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1、幾種測定生物大分子分子量方法的比較摘要：生物大分子是指核酸(多核苷酸)、蛋白質(多肽)、碳水化合物(葡聚糖或多糖)和脂類等。因為分子量小于500的單體可以通過聚合作用形成的大分子。測定生物大分子分子量方法是生物研究的核心之一，分子量是多肽、蛋白質、核酸、酶、多糖以及脂類等鑒定中的首要參數。當前醫(yī)學，藥學及生物科學學科之間交叉滲透為測定生物大分子分子量提供了更多的契機，本文對測定生物大分子分子量的方法：生物質譜法，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠滲透色譜法等技術的原理及優(yōu)缺點進行綜述。關鍵字：生物大分子 分子量測定 蛋白質 多肽 21世紀是生命科學的世紀，隨著人類基因組，水稻基因組等的測序基本完成
2、，蛋白質和結構基因組研究也迅速發(fā)展。負責生命活動的是生物大分子，生物大分子之間的相互作用構成了生命活動的基礎，因此，測定生物大分子的分子量，深入了解生物大分子的結構功能是掌握生命活動的關鍵。生物大分子是細胞的基本結構和功能單位,也是研究生命現(xiàn)象中的物質基礎.生物體內的分子組成如何?哪些分子才算生物大分子?這些大分子有沒有分子量的下限?怎么去測定生物大分子分子量？要想知道這些答案，需要多方位，運用多種方法進行研究。1. SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳方法可對蛋白質的組分進行分離，并可精確測得蛋白質的分子量，常用的方法為SDSPAGE不連續(xù)系統(tǒng)。SDS聚丙烯酰胺凝膠電
3、泳的基本原理：聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺和N，-亞甲基雙丙烯酰胺經共聚合而成，此聚合過程是由四甲基乙二胺和過硫酸胺激發(fā)的，被激活的單體和未被激活的單體開始了多聚鏈的延伸，正在延伸的多聚鏈也可以隨機地接上雙丙烯酰胺，使得多聚鏈交叉互連成為網狀立體結構，最終多聚鏈聚合成凝膠狀。在一定條件下，蛋白質，多肽在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和核酸在聚丙烯酰胺凝膠電泳及瓊脂糖凝膠電泳中，其分子量與電泳遷移率符合的關系。在精確測定與計算相對遷移率時，要求分別測定樣品區(qū)帶中心及指標劑染料區(qū)帶中心(通常插入銅絲作為標記)與凝膠頂端(聚丙烯酰胺凝膠電泳)或點樣孔(瓊脂糖凝膠電泳)間的距離。SDS是十二烷基硫酸鈉的簡稱，它是
4、一種陰離子表面活性劑，加入到電泳系統(tǒng)中能使蛋白質的氫鍵和疏水鍵打開，并結合到蛋白質分子上（在一定條件下，大多數蛋白質與SDS的結合比為1.4gSDS/1g蛋白質），使各種蛋白質-SDS復合物都帶上相同密度的負電荷，其數量遠遠超過了蛋白質分子原有的電荷量，從而使其電泳遷移率只取決于分子大小這一因素，根據標準蛋白質分子量的對數和遷移率所作的標準曲線，可求得未知物的分子量。SDS -PAGE電泳法是實驗室中應用最普遍的方法,分為還原電泳和非還原電泳,非還原電泳中二硫鍵未打開,還原電泳中二硫鍵被還原,蛋白質分子能充分伸展,兩者相比,還原電泳的測定結果更為準確。優(yōu)缺點：實驗成本較低，樣品用量少，時間短，
5、操作簡單，儀器設備也相對很簡單，一套電泳裝置即可，分辨率高。但是精確程度相對較低，好的電泳圖譜需要一定的技術。2. 凝膠滲透色譜（GPC）GPC是一種用溶劑作流動相，多孔性填料或凝膠作為分離介質的柱色譜，主要根據溶液中分子體積( 或稱分子的流體力學體積 )大小的不同作為分離基礎，使被分離樣品按分子量大小先后流出色譜柱。凝膠床由多孔溶脹凝膠組成，當樣品通過色譜柱時，物質在柱中受到固定相的阻滯作用，分子量大的不能滲入凝膠顆粒，只能沿溶脹凝膠顆粒間的孔隙隨溶劑流動，受到的阻滯作用小，移動速度快，流程短而先流出色譜柱；分子量小的將滲入凝膠顆粒，受到的阻滯作用大，移動流速慢，流程長而較后流出色譜。優(yōu)缺點
