醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)原理：第7章 第2節(jié) PCR技術(shù) 第3節(jié) 序列分析

基因操作基因操作第七章第七章Gene ManipulatingGene Manipulating2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分1PCR Polymerase Chain Reaction2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分2http:/ PCR(polymerase chain reaction)技術(shù)是技術(shù)是19851985年年由美國(guó)科學(xué)家由美國(guó)科學(xué)家Kary B Mullis發(fā)明的體外基因片段擴(kuò)發(fā)明的體外基因片段擴(kuò)增的方法。增的方法。一、一、PCR技術(shù)的產(chǎn)生技術(shù)的產(chǎn)生2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分32022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分4二、二、PCRPCR技術(shù)的基本原理技術(shù)的基本原理DNADNA模板變性模板變性 (denature)(denature)： 95 95左右高溫使模板左右高溫使模板DNADNA完全變性。完全變性。單鏈單鏈DNADNA模板與引物退火模板與引物退火 (annealing)(annealing)： 5555左右引物與模板形成復(fù)合物的幾左右引物與模板形成復(fù)合物的幾率率DNADNA分子自身的復(fù)性。分子自身的復(fù)性。引物的延伸引物的延伸 (extension)(extension)： 72 72左右耐熱左右耐熱DNADNA聚合酶在最適溫度下聚合酶在最適溫度下催化催化DNADNA合成反應(yīng)。合成反應(yīng)。2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分55 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 PCRPCR技術(shù)的基本原理示意圖技術(shù)的基本原理示意圖TaqTaq酶酶TaqTaq酶酶2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分6Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循環(huán)后，次循環(huán)后， PCR PCR的擴(kuò)增倍的擴(kuò)增倍數(shù)為數(shù)為(1+x)(1+x)n n, x=75%, n, x=75%, n為循環(huán)數(shù)。為循環(huán)數(shù)。2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分7DNA PolymerasedNTPsPCR buffer, Mg2+PrimersTemplate DNA PCR PCR體系的體系的5 5種基本組成成分種基本組成成分2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分8PCR反反應(yīng)應(yīng)循循環(huán)環(huán)變性變性9395C左右左右延伸延伸酶最適溫度酶最適溫度退火退火引物引物Tm-5C 經(jīng)過(guò)經(jīng)過(guò)3030個(gè)左右的循環(huán)后，個(gè)左右的循環(huán)后，模板模板DNA的的含量可以擴(kuò)大含量可以擴(kuò)大100萬(wàn)倍以上。萬(wàn)倍以上。2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分9思考題思考題 1 PCRPCR技術(shù)的主要特點(diǎn)技術(shù)的主要特點(diǎn)1.特異性強(qiáng)特異性強(qiáng) 2.靈敏度高靈敏度高 3.簡(jiǎn)便快速簡(jiǎn)便快速 4.對(duì)標(biāo)本的純度要求低對(duì)標(biāo)本的純度要求低 2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分10u衡量衡量PCR好壞的參數(shù)：好壞的參數(shù)：特異性特異性Specificity:最好最好只有目的只有目的DNA帶。帶。真實(shí)性真實(shí)性Fidelity:DNA序序列正確。列正確。產(chǎn)量產(chǎn)量Q Quantity:DNA帶帶明亮。明亮。2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分11思考題思考題 2 利用利用特異性引物特異性引物以以cDNAcDNA或基因組或基因組DNADNA為模為模 板獲得已知目的基因片段。板獲得已知目的基因片段。 利用利用簡(jiǎn)并引物簡(jiǎn)并引物從從cDNAcDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中文庫(kù)或基因組文庫(kù)中 獲得具有一定同源性的基因片段。獲得具有一定同源性的基因片段。 利用利用隨機(jī)引物隨機(jī)引物從從cDNAcDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中文庫(kù)或基因組文庫(kù)中 隨機(jī)克隆基因。隨機(jī)克隆基因。u 用不同引物進(jìn)行用不同引物進(jìn)行PCRPCR獲取目的基因：獲取目的基因：（一）目的基因的克?。ㄒ唬┠康幕虻目寺?022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分12(reverse transcription PCR,RT-PCR)PCR 特點(diǎn)：特點(diǎn)：敏感度高、特異性強(qiáng)、省時(shí)等。