獲得了和二維單層培養(yǎng)完全不同的結(jié)果，引起了藥物學家的極大興趣。 2三維細胞培養(yǎng)支架材料 現(xiàn)有的第1代三維培養(yǎng)系統(tǒng)運用人工合成的生物高分子微纖維支架，比如聚乳酸輕基乙酸、殼多糖等，從而模擬三維微型生活環(huán)

5、境，自三維培養(yǎng)系統(tǒng)問世以來就投入實際運用。但合成高分子的降解產(chǎn)物可能危害細胞生長。后來主要以更接近體內(nèi)的ECM如膠原蛋白作為生長支架，并且多用含有血清的培養(yǎng)基孵育細胞，由于ECM和血清中包含大量未鑒定組分，尤其是目前實驗室大量運用的ECM是商業(yè)上所獲得的Matrigel，Matrigel是從小鼠腫瘤組織中提取的抽提物，這為三維培養(yǎng)介導的針對人體的干細胞臨床治療帶來了風險。最近，作者所在的研究組在世界上首創(chuàng)植入人體后無任何副作用并能被降解的聚脂羊毛作為“人工脈 管”代替ECM生長支架，且運用完全不含血清的DMEM化學培養(yǎng)基培植干細胞，從而建立了完全可控制的生長環(huán)境。這種第2代三維培養(yǎng)技術，排除

6、了Matrigel和血清(由于未經(jīng)過徹底檢測而可能污染prion)帶來的風險因素，為干細胞臨床治療奠定了安全前提。人工脈管模擬體內(nèi)環(huán)境，由細小的纖維、間隙和孔洞組成，氧氣、激素和營養(yǎng)成分得以通過，而廢物 可以從里面過濾出來。所創(chuàng)建的這種和ECM有相同功用的新型三維“腳手架”，使干細胞能夠在上面生長、繁殖，在加入特定的形態(tài)發(fā)生素或生長因子后，還使干細胞定向分化。利用我們所創(chuàng)建的這種新穎的三維培養(yǎng)系統(tǒng)培植兔腎干細胞，在精確可控制的生長環(huán)境下，加入鹽皮質(zhì)激素醛固酮后發(fā)現(xiàn)能成功地分化有功能作用的腎小管，其分化的結(jié)構(gòu)能夠維持4周以上而不崩解。這些獨創(chuàng)性工作，首次發(fā)現(xiàn)醛固酮能誘導腎小管的發(fā)育，不僅在腎的

7、發(fā)育生物學基礎研究，而且在組織工程領域均作出了獨特貢獻。 3三維細胞培養(yǎng)的運用 3.1腫瘤生物學 三維細胞培養(yǎng)己被廣泛運用到腫瘤學研究，在腫瘤的實驗性治療、腫瘤的侵襲性、轉(zhuǎn)移和中心壞死的機制、腫瘤的血管形成和營養(yǎng)供給、體內(nèi)基因表達的模擬等方面發(fā)揮了不可替代的作用。人們觀察到，腫瘤細胞不僅能夠在普通培養(yǎng)皿上形成單層，還能通過胞間信息傳遞離開基底面，而向空間發(fā)展成三維組織。因此，腫瘤學家專門建立了一套回旋三維培養(yǎng)技術，以研究在沒有血管提供營養(yǎng)的情況下，能最大程度產(chǎn)生多少細胞聚集體而又不發(fā)生壞死現(xiàn)象。并將腫瘤細胞和來自前列腺或口腔豁膜的上皮細胞進行共培養(yǎng)，觀察兩種不同的細胞類型是否融合或是不相

8、關地各自生長。另外，利用三維培養(yǎng)還可以有效地測試藥物對腫瘤生長和向鄰近組織轉(zhuǎn)移的抑制效果。在很多情況下，腫瘤不是由單一細胞類型而是由多種不同類型組成的異原化類群。為了研究周圍鄰近的健康組織如何受到異原化腫瘤細胞增生行為的影響，常將成纖維細胞，內(nèi)皮細胞和各種上皮細胞加入到腫瘤組織中，觀察腫瘤細胞的侵入和正常細胞生長行為的改變。 3.2軟骨和骨組織 成熟的軟骨細胞和干細胞被廣泛用于三維細胞培養(yǎng)，以再生損傷的軟骨、骨、韌帶、肌鍵和膝關節(jié)半月板。在培養(yǎng)系統(tǒng)中常加入一些生長因子，以刺激分化，產(chǎn)生組織。Spitzer將兔造骨前體細胞在附有7. 5 %磷酸三鈣(alpha-TCP)的血纖維蛋白內(nèi)培養(yǎng)53