6、：凝膠滲透色譜法分離速度快，分析時間短，重復性好，進樣量少，自動化程度高，但設備投入大，價格較高。3.質譜技術 3.1 MALDITOF質譜技術對熱敏感的化合物進行快速加熱，可以避免其受熱分解而轉入氣相，所以進行質譜法分析，采用MALDITOF法尤為適用，測定的化合物相對分子質量可達數十萬。MALDIT0F的應用范圍廣泛，包括有機小分子、有機高聚物和生物大分子。它在生物大分子領域的應用尤為引人注目。 基質輔助激光解吸附質譜技術是將分析物分散在基質分子中并形成晶體，當用激光照射晶體時，由于基質分子經輻射所吸收的能量，導致能量蓄積并迅速產熱，從而使基質晶體升華，致使基質和分析物膨脹并進入氣相。MA
7、LDI所產生的質譜圖多為單電荷離子，因而質譜圖中的離子與多肽和蛋白質的質量有一一對應關系。TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據檢測器的飛行時間不同，導致測定離子的質荷比（M/Z）與離子的飛行時間成正比。MALDI產生的離子常用飛行時間(timeofflight，TOF)檢測器來檢測，理論上講，只要飛行管的長度足夠，TOF檢測器可檢測分子的質量數是沒有上限的，因此MALDITOF質譜很適合對蛋白質、多肽、核酸和多糖等生物大分子分子量進行測量測。3.1.1測定多肽與蛋白質分析生物工程產品中多肽與蛋白質是最主要的產品類型，對這些生物工程產品進行質量控制，已成為當前一個很重要的課題。M
8、ALDITOF已廣泛用于多肽與蛋白質的準確測定及其純度的評價。傳統(tǒng)的測定，純度及肽圖的方法，應用凝膠電泳及高效液相色譜，這些方法不僅受多種實驗條件(如色譜柱、流動相的選擇等)所限，而且誤差大，往往難以得到令人滿意的結果，且操作十分復雜。應用MALDITOF對生物工程產品進行準確的，純度及質量肽圖進行測定。對一級結構進行確證，得到了直觀、準確(誤差小于0.2)的結果。這方面的報道不勝枚舉，牛碳酸酐酶、蜂毒素、牛胰島素、肌 紅蛋白、胰蛋白酶原等都已經成功測定，測定過程簡便快速。3.1.2測定多糖近年來，人們對糖類化合物的生理功能有了新的認識，糖類化合物繼蛋白質、核酸之后，成為生命科學領域中的又一研
9、究熱點。糖的性質與其大小密切相關，因此糖特別是多糖分布的測定，在糖類化合物的研究和應用中有著重要的意義。傳統(tǒng)的多糖測定方法，如滲透法、黏度法、光散射法、凝膠色譜法等，不僅耗樣多、誤差大或受分子形狀的影響，且各方法所測的性質不同，需要幾種方法配合使用很不方便。而糖本身高極性、難揮發(fā)的性質以及多糖較高的和其的發(fā)散，使糖類物質的質譜表征比較困難。但MALDITOF在這一領域顯示出一定潛力和應用前景。在測定多糖時，往往得不到高質量區(qū)，主要是聚合度低的分子優(yōu)先電離的趨勢抑制高，的多糖離子化過程。用凝膠柱處理過的多糖，分布范圍變小，得到MALDI譜圖效果變好。多糖的正、負離子基質輔助激光解吸電離質譜(MA
10、IDIMS)圖譜已無明顯差別。這意味著寡糖、多糖的離子化過程可能不同于寡糖在激光解吸電離過程，離子的形成主要是中性分子熱蒸發(fā)并隨后形成陽離子化的過程。隨著的增加，這種熱力學解吸過程越來越困難。對高多糖來說，電離主要是依靠激光解吸電離的集合作用完成的，大量基質分子共振吸收激光能量后，通過集合作用使基質和供試品的固體溶液發(fā)生解聚，產生帶有隨機電荷量的分子簇和團粒，并在向真空蒸發(fā)過程中冷卻，留下帶電荷的大供試品離子。這種情況下，正、負離子生成幾率差不多，使得多糖的正、負離子MAlJDTTOF譜比較接近。綜上所述，糖類化合物輔助激光解吸電離的離子化過程與其大小 有關。低時，熱力學過程占主導地位；高時，
11、非熱力學過程占主導地位，這兩種過程的差異，導致了寡糖和多糖正負離子MALDITOF譜圖的差異。此結論顯示出MALDITOF對多糖的應用還需探索。3.1.3測定核苷酸核苷酸也是具有極其重要生理功能的大分子物質，極性大，熱不穩(wěn)定，與蛋白質類似，MALDITOF在對核苷酸的測定方面，顯示巨大潛力。用酶解法與MALDITOF分析結合，可測定較多堿基的核苷酸的堿基序列。MALDITOF對固相合成法合成的大分子核苷酸進行了測定。準確表征了其合成的功效。MALDlTOF與傳統(tǒng)的磁式質譜相比，其特點有可實現(xiàn)納秒量級的瞬時記錄，經過多次瞬時記錄累加得到的質譜圖，其信噪比得到了極大的改善。具有高的離子流通率，因而
