醫(yī)學分子生物學原理：第7章 第2節(jié) PCR技術 第3節(jié) 序列分析

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1、基因操作基因操作第七章第七章Gene ManipulatingGene Manipulating2022年年2月月11日日21時時59分分1PCR Polymerase Chain Reaction2022年年2月月11日日21時時59分分2http:/ PCR(polymerase chain reaction)技術是技術是19851985年年由美國科學家由美國科學家Kary B Mullis發(fā)明的體外基因片段擴發(fā)明的體外基因片段擴增的方法。增的方法。一、一、PCR技術的產(chǎn)生技術的產(chǎn)生2022年年2月月11日日21時時59分分32022年年2月月11日日21時時59分分4二、二、PCRPCR

2、技術的基本原理技術的基本原理DNADNA模板變性模板變性 (denature)(denature)： 95 95左右高溫使模板左右高溫使模板DNADNA完全變性。完全變性。單鏈單鏈DNADNA模板與引物退火模板與引物退火 (annealing)(annealing)： 5555左右引物與模板形成復合物的幾左右引物與模板形成復合物的幾率率DNADNA分子自身的復性。分子自身的復性。引物的延伸引物的延伸 (extension)(extension)： 72 72左右耐熱左右耐熱DNADNA聚合酶在最適溫度下聚合酶在最適溫度下催化催化DNADNA合成反應。合成反應。2022年年2月月11日日21時時

3、59分分55 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 PCRPCR技術的基本原理示意圖技術的基本原理示意圖TaqTaq酶酶TaqTaq酶酶2022年年2月月11日日21時時59分分6Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循環(huán)后，次循環(huán)后， PCR PCR的擴增倍的擴增倍數(shù)為數(shù)為(1+x)(1+x)n n, x=75%, n, x=75%, n為循環(huán)數(shù)。為循環(huán)數(shù)。2022年年2月月11日日21時時59分分7DNA PolymerasedNTP

4、sPCR buffer, Mg2+PrimersTemplate DNA PCR PCR體系的體系的5 5種基本組成成分種基本組成成分2022年年2月月11日日21時時59分分8PCR反反應應循循環(huán)環(huán)變性變性9395C左右左右延伸延伸酶最適溫度酶最適溫度退火退火引物引物Tm-5C 經(jīng)過經(jīng)過3030個左右的循環(huán)后，個左右的循環(huán)后，模板模板DNA的的含量可以擴大含量可以擴大100萬倍以上。萬倍以上。2022年年2月月11日日21時時59分分9思考題思考題 1 PCRPCR技術的主要特點技術的主要特點1.特異性強特異性強 2.靈敏度高靈敏度高 3.簡便快速簡便快速 4.對標本的純度要求低對標本的純度

5、要求低 2022年年2月月11日日21時時59分分10u衡量衡量PCR好壞的參數(shù)：好壞的參數(shù)：特異性特異性Specificity:最好最好只有目的只有目的DNA帶。帶。真實性真實性Fidelity:DNA序序列正確。列正確。產(chǎn)量產(chǎn)量Q Quantity:DNA帶帶明亮。明亮。2022年年2月月11日日21時時59分分11思考題思考題 2 利用利用特異性引物特異性引物以以cDNAcDNA或基因組或基因組DNADNA為模為模 板獲得已知目的基因片段。板獲得已知目的基因片段。 利用利用簡并引物簡并引物從從cDNAcDNA文庫或基因組文庫中文庫或基因組文庫中 獲得具有一定同源性的基因片段。獲得具有一定