敏感度高、特異性強(qiáng)、省時(shí)等。 RT-PCR是從組織細(xì)胞中獲得目的基因、對(duì)已知是從組織細(xì)胞中獲得目的基因、對(duì)已知 序列序列RNA進(jìn)行定性及半定量分析最的有效方法。進(jìn)行定性及半定量分析最的有效方法?？偪俁NA( (或或mRNA) ) ss-cDNAds-cDNAPCR擴(kuò)增擴(kuò)增2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分13u 獲取目的基因的特殊獲取目的基因的特殊PCRPCR技術(shù)：技術(shù)：RT-PCR原理原理AAnATTnT 55mRNA反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA3TTnTAAnA核糖核酸酶HTTnT3DNA poly IcDNA核酸酶S1雙鏈雙鏈cDNAcDNA35 35 5加熱變性加入特異性引物DNA聚合酶PCR大量的產(chǎn)物大量的產(chǎn)物2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分14-actin 433bp HIF-1 359bp300 bp500 bp400 bp300bp500bp400bp200bp-actin 433bpVEGF 238bpRT-PCR的結(jié)果舉例的結(jié)果舉例2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分15限制酶切位點(diǎn)限制酶切位點(diǎn)限制酶消化限制酶消化 cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA與載體與載體DNA混合混合 連接反應(yīng)連接反應(yīng) 體外包裝體外包裝 感染大腸桿菌感染大腸桿菌 7 Kb DNA 片段片段 cos LR cos7 Kb 外源外源 cDNA 片段片段 cDNA文庫(kù)文庫(kù)c DNA 片段片段 2/11/2022 9:59 PM16重組噬菌體重組噬菌體錨定錨定PCRPCR 先合成第一鏈先合成第一鏈cDNAcDNA后后, ,添加一同聚物尾添加一同聚物尾(polydG),(polydG),與帶與帶有有polydC polydC 限制性?xún)?nèi)切位點(diǎn)的限制性?xún)?nèi)切位點(diǎn)的33錨定引物一起擴(kuò)增。錨定引物一起擴(kuò)增。2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分17原理：原理：設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)“內(nèi)、外內(nèi)、外” ” 兩對(duì)引物：兩對(duì)引物：-PCR（nested-PCR） 先用外引物進(jìn)行先用外引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，從反應(yīng)，從模板上模板上擴(kuò)增出擴(kuò)增出含有內(nèi)引物擴(kuò)增的靶序列的較長(zhǎng)產(chǎn)物，并以此作含有內(nèi)引物擴(kuò)增的靶序列的較長(zhǎng)產(chǎn)物，并以此作為模板用內(nèi)引物進(jìn)行第二次為模板用內(nèi)引物進(jìn)行第二次PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出內(nèi)反應(yīng)，擴(kuò)增出內(nèi)側(cè)的較短靶序列。側(cè)的較短靶序列。 外引物外引物對(duì)應(yīng)的序列在模板的外側(cè)；對(duì)應(yīng)的序列在模板的外側(cè)； 內(nèi)引物內(nèi)引物對(duì)應(yīng)的序列在外引物的內(nèi)側(cè)。對(duì)應(yīng)的序列在外引物的內(nèi)側(cè)。2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分18第第1輪輪PCR：1520個(gè)循環(huán)的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增。個(gè)循環(huán)的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增。第第2輪輪PCR：將第：將第1輪輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋1001000倍，倍， 作為模板進(jìn)行第作為模板進(jìn)行第2輪輪PCR ，擴(kuò)增，擴(kuò)增1520個(gè)循環(huán)。個(gè)循環(huán)。2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分19 降低了多個(gè)靶位點(diǎn)擴(kuò)增的可能性，因與降低了多個(gè)靶位點(diǎn)擴(kuò)增的可能性，因與2套引物都互補(bǔ)的靶序列很少。如用相同引物對(duì)套引物都互補(bǔ)的靶序列很少。如用相同引物對(duì)作總數(shù)相同的循環(huán)，會(huì)擴(kuò)增非特異性靶點(diǎn)。作總數(shù)相同的循環(huán)，會(huì)擴(kuò)增非特異性靶點(diǎn)。 可增加有限量靶序列可增加有限量靶序列( (如稀有如稀有mRNA)mRNA)的靈的靈敏度，并且提高了困難敏度，并且提高了困難PCR(PCR(如如5 RACE)5 RACE)的特的特異性。異性。 用外、內(nèi)用外、內(nèi)2 2對(duì)引物擴(kuò)增，可大大提高擴(kuò)增的對(duì)引物擴(kuò)增，可大大提高擴(kuò)增的靈敏度和特異性。靈敏度和特異性。