12、獲得高的靈敏度，僅需約lpmol的供試品即可測定。原則上沒有范圍限制。質譜分析用于蛋白質等生物活性分子的研究具有如下優(yōu)點：很高的靈敏度能為亞微克級試樣提供信息，能最有效地與色譜聯(lián)用，適用于復雜體系中痕量物質的鑒定或結構測定，同時具有準確性、易操作性、快速性及很好的普適性，提供樣品分子的相對分子質量和豐富的結構信息，可用于大規(guī)模高通量分離分析和檢測。它以其高靈敏度、低供試 品消耗量、能確立分子式等優(yōu)點，在現(xiàn)代儀器分析中發(fā)揮著 越來越重要的作用。綜上所述，MALDITOF作為一個新技術，它已經成為測定生物大分子的重要方法，尤其是蛋白組的研究中，可以鑒定細胞有哪些蛋白質組，是不可缺少的方法3.2 電
13、噴霧離子化質譜技術電噴霧電離質譜技術(electrospray ionization mass spec trometry，ESIMS)是在毛細管的出口處施加一高電壓，所產生的高電場使從毛細管流出的液體霧化成細小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發(fā)，液滴表面的電荷強度逐漸增大，最后液滴崩解為大量帶一個或多個電荷的離子，致使分析物以單電荷或 多電荷離子的形式進入氣相。電噴霧離子化的特點是產生高電荷離子而不是碎片離子，使質量電荷比（m/z）降低到多數質量分析儀器都可以檢測的范圍，因而大大擴展了分子量的分析范圍，離子的真實分子質量也可以根據質荷比及電荷數算出。 電噴霧電離質譜的優(yōu)勢在于它能方便地與多種分離技術聯(lián)
14、合使用，如液質聯(lián)用(LCMS)是將液相色譜與質譜聯(lián)合而達到檢測大分子物質的目的。優(yōu)缺點：（1）對樣品的消耗少，不會造成樣品的大量浪費（2）對樣品分子質量測試的靈敏度，分辨力和準確度都相當高（3）能夠方便地與多種分離技術聯(lián)用，如毛細管電泳，高效液相色譜等，是解決非揮發(fā)性，熱不穩(wěn)定性，極性強的復雜組分化合物的定性定量的高靈敏度檢測方法。3.3 FT Orbitrap（傅立葉變換靜電場軌道阱）在1999年的ASMS上，質譜學家Alexander Makarov 報告用一種新的質量分析器靜電場軌道阱進行高分辨和精確質量數測量。第一臺Orbitrap質譜儀誕生于2001年，在愛丁堡大學的實驗室使用。Or
15、bitrap 是近20多年來質量分析器的突破性技術。這是一種采用新結構 質量分析器和突破性技術的質譜儀器，離子在質量分析器里作軌道旋轉和振蕩，Orbitrap 質譜儀的檢測方式是通過離子的旋轉振蕩產生的鏡像電流，經微分放大后由FT變換器轉換為各離子的振蕩頻率，最后計算出分子離子的質核比(m/z)。這種通過頻率來測量質核比的方式，可以得到超高的分辨率，Orbitrap的質量分辨率介于FTICR（傅立葉變換離子回旋共振質譜）和TOF（飛行時間質譜)之間,最高分辨率可達到10萬。Orbitrap的工作原理：質量分析器形狀如同仿棰體，由仿棰形中心內電極和左右2個外仿棰半電極組成。Orbitrap對離子
16、的操作步驟分為離子捕獲、旋轉運動、軸向振動和鏡像電流檢測。儀器工作時，在中心電極逐漸加上直流高壓，在Orbitrap內產生特殊幾何結構的靜電場。當離子進入到Orbitrap室內后，受到中心電場的引力，即開始圍繞中心電極作圓周軌道運動，m/z 高的離子有較大的軌道半徑。同時離子受到垂直方向的離心力和水平方向的推力，而沿中心內電極作水平和垂直方向的震蕩。外電極除限制離子的運行軌道范圍，同時檢測由離子振蕩產生的感應電勢，其中水平震蕩的頻率和分子離子的質荷比(m/z)的關系可由以下數學公式來描述，可見軸向頻率與離子的初始狀態(tài)是無關的,這種不相關性造就 Orbitrap 具有高分辨率和高質量準確度的特性