6、同源性的基因片段。 利用利用隨機引物隨機引物從從cDNAcDNA文庫或基因組文庫中文庫或基因組文庫中 隨機克隆基因。隨機克隆基因。u 用不同引物進行用不同引物進行PCRPCR獲取目的基因：獲取目的基因：（一）目的基因的克?。ㄒ唬┠康幕虻目寺?022年年2月月11日日21時時59分分12(reverse transcription PCR,RT-PCR)PCR 特點：特點：敏感度高、特異性強、省時等。敏感度高、特異性強、省時等。 RT-PCR是從組織細胞中獲得目的基因、對已知是從組織細胞中獲得目的基因、對已知 序列序列RNA進行定性及半定量分析最的有效方法。進行定性及半定量分析最的有效方法?？?/p>

7、總RNA( (或或mRNA) ) ss-cDNAds-cDNAPCR擴增擴增2022年年2月月11日日21時時59分分13u 獲取目的基因的特殊獲取目的基因的特殊PCRPCR技術：技術：RT-PCR原理原理AAnATTnT 55mRNA反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA3TTnTAAnA核糖核酸酶HTTnT3DNA poly IcDNA核酸酶S1雙鏈雙鏈cDNAcDNA35 35 5加熱變性加入特異性引物DNA聚合酶PCR大量的產(chǎn)物大量的產(chǎn)物2022年年2月月11日日21時時59分分14-actin 433bp HIF-1 359bp300 bp500 bp400 bp300bp500bp400bp20

8、0bp-actin 433bpVEGF 238bpRT-PCR的結果舉例的結果舉例2022年年2月月11日日21時時59分分15限制酶切位點限制酶切位點限制酶消化限制酶消化 cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA與載體與載體DNA混合混合 連接反應連接反應 體外包裝體外包裝 感染大腸桿菌感染大腸桿菌 7 Kb DNA 片段片段 cos LR cos7 Kb 外源外源 cDNA 片段片段 cDNA文庫文庫c DNA 片段片段 2/11/2022 9:59 PM16重組噬菌體重組噬菌體錨定錨定PCRPCR 先合成第一鏈先合成第一鏈cDN

9、AcDNA后后, ,添加一同聚物尾添加一同聚物尾(polydG),(polydG),與帶與帶有有polydC polydC 限制性內(nèi)切位點的限制性內(nèi)切位點的33錨定引物一起擴增。錨定引物一起擴增。2022年年2月月11日日21時時59分分17原理：原理：設計設計“內(nèi)、外內(nèi)、外” ” 兩對引物：兩對引物：-PCR（nested-PCR） 先用外引物進行先用外引物進行PCR反應，從反應，從模板上模板上擴增出擴增出含有內(nèi)引物擴增的靶序列的較長產(chǎn)物，并以此作含有內(nèi)引物擴增的靶序列的較長產(chǎn)物，并以此作為模板用內(nèi)引物進行第二次為模板用內(nèi)引物進行第二次PCR反應，擴增出內(nèi)反應，擴增出內(nèi)側(cè)的較短靶序列。側(cè)的較

10、短靶序列。 外引物外引物對應的序列在模板的外側(cè)；對應的序列在模板的外側(cè)； 內(nèi)引物內(nèi)引物對應的序列在外引物的內(nèi)側(cè)。對應的序列在外引物的內(nèi)側(cè)。2022年年2月月11日日21時時59分分18第第1輪輪PCR：1520個循環(huán)的標準擴增。個循環(huán)的標準擴增。第第2輪輪PCR：將第：將第1輪輪PCR擴增產(chǎn)物稀釋擴增產(chǎn)物稀釋1001000倍，倍， 作為模板進行第作為模板進行第2輪輪PCR ，擴增，擴增1520個循環(huán)。個循環(huán)。2022年年2月月11日日21時時59分分19 降低了多個靶位點擴增的可能性，因與降低了多個靶位點擴增的可能性，因與2套引物都互補的靶序列很少。如用相同引物對套引物都互補的靶序列很少。如用