9、d，用無alpha-TCP組作對照，結(jié)果顯示這種系統(tǒng)能有利于體外骨的形。近來實驗也揭示經(jīng)過成纖維細胞生長因子處理的牛的軟骨細胞在三維支架上培養(yǎng)更有利，在細胞的數(shù)量、結(jié)構(gòu)、功能等方面都明顯優(yōu)于二維培養(yǎng)。在三維載體上培養(yǎng)骨髓細胞，能夠為細胞生長提供最適宜的環(huán)境，維持骨髓細胞長期存活。目前函待解決的核心問題是如何理解干細胞在不同生長支架上的發(fā)育能力;如何獲得具備機械耐受力的細胞外基質(zhì);外植體如何和相鄰組織最佳整合;復合組織的培育問題。關于復合組織的培育，例如為了體外構(gòu)建氣管，必須使呼吸性上皮組織，透明軟骨和平滑肌能夠和疏松結(jié)締組織共生。再比如，構(gòu)建外耳廓時僅僅獲得彈性軟骨組織是不夠的，還必須考慮皮膚

10、和而管的徘應對茸牛書的影響。 3.3循環(huán)系統(tǒng)和心臟 除了上皮組織和軟骨組織外，其它組織都配備有大小各異的血管。如何在成熟的組織中及時產(chǎn)生血管網(wǎng)絡是組織工程的重要課題;在治療領域，所關心的也是如何有目的地改變血管形成，比如，使用血管發(fā)生抑制劑封鎖住血管內(nèi)皮生長因子受體( VEGFR 2)從而阻止腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。一個十分有用的體外工具是用腫瘤細胞和內(nèi)皮細胞進行三維輔培養(yǎng)，從而觀察血管發(fā)生抑制劑對腫瘤血管化的抑制效應。還有報道利用三維培養(yǎng)研究心內(nèi)膜炎，心肌炎的病理過程。另外，用三維培養(yǎng)研究移植到體內(nèi)的非細胞形式的心臟瓣膜如何適應周邊細胞環(huán)境。 3.4神經(jīng)干細胞 從培植單一神經(jīng)元成為多細胞聚集

11、體，到海馬體活標本切片后測試神經(jīng)元電勢，都有使用三維培養(yǎng)的實例。另一個熱點是選用神經(jīng)干細胞取代Alzheiner病，Paninson病或硬化病中損傷的神經(jīng)組織。為了獲得最佳化治療，首先將神經(jīng)干細胞培植在三維培養(yǎng)系統(tǒng)中，觀察干細胞的戮附行為、在不同培植條件下的發(fā)育潛力和它們與毗鄰組織的功能整合性。 4三維細胞培養(yǎng)技術的發(fā)展前景 三維細胞培養(yǎng)技術對于細胞生長、分化以及細胞間相互作用機制的研究具有巨大的意義，同時將會有更多的應用價值被發(fā)掘。在支架材料、操作方法和抗腫瘤藥物篩選及組織工程應用等方面三維細胞培養(yǎng)基礎都取得了一定的成就。但是三維細胞培養(yǎng)技術的發(fā)展還面臨許多困難，如細胞在三維培養(yǎng)體系中未

12、達到最好的生長狀態(tài)，與體內(nèi)的真實情況還有一定的差別幾支架材料的選擇、輔助的培養(yǎng)方式等不夠完善等。相信隨著三維細胞培養(yǎng)技術與微流控、微制造、微芯片等前沿技術的融合以及相關學科的發(fā)展，這些問題將會逐一解決。三維細胞培養(yǎng)技術在腫瘤學、干細胞生物學、組織形成、血管發(fā)育、器官再造等領域的應用將會取得巨大的成就，是目前值得深入研究的課題。 【參考文獻】 [1]胡康洪,姚穎. 三維細胞培養(yǎng)技術的研究與應用[J]. 醫(yī)學分子生物學雜志,2008,02:185-188. [2]滕偉,郭志坤. 細胞三維培養(yǎng)的研究進展[J]. 醫(yī)學綜述,2008,12:1767-1770. [3]Hiroshi Kik

13、uchi,Keiko Suzuki,Nobuhiro Sakai,Shoji Yamada. Odontoblasts induced from mesenchymal cells of murine dental papillae in three-dimensional cell culture[J]. Cell and Tissue Research,2004,3172:. [4]Marina Merne,Stina Syrjnen. The mesenchymal substrate influences the epithelial phenotype in a three-dim