17、。從 Orbitrap 的每個外電極輸出的時域信號經過微分放大器放大后由快速傅立葉轉換變成頻域譜，頻域譜再進而轉換為質譜，然后在 Xcalibur 質譜軟件中處理輸出。質譜方法是蛋白質組學研究的關鍵技術，質譜數據可提供蛋白質的分子量、氨基酸序列、翻譯后修飾及位點、差異蛋白比較等信。LTQ Orbitrap Velos 可對蛋白質酶切后的眾多肽段的精確分子量和二級質譜同時測定，再經過數據庫檢索，得到蛋白質組的高通量鑒定。Orbitrap 質量分析器使得代謝組學的整體研究手段得以進一步簡化。例如，LTQ Orbitrap 的分辨率使得色譜分離過程大大精簡。生物樣品可以被直接引入測定。4. 沉降-擴
18、散法測定分子量(S-D法)大分子在溶液里沉降所受溶劑分子的阻力和它們在溶液里擴散時所受阻力相同時，沉降到達穩(wěn)速狀態(tài)?？傻玫絊vedberg公式:M:分子量 T:溶質偏微比容 溶液密度 S:溶質沉降系數T:絕對溫度 R:氣體擴散常數 D.溶質擴散系數將相同實驗條件下c濃度，溫度)實驗測出的S, D,，P值代入公式，求出Mo粘度測定:Ubbelohde粘度計，測定樣品對水的相對粘度。密度測定:比重瓶法(lOml)。偏微比容測定:比重瓶法(lOml)。稱量精確至，溶液濃度準確至。依據公式:，溶液比容，溶劑比容，表觀偏微比容)。沉降系數測定同前。擴散系數測定:用032-0381雙槽毛細管型合成界面池。
19、樣品量0.15m1，另一側加滿溶劑。測定溫度與S值測定時相同實驗過程中，嚴格控制溫度恒定。轉速視樣品分子大小而定，一般為6000-7000r.P.m。記錄界面剛合成時的時間、相角、定時拍攝Schlieren圖譜，拍攝間隔先緊后疏。拐點法計算結果:照片上圖形(圖1)縱軸以Y表示，橫軸以X表示。F為X軸向的放大倍數。從照片上量出Y最大值(峰高)，根據Yi= Y最大，求出，量出對應于的兩個值(拐點)間距離。以對時間作圖，將求得斜率代入公式，得到D值。圖1 0.5葡聚糖界面擴散實驗之Schlieren圖譜總結SDS -PAGE 電泳法是實驗室中應用最普遍的方法,成本低，操作簡單，但是精確程度相對較低，
20、高質量的電泳圖譜需要一定的技術。高效凝膠過濾色譜測定分子量時，對標準蛋白質與待測蛋白質分子形狀的一致性要求較高 ,只有兩者的分子形狀一致時(均為球型), 測定結果才可靠；如分子形狀差別較大，測定結果不太準確，它最大的特點就是重復性好，但是價格比較昂貴。MALDlTOF具有很高的靈敏度能為亞微克級試樣提供信息，能最有效地與色譜聯(lián)用，準確度高分子量范圍大，掃描速度快，儀器結構，簡單分辨率低的特點。但是TOF 的實際操作分辨率 (30000) 和其它性能是這些高分辨質譜中相對較低的，且測量結果的準確性受操作條件影響大，主要表現(xiàn)為需要恒定的環(huán)境溫度，樣品分析時要添加內標實時校正,相對麻煩。相比Orbi
21、trap的這種儀器，儀器比較大型，搬運比較困難，維護成本高。除了MALDlTOF，的優(yōu)點，Orbitrap還具備體積比較小，方便攜帶使用，多功能，易操作，矯正周期長，基本一個月矯正一次，但是其昂貴的價格、高額的運轉費，Orbitrap使得這種高端質譜儀難以在各領域，尤其被作為常規(guī)分析儀器被推廣，一直是為少數專家所掌握和用于研究性實驗室的高端應用。電噴霧質譜法是目前測定蛋白質分子量最準確的方法之一。比如牛胰蛋白酶的實際分子量是23290Da，質譜的測定結果為 23293Da，系統(tǒng)誤差在 0.02以內,但是質譜儀價格昂貴，對于大多數實驗室來說無法購買使用。沉降-擴散法測定分子量(S-D法)的優(yōu)點是
22、實驗成本較低，樣品用量少，時間短，操作簡單，儀器設備也相對很簡單，一套裝置即可，分辨率高，但缺點是精確程度相對較低。參考文獻1 安超,薛文嬌,馬賽箭,丁浩.高效凝膠色譜法同時測定普魯蘭多糖生物合成過程中分子量和含量J.食品研究與開發(fā),2018,39(07):143-148.2 劉子華,于學玲,毛赟赟,樊彩云,李鳳林.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測抗氧化低密度脂蛋白抗體的分子量J.中國原子能科學研究院年報,2017(00):222.3 徐銀祥. 低分子量肝素鈣口服制劑的制備及其生物利用度的測定D.山東大學,2015.4 王喜云. EMPLA分子量與接枝率的測定及其細胞生物相容性研究D.重慶大學,
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