《基因工程的基本操作程序》.ppt

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1、基因工程的基本操作程序,,,原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)(補(bǔ)充內(nèi)容）,,,,,,,非編碼區(qū),,非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn),啟動子,終止子,,不編碼蛋白質(zhì)。,：編碼蛋白質(zhì) ,連續(xù)不間斷,編碼區(qū),非編碼區(qū),原核細(xì)胞的 基因結(jié)構(gòu),,,調(diào)控遺傳信息表達(dá),上 游有啟動子，下游有終止子,,,,,,,,,真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)（補(bǔ)充內(nèi)容）,,,,,,編碼區(qū),與RNA聚合酶 結(jié)合位點(diǎn),,,內(nèi)含子,外顯子,啟動子,終止子,編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,真核細(xì)胞的 基因結(jié)構(gòu),,編碼區(qū),非編碼區(qū),,外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列 內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列,：有調(diào)控作用,上游有啟動子，下游有終止子,

2、非編碼序列：,包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子,,基因工程的基本操作程序,,,,1、目的基因的獲取,2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建,3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,4、目的基因的檢測與鑒定,目前被較廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、人胰島素基因、人干擾素基因、種子貯藏蛋白基因、植物抗病基因等。,一、目的基因的獲取,目的基因,1.目的基因主要是指______________________ 也可以是,編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因,,具有調(diào)控作用的因子,2、獲取目的基因的常用方法,（1）從基因文庫中獲取,（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增,（3）人工合成,概念：基因文庫 （gene library）,將含有某種生物不同基

3、因的許多DNA片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲存,各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫(gene library),（1）從基因文庫中獲取,,基因組文庫: 基因文庫中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫叫做基因組文庫. 部分基因文庫: 基因文庫中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫叫做部分基因文庫.,,基因組文庫與部分基因文庫的關(guān)系,提取某種生物的全部DNA,用適當(dāng)?shù)南拗泼盖?一定大小的DNA片段,將DNA片段與載體連接,導(dǎo)入受體菌中儲存,,,基因組文庫,,基因文庫的構(gòu)建方法之一,直接分離法(鳥槍法),某種生物的單鏈mRNA,單鏈互補(bǔ)DNA,雙鏈cDNA片段,導(dǎo)入受體菌中儲

4、存,與載體連接,,,,,cDNA文庫,逆轉(zhuǎn)錄酶,DNA聚合酶,cDNA文庫的構(gòu)建----反轉(zhuǎn)錄法,基因組文庫和部分基因組文庫(cDNA文庫)比較,.如何從基因文庫中得到所需要的基因？,依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。,如：根據(jù)基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色體上的位置 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA 基因的翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì) 等特性。,尋根問底：為什么要構(gòu)建基因文庫？直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎？,構(gòu)建基因文庫是獲取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通過PCR方式從含有該基因的生物的DNA中，直接獲得，也可以通過反轉(zhuǎn)錄，用P

5、CR方式從mRNA中獲得，不一定要構(gòu)建基因文庫。 但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想從一種生物體內(nèi)獲得許多基因，或者想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同，或者想知道一種生物在個(gè)體發(fā)育的不同階段表達(dá)的基因有什么不同，或者想得到一種生物的全基因組序列，往往就需要構(gòu)建基因文庫。,2.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,PCR多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 是一項(xiàng)生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。通過此技術(shù)，可獲取大量的目的基因。,PCR技術(shù),原理： 前提： 原料 方式 結(jié)果：,DNA復(fù)制,一段已知目的基因的核苷酸序列,：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)

6、的次數(shù)）,指數(shù),2n,模板DNA；DNA引物；四種脫氧核苷酸； 熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）；離子,使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬倍地?cái)U(kuò)增,過程,變性、退火、延伸三步曲,變性：加熱至9095雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA 退火：冷卻至5560引物與部分模板的單鏈DNA的特定互補(bǔ)部位相配對和結(jié)合 延伸：加熱至7075以目的基因?yàn)槟０澹铣苫パa(bǔ)的新DNA鏈,2、具體過程,PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,,相同點(diǎn),不同點(diǎn),3. 人工合成,根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA,蛋白質(zhì)的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列,推測,推測,,,目的基因,化學(xué)合成,,基因較小，核苷酸序列已知，利用DNA

7、合成儀人工合成,二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建核心,,質(zhì)粒,DNA分子,,,,一個(gè)切口 兩個(gè)黏性末端,兩個(gè)切口 獲得目的基因,DNA 連接酶,重組DNA分子（重組質(zhì)粒）,,同一種 限制酶,目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過程，實(shí)際上是不同來源的基因重組的過程。,目的： 組成：,1、使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代， 2、使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。,它們各自的作用是什么?,目的基因+啟動子+終止子+標(biāo)記基因+復(fù)制原點(diǎn),啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì) 終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，

8、能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄 標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來,,載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu) 用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵 啟動子、終止子對于目的基因表達(dá)必不可少 目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。,注意,基因表達(dá)載體的構(gòu)建需要考慮的因素,基因的特點(diǎn) 選擇強(qiáng)啟動子或組織特異性啟動子 選擇標(biāo)記基因,三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,（一）轉(zhuǎn)化：,（二）方法,

9、,將目的基因?qū)?植物細(xì)胞,將目的基因?qū)?動物細(xì)胞,將目的基因?qū)?微生物細(xì)胞,,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,基因槍法,花粉管通道法,顯微注射法,感受態(tài)細(xì)胞法,目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在 受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過程,受體細(xì)胞,穩(wěn)定,表達(dá),1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法： （1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌特點(diǎn)：,易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力,原理：Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。,過程：,（2）基因槍法 （3）花粉管通道法,2、將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞 方法：顯微注射法 程序：,目的基因表達(dá)載體提純 取卵

10、（受精卵） 顯微注射 受精卵 新性狀動物,,,,3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞 原核生物特點(diǎn)：繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少 方法：感受態(tài)細(xì)胞法,用Ca2+處理細(xì)胞 感受態(tài)細(xì)胞 表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合 感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子,,,,四、目的基因的檢測與鑒定,檢查是否成功,（一）、檢測,1、檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因 (關(guān)鍵步驟),首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA 用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針 使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中,（1）方法:,DNA分子雜交,（2）過程:,知識

11、延伸DNA分子雜交技術(shù),該方法是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，把互補(bǔ)的雙鏈DNA解開，把單股的DNA小片段用同位素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑等進(jìn)行標(biāo)記，之后同被檢測的DNA中的同源互補(bǔ)序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因。,歸納步驟,（二）、鑒定（個(gè)體生物學(xué)水平）,2、檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,3、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,方法:,分 子 雜 交,方法:,抗原抗體雜交,過程: 用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA,歸納步驟,(四)目的基因的檢測與鑒定,檢查是否成功,檢測,鑒定,,檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA 上是否插入了目的基因,檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,方法,方法,方法,DNA分子雜交,分子雜交（注意與上不同之處）,抗原抗體雜交,歸納: 基因工程的基本操作程序,獲取目的基因 從基因文庫 利用PCR 化學(xué)方法人工合成 構(gòu)建基因表達(dá)載體 目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法、感受態(tài)細(xì)胞法 目的基因的檢測與鑒定 檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯 鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,