11、相同引物對作總數(shù)相同的循環(huán)，會擴增非特異性靶點。作總數(shù)相同的循環(huán)，會擴增非特異性靶點。 可增加有限量靶序列可增加有限量靶序列( (如稀有如稀有mRNA)mRNA)的靈的靈敏度，并且提高了困難敏度，并且提高了困難PCR(PCR(如如5 RACE)5 RACE)的特的特異性。異性。 用外、內(nèi)用外、內(nèi)2 2對引物擴增，可大大提高擴增的對引物擴增，可大大提高擴增的靈敏度和特異性。靈敏度和特異性。2022年年2月月11日日21時時59分分202022年年2月月11日日21時時59分分213-RACE2022年年2月月11日日21時時59分分225-RACE5-capAAAAAAAAAA3mRNAGSP1

12、1.逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄去除RNA和GSP12.末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶3CCCCC3CCCCC3.退火，退火，PCRGSP25GACTCGAGTCGACATCGAGGGGG-3Xho l Sal I ClaI3CCCCC5GACTCGAGTCGACATCGAGGGGGXho l Sal I ClaI3CCCCCGSP25GACTCGAGTCGACATCGAGGGGGXho l Sal I ClaI3. PCR用限制性內(nèi)切酶切割克隆即獲得用限制性內(nèi)切酶切割克隆即獲得5末端片段末端片段2022年年2月月11日日21時時59分分232022年年2月月11日日21時時59分分24反向反向PCR (reverse

13、 PCR) PCR (reverse PCR) 用反向的互補引物來擴增兩引物以外的用反向的互補引物來擴增兩引物以外的DNADNA片段對片段對某個已知某個已知DNADNA片段兩側(cè)的未知序列進行擴增。片段兩側(cè)的未知序列進行擴增。2022年年2月月11日日21時時59分分25電泳電泳負極負極正極正極 測序反應測序反應 GATC*2，3雙脫氧核苷酸雙脫氧核苷酸*用用4種不同熒光標記種不同熒光標記 DNADNA樣品樣品 引物、引物、DNADNA聚合酶、聚合酶、dNTPdNTPddGddAddTddC5 3 AACGTGGACddTCCGATTT TTGCACCTGAGGCTAAAAAC GTGGACTA

14、ACGTGGAddCAACGTGGddAddAAddAAAddCAACGddTAACddGAACGTddGAACGTGddGu 末端合成終止法測定末端合成終止法測定DNADNA序列的原理序列的原理DNA自動測序結果自動測序結果2022年年2月月11日日21時時59分分27The Nobel Prize in Chemistry 1980for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard to recombinant-DNAfor their contributions

15、concerning the determination of base sequences in nucleic acidsPaul Berg1/2 of the prizeStanford University Stanford, CA, USA1926 - Walter Gilbert Frederick Sanger1/4 of the prize 1/4 of the prize Harvard University, Biological Laboratories Cambridge, MA, USAMRC Laboratory of Molecular Biology Cambr

16、idge, United Kingdom1932 - 1918 - 2022年年2月月11日日21時時59分分28（二）基因的體外突變（二）基因的體外突變 利用利用PCR技術可以隨意設計引物在體外技術可以隨意設計引物在體外進行基因的嵌和、缺失、點突變等改造。進行基因的嵌和、缺失、點突變等改造。 利用利用PCR技術構建重組體和突變體的方技術構建重組體和突變體的方法稱為法稱為重組重組PCR( (recombinant PCR) )。 特點是簡單、省時；利用兩對引物很容特點是簡單、省時；利用兩對引物很容易的在易的在DNA片段的任何位置進行點突變。片段的任何位置進行點突變。2022年年2月月11日日2