2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分202022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分213-RACE2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分225-RACE5-capAAAAAAAAAA3mRNAGSP11.逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄去除RNA和GSP12.末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶3CCCCC3CCCCC3.退火，退火，PCRGSP25GACTCGAGTCGACATCGAGGGGG-3Xho l Sal I ClaI3CCCCC5GACTCGAGTCGACATCGAGGGGGXho l Sal I ClaI3CCCCCGSP25GACTCGAGTCGACATCGAGGGGGXho l Sal I ClaI3. PCR用限制性?xún)?nèi)切酶切割克隆即獲得用限制性?xún)?nèi)切酶切割克隆即獲得5末端片段末端片段2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分232022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分24反向反向PCR (reverse PCR) PCR (reverse PCR) 用反向的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的用反向的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的DNADNA片段對(duì)片段對(duì)某個(gè)已知某個(gè)已知DNADNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分25電泳電泳負(fù)極負(fù)極正極正極 測(cè)序反應(yīng)測(cè)序反應(yīng) GATC*2，3雙脫氧核苷酸雙脫氧核苷酸*用用4種不同熒光標(biāo)記種不同熒光標(biāo)記 DNADNA樣品樣品 引物、引物、DNADNA聚合酶、聚合酶、dNTPdNTPddGddAddTddC5 3 AACGTGGACddTCCGATTT TTGCACCTGAGGCTAAAAAC GTGGACTAACGTGGAddCAACGTGGddAddAAddAAAddCAACGddTAACddGAACGTddGAACGTGddGu 末端合成終止法測(cè)定末端合成終止法測(cè)定DNADNA序列的原理序列的原理DNA自動(dòng)測(cè)序結(jié)果自動(dòng)測(cè)序結(jié)果2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分27The Nobel Prize in Chemistry 1980for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard to recombinant-DNAfor their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acidsPaul Berg1/2 of the prizeStanford University Stanford, CA, USA1926 - Walter Gilbert Frederick Sanger1/4 of the prize 1/4 of the prize Harvard University, Biological Laboratories Cambridge, MA, USAMRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge, United Kingdom1932 - 1918 - 2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分28（二）基因的體外突變（二）基因的體外突變 利用利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)引物在體外技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)引物在體外進(jìn)行基因的嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造。進(jìn)行基因的嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造。 利用利用PCR技術(shù)構(gòu)建重組體和突變體的方技術(shù)構(gòu)建重組體和突變體的方法稱(chēng)為法稱(chēng)為重組重組PCR( (recombinant PCR) )。 特點(diǎn)是簡(jiǎn)單、省時(shí)；利用兩對(duì)引物很容特點(diǎn)是簡(jiǎn)單、省時(shí)；利用兩對(duì)引物很容易的在易的在DNA片段的任何位置進(jìn)行點(diǎn)突變。片段的任何位置進(jìn)行點(diǎn)突變。2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分291. 隨機(jī)突變：隨機(jī)突變：應(yīng)用：應(yīng)用：策略：易錯(cuò)策略：易錯(cuò)PCR（error-prone PCR）。）。 利用利用Taq DNATaq DNA聚合酶等沒(méi)有聚合酶等沒(méi)有3535校校對(duì)功能的特性，在對(duì)功能的特性，在PCRPCR擴(kuò)增反應(yīng)中可能摻入擴(kuò)增反應(yīng)中可能摻入錯(cuò)誤的核苷酸，產(chǎn)生隨機(jī)錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物。