14、ensional cell culture[J]. Archives of Dermatological Research,2003,2955:. [5]Dan Ge,Kedong Song,Shui Guan,Yanli Qi,Bo Guan,Wenfang Li,Junshan Liu,Xuehu Ma,Tianqing Liu,Zhanfeng Cui. Culture and Differentiation of Rat Neural Stem/Progenitor Cells in a Three-Dimensional Collagen Scaffold[J]. Applied

15、Biochemistry and Biotechnology,2013,1702:. [6]Cha Hyun-Myoung,Kim Sun-Mi,Choi Yong-Soo,Kim Dong-Il. Scaffold-free three-dimensional culture systems for mass production of periosteum-derived progenitor cells.[J]. Journal of bioscience and bioengineering,2015,1202:. [7]DU Ya Rong,Pan Dong,Chen Ya Xi

16、ong,Xue Gang,Ren Zhen Xin,Li Xiao Man,Zhang Shi Chuan,Hu Bu Rong. Irradiation Response of Adipose-derived Stem Cells under Three-dimensional Culture Condition.[J]. Biomedical and environmental sciences : BES,2015,288:. [8]Widbiller M,Lindner S R,Buchalla W,Eidt A,Hiller K-A,Schmalz G,Galler K M. Th

17、ree-dimensional culture of dental pulp stem cells in direct contact to tricalcium silicate cements.[J]. Clinical oral investigations,2016,202:. [9]Sun-Mi Lee,Nalae Han,Rimi Lee,In-Hong Choi,Yong-Beom Park,Jeon-Soo Shin,Kyung-Hwa Yoo. Real-time monitoring of 3D cell culture using a 3D capacitance bi

18、osensor[J]. Biosensors and Bioelectronics,2016,77:. [10]Goral Vasiliy N,Hsieh Yi-Cheng,Petzold Odessa N,Clark Jeffery S,Yuen PoKi,Faris Ronald A. Perfusion-based microfluidic device for three-dimensional dynamic primary human hepatocyte cell culture in the absence of biological or synthetic matrice

19、s or coagulants.[J]. Lab On a Chip,2010,1024:. [11]Baudino Troy A,McFadden Alex,Fix Charity,Hastings Joshua,Price Robert,Borg Thomas K. Cell patterning: interaction of cardiac myocytes and fibroblasts in three-dimensional culture.[J]. Microscopy and Microanalysis,2008,142:. [12]Lee Jungwoo,Cuddihy

20、 Meghan J,Kotov Nicholas A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art.[J]. Tissue Engineering. Part B. Reviews,2008,141:. [13]Rossi M.I.D.,Barros A.P.D.N.,Baptista L.S.,Garzoni L.R.,Meirelles M.N.,Takiya C.M.,Pascarelli B.M.O.,Dutra H.S.,Borojevic R.. Multicellular spheroids of bo

21、ne marrow stromal cells: a three-dimensional in vitro culture system for the study of hematopoietic cell migration[J]. Brazilian Journal of Medical and Biological Research,2005,3810:. [14]Jin Han,Lei Chen,Guanzheng Luo,Bin Dai,Xiujie Wang,Jianwu Dai. Three-dimensional culture may promote cell repro

22、gramming[J]. Organogenesis,2013,92:. [15]王穎鈺,陸茵,張偉偉,孫志廣,鄭仕中,陳磊. 三維細胞培養(yǎng)技術在腫瘤研究領域的應用[J]. 中國藥理學通報,2009,12:1545-1548. [16]趙燕娜,許健,鄧同樂. 三維細胞培養(yǎng)技術在再生醫(yī)學研究中的應用[J]. 科技通報,2011,04:531-535. [17]夏兵. 三維細胞培養(yǎng)技術在植物細胞研究中的應用進展[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2011,23:11-13+17. [18]賈茜,薛紹白,豐美福. 腫瘤治療中的多細胞耐受性與三維細胞培養(yǎng)[J]. 細胞生物學雜志,2004,04:394-398. [19]何平,張學,趙曉航. 三維細胞培養(yǎng)與腫瘤細胞惡性表型研究[J]. 生命的化學,2005,03:252-255. [20]曹寅,潘昱. 三維細胞培養(yǎng)技術研究進展[J]. 安徽醫(yī)藥,2006,03:221-222.