17、1時時59分分291. 隨機突變：隨機突變：應用：應用：策略：易錯策略：易錯PCR（error-prone PCR）。）。 利用利用Taq DNATaq DNA聚合酶等沒有聚合酶等沒有3535校校對功能的特性，在對功能的特性，在PCRPCR擴增反應中可能摻入擴增反應中可能摻入錯誤的核苷酸，產(chǎn)生隨機錯誤的擴增產(chǎn)物。錯誤的核苷酸，產(chǎn)生隨機錯誤的擴增產(chǎn)物。 加入加入ITPITP并限制某一種核苷酸用量，從并限制某一種核苷酸用量，從而促進而促進DNADNA聚合酶選擇其它聚合酶選擇其它3 3種核苷酸或種核苷酸或ITPITP，導致產(chǎn)物發(fā)生突變。導致產(chǎn)物發(fā)生突變。構建突變體文庫，繼而可從中篩選出具有特構建突變

18、體文庫，繼而可從中篩選出具有特殊性質(zhì)的突變個體殊性質(zhì)的突變個體2022年年2月月11日日21時時59分分302.2.定點點突變定點點突變(1) 5(1) 5端引入點突變：端引入點突變：(2) (2) 序列中的點突變：序列中的點突變： 通過修飾上游引物的通過修飾上游引物的55端的堿基序列，端的堿基序列，可引入標記的堿基、限制性酶切位點、啟可引入標記的堿基、限制性酶切位點、啟動子序列等。動子序列等。 采用重疊延伸采用重疊延伸PCR(Overlap Extension PCR(Overlap Extension PCRPCR，OE PCROE PCR。2022年年2月月11日日21時時59分分31P

19、CR 用酶用酶A A和和B B消化、克隆，將突變位點引入消化、克隆，將突變位點引入PCRPCR重組體。重組體。(1) 末端引入點突變末端引入點突變ABP2P1AB2022年年2月月11日日21時時59分分32EcoRIHindIIIIsolate products, mixAmplifydigest, subclone sequencePvuII(2) (2) 序列中的點突變：序列中的點突變：2022年年2月月11日日21時時59分分33例子：例子：S.pn的的ply146aa缺失的突變序列構建缺失的突變序列構建肺炎鏈球菌肺炎鏈球菌S.Pn的的ply為一細胞毒性分子，其為一細胞毒性分子，其14

20、6位位aa缺失后毒性大大減弱。構建突變體作為疫苗：缺失后毒性大大減弱。構建突變體作為疫苗：首先設計首先設計4 4個引物：個引物：(M1(M1和和M2M2完全重疊完全重疊) )P1: 5-P1: 5-CGGGATCCCGGGATCCATGGCAAATAAAGCAGTAAATG-3ATGGCAAATAAAGCAGTAAATG-3 BamH IBamH IP2: 5-P2: 5-CCGCTCGACCGCTCGAGCAAGCATTCTCCTCTCCTAGTC-3GCAAGCATTCTCCTCTCCTAGTC-3 Xho I Xho IM1: 5-GGTCAATAATGTCCCA-AGAATGCAGTA

21、TG-3M1: 5-GGTCAATAATGTCCCA-AGAATGCAGTATG-3M2: 5-CATACTGCATTCT-TGGGACATTATTGACC-3 M2: 5-CATACTGCATTCT-TGGGACATTATTGACC-3 2022年年2月月11日日21時時59分分34突變位點突變位點M2M2M1M1P2P2P1P1555555333355為酶切位點序列為酶切位點序列1.1.以基因組以基因組DNADNA為模板，以為模板，以P1P1和和M1M1為引物擴增出為引物擴增出plyply上游片斷，以上游片斷，以P2P2和和M2M2為引物擴增出為引物擴增出plyply下游片斷；下游片斷；2

22、.2.以上下游片斷為模板，以以上下游片斷為模板，以P1P1和和P2P2為引物擴出全長；為引物擴出全長；3.3.酶切后克隆到質(zhì)粒中保存。酶切后克隆到質(zhì)粒中保存。2022年年2月月11日日21時時59分分35ABP1P2P3P4PCRABPCRAB3.3.引入大片段缺失引入大片段缺失2022年年2月月11日日21時時59分分364.4.多位點突變多位點突變策略：多次重疊策略：多次重疊PCRPCR關鍵：重疊引物設計關鍵：重疊引物設計( (每對均需部分重疊，方向相反每對均需部分重疊，方向相反) )。2022年年2月月11日日21時時59分分37基基本本操操作作2022年年2月月11日日21時時59分分