錯(cuò)誤的核苷酸，產(chǎn)生隨機(jī)錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物。 加入加入ITPITP并限制某一種核苷酸用量，從并限制某一種核苷酸用量，從而促進(jìn)而促進(jìn)DNADNA聚合酶選擇其它聚合酶選擇其它3 3種核苷酸或種核苷酸或ITPITP，導(dǎo)致產(chǎn)物發(fā)生突變。導(dǎo)致產(chǎn)物發(fā)生突變。構(gòu)建突變體文庫(kù)，繼而可從中篩選出具有特構(gòu)建突變體文庫(kù)，繼而可從中篩選出具有特殊性質(zhì)的突變個(gè)體殊性質(zhì)的突變個(gè)體2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分302.2.定點(diǎn)點(diǎn)突變定點(diǎn)點(diǎn)突變(1) 5(1) 5端引入點(diǎn)突變：端引入點(diǎn)突變：(2) (2) 序列中的點(diǎn)突變：序列中的點(diǎn)突變： 通過(guò)修飾上游引物的通過(guò)修飾上游引物的55端的堿基序列，端的堿基序列，可引入標(biāo)記的堿基、限制性酶切位點(diǎn)、啟可引入標(biāo)記的堿基、限制性酶切位點(diǎn)、啟動(dòng)子序列等。動(dòng)子序列等。 采用重疊延伸采用重疊延伸PCR(Overlap Extension PCR(Overlap Extension PCRPCR，OE PCROE PCR。2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分31PCR 用酶用酶A A和和B B消化、克隆，將突變位點(diǎn)引入消化、克隆，將突變位點(diǎn)引入PCRPCR重組體。重組體。(1) 末端引入點(diǎn)突變末端引入點(diǎn)突變ABP2P1AB2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分32EcoRIHindIIIIsolate products, mixAmplifydigest, subclone sequencePvuII(2) (2) 序列中的點(diǎn)突變：序列中的點(diǎn)突變：2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分33例子：例子：S.pn的的ply146aa缺失的突變序列構(gòu)建缺失的突變序列構(gòu)建肺炎鏈球菌肺炎鏈球菌S.Pn的的ply為一細(xì)胞毒性分子，其為一細(xì)胞毒性分子，其146位位aa缺失后毒性大大減弱。構(gòu)建突變體作為疫苗：缺失后毒性大大減弱。構(gòu)建突變體作為疫苗：首先設(shè)計(jì)首先設(shè)計(jì)4 4個(gè)引物：個(gè)引物：(M1(M1和和M2M2完全重疊完全重疊) )P1: 5-P1: 5-CGGGATCCCGGGATCCATGGCAAATAAAGCAGTAAATG-3ATGGCAAATAAAGCAGTAAATG-3 BamH IBamH IP2: 5-P2: 5-CCGCTCGACCGCTCGAGCAAGCATTCTCCTCTCCTAGTC-3GCAAGCATTCTCCTCTCCTAGTC-3 Xho I Xho IM1: 5-GGTCAATAATGTCCCA-AGAATGCAGTATG-3M1: 5-GGTCAATAATGTCCCA-AGAATGCAGTATG-3M2: 5-CATACTGCATTCT-TGGGACATTATTGACC-3 M2: 5-CATACTGCATTCT-TGGGACATTATTGACC-3 2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分34突變位點(diǎn)突變位點(diǎn)M2M2M1M1P2P2P1P1555555333355為酶切位點(diǎn)序列為酶切位點(diǎn)序列1.1.以基因組以基因組DNADNA為模板，以為模板，以P1P1和和M1M1為引物擴(kuò)增出為引物擴(kuò)增出plyply上游片斷，以上游片斷，以P2P2和和M2M2為引物擴(kuò)增出為引物擴(kuò)增出plyply下游片斷；下游片斷；2.2.以上下游片斷為模板，以以上下游片斷為模板，以P1P1和和P2P2為引物擴(kuò)出全長(zhǎng)；為引物擴(kuò)出全長(zhǎng)；3.3.酶切后克隆到質(zhì)粒中保存。酶切后克隆到質(zhì)粒中保存。2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分35ABP1P2P3P4PCRABPCRAB3.3.引入大片段缺失引入大片段缺失2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分364.4.多位點(diǎn)突變多位點(diǎn)突變策略：多次重疊策略：多次重疊PCRPCR關(guān)鍵：重疊引物設(shè)計(jì)關(guān)鍵：重疊引物設(shè)計(jì)( (每對(duì)均需部分重疊，方向相反每對(duì)均需部分重疊，方向相反) )。2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分37基基本本操操作作2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分38（三）（三）DNADNA的微量分析的微量分析 PCR PCR技術(shù)敏感度很高，理論上只要存在技術(shù)敏感度很高，理論上只要存在1 1分子的模板，就可以獲得目的片段，是分子的模板，就可以獲得目的片段，是DNADNA微微量分析的最好方法。量分析的最好方法。 實(shí)際工作中，實(shí)際工作中，1滴血液、滴血液、1根毛發(fā)或根毛發(fā)或1個(gè)細(xì)個(gè)細(xì)胞已足以滿(mǎn)足胞已足以滿(mǎn)足PCR的檢測(cè)需要。的檢測(cè)需要。