23、38（三）（三）DNADNA的微量分析的微量分析 PCR PCR技術敏感度很高，理論上只要存在技術敏感度很高，理論上只要存在1 1分子的模板，就可以獲得目的片段，是分子的模板，就可以獲得目的片段，是DNADNA微微量分析的最好方法。量分析的最好方法。 實際工作中，實際工作中，1滴血液、滴血液、1根毛發(fā)或根毛發(fā)或1個細個細胞已足以滿足胞已足以滿足PCR的檢測需要。的檢測需要。2022年年2月月11日日21時時59分分39（四）（四）mRNAmRNA的含量分析的含量分析 用于用于RNA檢測的常用字方法有原位雜交、點雜檢測的常用字方法有原位雜交、點雜交、交、Northern印跡雜交及核酸酶保護試驗等

24、，都難印跡雜交及核酸酶保護試驗等，都難以檢測低豐度的以檢測低豐度的mRNA，且操作繁瑣。，且操作繁瑣。 在敏感性方面，在敏感性方面，RT- PCR用于用于mRNA定量分析定量分析要遠高于上述傳統(tǒng)方法。要遠高于上述傳統(tǒng)方法。RT-PCRRT-PCR用于用于mRNAmRNA定量分析面臨的問題：定量分析面臨的問題： 在第一步合成在第一步合成cDNA的反應中會造成一些誤差，的反應中會造成一些誤差，但是更重要和顯著的誤差是由但是更重要和顯著的誤差是由PCR反應本身造成。反應本身造成。2022年年2月月11日日21時時59分分40u用于定量用于定量PCRPCR分析的兩種技術：分析的兩種技術：競爭性定量競爭

25、性定量PCRPCR： 在反應前加入外源標準品在反應前加入外源標準品RNA作為內(nèi)參照；須使作為內(nèi)參照；須使用與樣品用與樣品RNA同樣的引物識別序列，但產(chǎn)物的大小不同樣的引物識別序列，但產(chǎn)物的大小不同，以在電泳時區(qū)別開。同，以在電泳時區(qū)別開。 屬反應終點分析方法，需用系列稀釋標準屬反應終點分析方法，需用系列稀釋標準RNA做做成標準曲線，樣品成標準曲線，樣品RNA的含量應在標準曲線范圍內(nèi)。的含量應在標準曲線范圍內(nèi)。實時實時PCR(real time PCR)PCR(real time PCR)： 是近年發(fā)展起來的一種是近年發(fā)展起來的一種RNA微量分析技術；精確微量分析技術；精確度高，結果明確，操作容

26、易，能進行高通量檢測。度高，結果明確，操作容易，能進行高通量檢測。 2022年年2月月11日日21時時59分分41u實時實時PCRPCR的基本原理的基本原理 在反應中引入了熒光標記分子，在反應過程中在反應中引入了熒光標記分子，在反應過程中對反應過程中每一時刻的產(chǎn)物量進行實時分析。對反應過程中每一時刻的產(chǎn)物量進行實時分析。 不同公司的儀器和反應系統(tǒng)所用的熒光報告系不同公司的儀器和反應系統(tǒng)所用的熒光報告系統(tǒng)不同：統(tǒng)不同：Molecular Probe 公司的公司的SYBR Green 系統(tǒng)系統(tǒng)Perkin-Elmer/ABD公司的公司的TaqMan系統(tǒng)系統(tǒng)Invitrogen公司的公司的Molec