2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分39（四）（四）mRNAmRNA的含量分析的含量分析 用于用于RNA檢測(cè)的常用字方法有原位雜交、點(diǎn)雜檢測(cè)的常用字方法有原位雜交、點(diǎn)雜交、交、Northern印跡雜交及核酸酶保護(hù)試驗(yàn)等，都難印跡雜交及核酸酶保護(hù)試驗(yàn)等，都難以檢測(cè)低豐度的以檢測(cè)低豐度的mRNA，且操作繁瑣。，且操作繁瑣。 在敏感性方面，在敏感性方面，RT- PCR用于用于mRNA定量分析定量分析要遠(yuǎn)高于上述傳統(tǒng)方法。要遠(yuǎn)高于上述傳統(tǒng)方法。RT-PCRRT-PCR用于用于mRNAmRNA定量分析面臨的問(wèn)題：定量分析面臨的問(wèn)題： 在第一步合成在第一步合成cDNA的反應(yīng)中會(huì)造成一些誤差，的反應(yīng)中會(huì)造成一些誤差，但是更重要和顯著的誤差是由但是更重要和顯著的誤差是由PCR反應(yīng)本身造成。反應(yīng)本身造成。2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分40u用于定量用于定量PCRPCR分析的兩種技術(shù)：分析的兩種技術(shù)：競(jìng)爭(zhēng)性定量競(jìng)爭(zhēng)性定量PCRPCR： 在反應(yīng)前加入外源標(biāo)準(zhǔn)品在反應(yīng)前加入外源標(biāo)準(zhǔn)品RNA作為內(nèi)參照；須使作為內(nèi)參照；須使用與樣品用與樣品RNA同樣的引物識(shí)別序列，但產(chǎn)物的大小不同樣的引物識(shí)別序列，但產(chǎn)物的大小不同，以在電泳時(shí)區(qū)別開(kāi)。同，以在電泳時(shí)區(qū)別開(kāi)。 屬反應(yīng)終點(diǎn)分析方法，需用系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)屬反應(yīng)終點(diǎn)分析方法，需用系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)RNA做做成標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品成標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品RNA的含量應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。的含量應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PCR(real time PCR)PCR(real time PCR)： 是近年發(fā)展起來(lái)的一種是近年發(fā)展起來(lái)的一種RNA微量分析技術(shù)；精確微量分析技術(shù)；精確度高，結(jié)果明確，操作容易，能進(jìn)行高通量檢測(cè)。度高，結(jié)果明確，操作容易，能進(jìn)行高通量檢測(cè)。 2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分41u實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PCRPCR的基本原理的基本原理 在反應(yīng)中引入了熒光標(biāo)記分子，在反應(yīng)過(guò)程中在反應(yīng)中引入了熒光標(biāo)記分子，在反應(yīng)過(guò)程中對(duì)反應(yīng)過(guò)程中每一時(shí)刻的產(chǎn)物量進(jìn)行實(shí)時(shí)分析。對(duì)反應(yīng)過(guò)程中每一時(shí)刻的產(chǎn)物量進(jìn)行實(shí)時(shí)分析。 不同公司的儀器和反應(yīng)系統(tǒng)所用的熒光報(bào)告系不同公司的儀器和反應(yīng)系統(tǒng)所用的熒光報(bào)告系統(tǒng)不同：統(tǒng)不同：Molecular Probe 公司的公司的SYBR Green 系統(tǒng)系統(tǒng)Perkin-Elmer/ABD公司的公司的TaqMan系統(tǒng)系統(tǒng)Invitrogen公司的公司的Molecular Beacons系統(tǒng)系統(tǒng)2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分42 PCR擴(kuò) 增 時(shí) ，擴(kuò) 增 時(shí) ，TaqTaq酶的酶的5- 35- 3外外切酶活性切酶活性將探針酶切將探針酶切降解，使探針上的降解，使探針上的熒熒光基團(tuán)光基團(tuán)和和淬滅基團(tuán)淬滅基團(tuán)分分離，使離，使熒光基團(tuán)在激熒光基團(tuán)在激發(fā)光作用下發(fā)出發(fā)光作用下發(fā)出熒光；熒光； 每擴(kuò)增一條每擴(kuò)增一條DNA鏈就有一個(gè)熒光分子鏈就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物產(chǎn)物形成完全同步。形成完全同步。2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分43思考題思考題 31.1.實(shí)時(shí)熒光實(shí)時(shí)熒光PCRTaqMan技術(shù)技術(shù)RQ5353ExcitationRQQRQRExcitation實(shí)時(shí)熒光實(shí)時(shí)熒光PCRPCRTaqMan技術(shù)技術(shù)2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分44TaqManTaqMan技術(shù)技術(shù)的優(yōu)、缺點(diǎn)的優(yōu)、缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：雜交效率高雜交效率高缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：(2) (2) 探針的水解依賴(lài)于探針的水解依賴(lài)于TaqTaq的酶外切活性，的酶外切活性， 故受酶性能和試劑質(zhì)量影響；故受酶性能和試劑質(zhì)量影響；(3) (3) 檢測(cè)點(diǎn)突變的能力相對(duì)不足。