27、ular Beacons系統(tǒng)系統(tǒng)2022年年2月月11日日21時時59分分42 PCR擴 增 時 ，擴 增 時 ，TaqTaq酶的酶的5- 35- 3外外切酶活性切酶活性將探針酶切將探針酶切降解，使探針上的降解，使探針上的熒熒光基團光基團和和淬滅基團淬滅基團分分離，使離，使熒光基團在激熒光基團在激發(fā)光作用下發(fā)出發(fā)光作用下發(fā)出熒光；熒光； 每擴增一條每擴增一條DNA鏈就有一個熒光分子鏈就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與號的累積與PCR產(chǎn)物產(chǎn)物形成完全同步。形成完全同步。2022年年2月月11日日21時時59分分43思考題思考題 31.1.實時熒光實時熒光PCRTaqM

28、an技術技術RQ5353ExcitationRQQRQRExcitation實時熒光實時熒光PCRPCRTaqMan技術技術2022年年2月月11日日21時時59分分44TaqManTaqMan技術技術的優(yōu)、缺點的優(yōu)、缺點優(yōu)點：優(yōu)點：雜交效率高雜交效率高缺點：缺點：(2) (2) 探針的水解依賴于探針的水解依賴于TaqTaq的酶外切活性，的酶外切活性， 故受酶性能和試劑質(zhì)量影響；故受酶性能和試劑質(zhì)量影響；(3) (3) 檢測點突變的能力相對不足。檢測點突變的能力相對不足。(1) (1) 淬滅難以徹底，本底較高；淬滅難以徹底，本底較高；2022年年2月月11日日21時時59分分45RQExcit

29、ationRQQRExcitationEmission2.2.實時熒光實時熒光PCRPCR分子信標分子信標技術技術2022年年2月月11日日21時時59分分46分子信標分子信標技術技術的優(yōu)、缺點的優(yōu)、缺點優(yōu)點：優(yōu)點：熒光本底低。熒光本底低。熒光基團和淬滅基團極熒光基團和淬滅基團極端靠近；淬滅基團為非熒光物質(zhì)，不端靠近；淬滅基團為非熒光物質(zhì)，不存在對供體熒光測定的干擾，熒光淬存在對供體熒光測定的干擾，熒光淬滅徹底。滅徹底。缺點：缺點：設計時需要同時考慮探針和臂的熔點，設計時需要同時考慮探針和臂的熔點，增加了難度。增加了難度。2022年年2月月11日日21時時59分分47SYBR Green IS

30、YBR Green I是一種只與雙鏈是一種只與雙鏈DNADNA小小溝結合的染料，當它與溝結合的染料，當它與DNADNA雙鏈結合時，發(fā)雙鏈結合時，發(fā)出熒光；從出熒光；從DNADNA雙鏈上釋放出來時，熒光信雙鏈上釋放出來時，熒光信號急劇減弱。號急劇減弱。 因此，在一個體系內(nèi)，其信號強度代因此，在一個體系內(nèi)，其信號強度代表了雙鏈表了雙鏈DNADNA的量。的量。3.3.實時熒光實時熒光PCRPCRSYBR Green I SYBR Green I 技術技術2022年年2月月11日日21時時59分分48SYBRSYBR GreenGreen I I熒光染料的作用原理熒光染料的作用原理 2022年年2月月

31、11日日21時時59分分49SYBR Green I SYBR Green I 技術的優(yōu)、缺點技術的優(yōu)、缺點優(yōu)點：優(yōu)點：技術簡單、方便，而且可適用于任技術簡單、方便，而且可適用于任何何PCRPCR反應；反應；缺點：缺點：非特異性結合。非特異性結合。 SYBR Green I 也可也可與非特異性的雙鏈結合如引物二聚體，與非特異性的雙鏈結合如引物二聚體，非特異性非特異性PCRPCR擴增產(chǎn)物等擴增產(chǎn)物等2022年年2月月11日日21時時59分分50熒光曲線 隨著隨著PCRPCR反應的進行，擴增產(chǎn)物不斷累積，熒反應的進行，擴增產(chǎn)物不斷累積，熒光信號強度不斷增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一次光信號強度不斷增