檢測(cè)點(diǎn)突變的能力相對(duì)不足。(1) (1) 淬滅難以徹底，本底較高；淬滅難以徹底，本底較高；2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分45RQExcitationRQQRExcitationEmission2.2.實(shí)時(shí)熒光實(shí)時(shí)熒光PCRPCR分子信標(biāo)分子信標(biāo)技術(shù)技術(shù)2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分46分子信標(biāo)分子信標(biāo)技術(shù)技術(shù)的優(yōu)、缺點(diǎn)的優(yōu)、缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：熒光本底低。熒光本底低。熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)極熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)極端靠近；淬滅基團(tuán)為非熒光物質(zhì)，不端靠近；淬滅基團(tuán)為非熒光物質(zhì)，不存在對(duì)供體熒光測(cè)定的干擾，熒光淬存在對(duì)供體熒光測(cè)定的干擾，熒光淬滅徹底。滅徹底。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：設(shè)計(jì)時(shí)需要同時(shí)考慮探針和臂的熔點(diǎn)，設(shè)計(jì)時(shí)需要同時(shí)考慮探針和臂的熔點(diǎn)，增加了難度。增加了難度。2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分47SYBR Green ISYBR Green I是一種只與雙鏈?zhǔn)且环N只與雙鏈DNADNA小小溝結(jié)合的染料，當(dāng)它與溝結(jié)合的染料，當(dāng)它與DNADNA雙鏈結(jié)合時(shí)，發(fā)雙鏈結(jié)合時(shí)，發(fā)出熒光；從出熒光；從DNADNA雙鏈上釋放出來(lái)時(shí)，熒光信雙鏈上釋放出來(lái)時(shí)，熒光信號(hào)急劇減弱。號(hào)急劇減弱。 因此，在一個(gè)體系內(nèi)，其信號(hào)強(qiáng)度代因此，在一個(gè)體系內(nèi)，其信號(hào)強(qiáng)度代表了雙鏈表了雙鏈DNADNA的量。的量。3.3.實(shí)時(shí)熒光實(shí)時(shí)熒光PCRPCRSYBR Green I SYBR Green I 技術(shù)技術(shù)2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分48SYBRSYBR GreenGreen I I熒光染料的作用原理熒光染料的作用原理 2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分49SYBR Green I SYBR Green I 技術(shù)的優(yōu)、缺點(diǎn)技術(shù)的優(yōu)、缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：技術(shù)簡(jiǎn)單、方便，而且可適用于任技術(shù)簡(jiǎn)單、方便，而且可適用于任何何PCRPCR反應(yīng)；反應(yīng)；缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：非特異性結(jié)合。非特異性結(jié)合。 SYBR Green I 也可也可與非特異性的雙鏈結(jié)合如引物二聚體，與非特異性的雙鏈結(jié)合如引物二聚體，非特異性非特異性PCRPCR擴(kuò)增產(chǎn)物等擴(kuò)增產(chǎn)物等2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分50熒光曲線 隨著隨著PCRPCR反應(yīng)的進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物不斷累積，熒反應(yīng)的進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物不斷累積，熒光信號(hào)強(qiáng)度不斷增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一次光信號(hào)強(qiáng)度不斷增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一次熒光強(qiáng)度信號(hào)，得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖熒光強(qiáng)度信號(hào)，得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖4.4.實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量PCRPCR的定量原理的定量原理2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分51熒光閾值熒光閾值 在熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長(zhǎng)期設(shè)定一個(gè)熒光強(qiáng)在熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長(zhǎng)期設(shè)定一個(gè)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)度標(biāo)準(zhǔn)( (即即PCRPCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增產(chǎn)物量的標(biāo)準(zhǔn)) )。