32、加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一次熒光強度信號，得到一條熒光擴增曲線圖熒光強度信號，得到一條熒光擴增曲線圖4.4.實時定量實時定量PCRPCR的定量原理的定量原理2022年年2月月11日日21時時59分分51熒光閾值熒光閾值 在熒光擴增曲線指數(shù)增長期設定一個熒光強在熒光擴增曲線指數(shù)增長期設定一個熒光強度標準度標準( (即即PCRPCR擴增產(chǎn)物量的標準擴增產(chǎn)物量的標準) )。閾值線閾值線u實時定量實時定量PCRPCR的兩個重要概念的兩個重要概念2022年年2月月11日日21時時59分分52 CtCt值的概念值的概念 Ct Ct值的定義是值的定義是PCRPCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物擴增過程中，擴增產(chǎn)物(

33、(熒光熒光信號信號) )到達閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)。到達閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)。C(t) 值值C(t) 值值18.12 +/0.04-閾值線閾值線2022年年2月月11日日21時時59分分53模板起始濃度越高，模板起始濃度越高，Ct值越小值越小CtCt值與模板起始濃度的關系值與模板起始濃度的關系哪個樣品濃度高？哪個樣品濃度高？2022年年2月月11日日21時時59分分54CtCt值的重現(xiàn)性極好值的重現(xiàn)性極好為什么用為什么用Ct值而不用終點相對熒光強度定量？值而不用終點相對熒光強度定量？2022年年2月月11日日21時時59分分55閾值的選擇閾值的選擇 熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定

34、的熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可設定在指數(shù)擴增階段任意位置一個值，它可設定在指數(shù)擴增階段任意位置上；上； 缺省設置一般是缺省設置一般是3-153-15個循環(huán)的熒光信號的個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的標準偏差的1010倍。倍。 但實際應用時要結合擴增效率、線形回歸但實際應用時要結合擴增效率、線形回歸系數(shù)等參數(shù)來綜合考慮系數(shù)等參數(shù)來綜合考慮 2022年年2月月11日日21時時59分分56熒光強度循環(huán)數(shù)曲線熒光強度循環(huán)數(shù)曲線 初始模板量對數(shù)初始模板量對數(shù)C(T)循循環(huán)數(shù)標準曲線環(huán)數(shù)標準曲線.未知未知10410310610510210 定量原理：定量原理：利用已知起始拷貝數(shù)的標準樣品作

35、出標利用已知起始拷貝數(shù)的標準樣品作出標準曲線準曲線, ,通過未知樣品的通過未知樣品的CtCt值值, ,從標準曲線上計算出該從標準曲線上計算出該樣品的起始濃度。樣品的起始濃度。2022年年2月月11日日21時時59分分57unknown104103Unknown contains 3108 copies 首先確定未知樣品的首先確定未知樣品的 C(t)C(t)值，借助標準曲線由未值，借助標準曲線由未知樣品的知樣品的C(t)C(t)值反推出其初始量值反推出其初始量得到未知樣品初始得到未知樣品初始量絕對值。量絕對值。2022年年2月月11日日21時時59分分582022年年2月月11日日21時時59分分59 2. 2.衡量衡量PCRPCR好壞的參數(shù)好壞的參數(shù)主要有哪些？一般來說主要有哪些？一般來說好的結果如何體現(xiàn)？好的結果如何體現(xiàn)？思考題：思考題： 3. 3. 以以TaqMan技術技術為例，簡述為例，簡述實時熒光實時熒光PCRPCR的的原理。原理。 1.PCR 1.PCR過程中的過程中的DNADNA模板變性、模板與引物退模板變性、模板與引物退火、引物延伸火、引物延伸3 3步的步的溫度設置溫度設置一般大致是多少？要一般大致是多少？要考慮的主要因素是什么？考慮的主要因素是什么？