閾值線閾值線u實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量PCRPCR的兩個(gè)重要概念的兩個(gè)重要概念2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分52 CtCt值的概念值的概念 Ct Ct值的定義是值的定義是PCRPCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物( (熒光熒光信號(hào)信號(hào)) )到達(dá)閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。到達(dá)閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。C(t) 值值C(t) 值值18.12 +/0.04-閾值線閾值線2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分53模板起始濃度越高，模板起始濃度越高，Ct值越小值越小CtCt值與模板起始濃度的關(guān)系值與模板起始濃度的關(guān)系哪個(gè)樣品濃度高？哪個(gè)樣品濃度高？2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分54CtCt值的重現(xiàn)性極好值的重現(xiàn)性極好為什么用為什么用Ct值而不用終點(diǎn)相對(duì)熒光強(qiáng)度定量？值而不用終點(diǎn)相對(duì)熒光強(qiáng)度定量？2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分55閾值的選擇閾值的選擇 熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可設(shè)定在指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置一個(gè)值，它可設(shè)定在指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上；上； 缺省設(shè)置一般是缺省設(shè)置一般是3-153-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的標(biāo)準(zhǔn)偏差的1010倍。倍。 但實(shí)際應(yīng)用時(shí)要結(jié)合擴(kuò)增效率、線形回歸但實(shí)際應(yīng)用時(shí)要結(jié)合擴(kuò)增效率、線形回歸系數(shù)等參數(shù)來(lái)綜合考慮系數(shù)等參數(shù)來(lái)綜合考慮 2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分56熒光強(qiáng)度循環(huán)數(shù)曲線熒光強(qiáng)度循環(huán)數(shù)曲線 初始模板量對(duì)數(shù)初始模板量對(duì)數(shù)C(T)循循環(huán)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線環(huán)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線.未知未知10410310610510210 定量原理：定量原理：利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品作出標(biāo)利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)曲線, ,通過(guò)未知樣品的通過(guò)未知樣品的CtCt值值, ,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始濃度。樣品的起始濃度。2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分57unknown104103Unknown contains 3108 copies 首先確定未知樣品的首先確定未知樣品的 C(t)C(t)值，借助標(biāo)準(zhǔn)曲線由未值，借助標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的知樣品的C(t)C(t)值反推出其初始量值反推出其初始量得到未知樣品初始得到未知樣品初始量絕對(duì)值。量絕對(duì)值。2022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分582022年年2月月11日日21時(shí)時(shí)59分分59 2. 2.衡量衡量PCRPCR好壞的參數(shù)好壞的參數(shù)主要有哪些？一般來(lái)說(shuō)主要有哪些？一般來(lái)說(shuō)好的結(jié)果如何體現(xiàn)？好的結(jié)果如何體現(xiàn)？思考題：思考題： 3. 3. 以以TaqMan技術(shù)技術(shù)為例，簡(jiǎn)述為例，簡(jiǎn)述實(shí)時(shí)熒光實(shí)時(shí)熒光PCRPCR的的原理。原理。 1.PCR 1.PCR過(guò)程中的過(guò)程中的DNADNA模板變性、模板與引物退模板變性、模板與引物退火、引物延伸火、引物延伸3 3步的步的溫度設(shè)置溫度設(shè)置一般大致是多少？要一般大致是多少？要考慮的主要因素是什么？考慮的主要因素是什么？