《基因工程的基本操作程序》

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1、1.2 基因工程的基本操作程序,,,,,1、目的基因的獲取,2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建,3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,4、目的基因的檢測(cè)與鑒定,基因工程基本操作的四個(gè)步驟,有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。,使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并可進(jìn)行遺傳、表達(dá)和發(fā)揮作用,載體進(jìn)入受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)，才能實(shí)現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。,才能確定目的基因是否真正在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá)。,一、目的基因的獲取,(一)、目的基因主要是______________________,編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因,請(qǐng)舉出三個(gè)以上的例子,（二）、獲取目的基因的常用方法有哪些?,1、從基因

2、文庫(kù)中獲取,2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增,3、人工合成,一、目的基因的獲取,（一）從基因文庫(kù)中直接獲取,1.基因文庫(kù)：,2.基因文庫(kù)的分類(lèi):按外源DNA片段的來(lái)源分類(lèi),種類(lèi),,基因組DNA文庫(kù)：含有一種生物的全部基因,部分基因文庫(kù)：只包含了一種生物的部分基因， 如：cDNA文庫(kù),3.基因文庫(kù)的目的,為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。,4.獲取目的基因的根據(jù)：,提取某種生物的全部DNA,用適當(dāng)?shù)南拗泼盖?一定大小的DNA片段,將DNA片段與載體連接,導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存,,,基因組文庫(kù),,5.基因文庫(kù)的構(gòu)建方法之一,（1）直接分離法(鳥(niǎo)槍法),某種生物的單鏈mRNA,單鏈

3、互補(bǔ)DNA,雙鏈cDNA片段,導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存,與載體連接,,,,,cDNA文庫(kù),反（逆）轉(zhuǎn)錄酶,DNA聚合酶,反轉(zhuǎn)錄法：cDNA的合成流程圖解,5.基因文庫(kù)的構(gòu)建方法之,,基因組文庫(kù)和部分基因組文庫(kù)(cDNA文庫(kù))比較,2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,四種脫氧核苷酸(dNTP),一對(duì)引物：,熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶）,模板DNA( 需含有目的基因 ),Mg2+(激活劑),條件：,緩沖溶液,一對(duì)寡核苷酸序列：與目的基因的起始段互補(bǔ),一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物,前提：,,過(guò)程,高溫變性（解旋為單鏈）,低溫退火（引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合）,適溫延伸（在Taq酶的作用下合成

4、 與模板互補(bǔ)的DNA雙鏈）,重復(fù)循環(huán),,,,預(yù)變性（增加DNA變性的概率）,,2、具體過(guò)程,PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)), 概念：PCR全稱(chēng)為_(kāi)______________，是一項(xiàng) 在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù),條件：_______________________、 _______________、___________ 、 ___________.等,原理：__________,方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循 環(huán)的次數(shù)）,結(jié)果：,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),體外,特定DNA片段,DNA復(fù)制,四種脫氧核苷酸,一對(duì)引物,DNA聚合酶,指數(shù),2n,使目的基因的

5、片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增,要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提條件）,過(guò)程：,a、DNA變性（90-95）：雙鏈DNA模板 在熱作用下，_____斷裂，形成___________,b、退火（復(fù)性55-65）：系統(tǒng)溫度降低，引 物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下， 合成與模板互補(bǔ)的________。,氫鍵,單鏈DNA,雙鏈,DNA鏈,PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較,堿基互補(bǔ)配對(duì),四種脫氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA在高溫下變性解旋,解旋酶催化,體外復(fù)制,細(xì)胞核內(nèi),熱穩(wěn)定的DNA聚合酶,細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整

6、個(gè)DNA分子,目的基因的mRNA,單鏈DNA (cDNA）,雙鏈DNA (即目的基因),反轉(zhuǎn)錄,合成,,,1）反轉(zhuǎn)錄法： 以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。,蛋白質(zhì)的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列,目的基因,推測(cè),推測(cè),化學(xué)合成,,,,2）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法 ：,3、人工合成的目的基因,二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建 基因工程的核心,1、目的： 所需物質(zhì)：,使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。,它們各自的作用是什么?,2、基因

7、表達(dá)載體的組成：,復(fù)制原點(diǎn)+目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因,它們各自的作用是什么?,啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì) 終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄 標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái),,載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu) 用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷

8、酸二酯鍵 啟動(dòng)子、終止子對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少 目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。,注意,三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,（一）轉(zhuǎn)化：,（二）方法,,將目的基因?qū)?植物細(xì)胞,將目的基因?qū)?動(dòng)物細(xì)胞,將目的基因?qū)?微生物細(xì)胞,,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,基因槍法,花粉管通道法,顯微注射法,感受態(tài)細(xì)胞,目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在 受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過(guò)程,受體細(xì)胞,穩(wěn)定,表達(dá),1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法： （1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌特點(diǎn)：,易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力,原理：Ti質(zhì)粒上的T---DNA可以轉(zhuǎn)移到

9、受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。,過(guò)程：,優(yōu)點(diǎn),（2）基因槍法 （3）花粉管通道法,2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞 方法：顯微注射法 程序：,目的基因表達(dá)載體提純 取卵（受精卵） 顯微注射 受精卵 新性狀動(dòng)物,,,,3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞 原核生物特點(diǎn)：繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少 方法：,用Ca2+處理細(xì)胞 感受態(tài)細(xì)胞 表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合 感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子,,,,四、目的基因的檢測(cè)與鑒定,檢查是否成功,（一）、檢測(cè),1、檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因 (關(guān)鍵步驟),.首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA .用含目的基因

10、的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針 .使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中,（1）方法:,DNA分子雜交,（2）過(guò)程:,歸納步驟,DNA分子雜交示意圖,采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個(gè)單鏈具有互補(bǔ)的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會(huì)結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒(méi)有互補(bǔ)堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。,P15思考與探究,（二）、鑒定（個(gè)體生物學(xué)水平）,2、檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,3、檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,方法:,分 子 雜 交,方法:,抗原抗體雜交,

11、過(guò)程: 用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA,歸納步驟,(四)目的基因的檢測(cè)與鑒定,檢查是否成功,檢測(cè),鑒定,,檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA 上是否插入了目的基因,檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,方法,方法,方法,DNA分子雜交,分子雜交（注意與上不同之處）,抗原抗體雜交,歸納: 基因工程的基本操作程序,獲取目的基因 從基因文庫(kù) 利用PCR 化學(xué)方法人工合成 構(gòu)建基因表達(dá)載體 目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法 目的基因的檢測(cè)與鑒定

12、檢測(cè)：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯 鑒定：,練習(xí)1：(2008理綜山東卷)為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開(kāi)發(fā)利用備受關(guān)注。我國(guó)科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。 （1）獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性?xún)?nèi)切酶作用于圖中的 處，DNA連接酶作用于 處。（填“a”或“b”）,a,a,練習(xí)1：(2008理綜山東卷)為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開(kāi)發(fā)利用備受關(guān)注。我國(guó)科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。 （2）將重組DNA分子導(dǎo)入水稻受體細(xì)胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和 法。 （3）由導(dǎo)入目的基因的水稻細(xì)胞培養(yǎng)成植株

13、需要利用 技術(shù)，該技術(shù)的核心是 和 。 （4）為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標(biāo)記的 作探針進(jìn)行分子雜交檢測(cè)，又要用 方法從個(gè)體水平鑒定水稻植株的耐鹽性。,基因槍法（花粉管通道法）,植物組織培養(yǎng),脫分化和再分化,耐鹽基因,一定濃度鹽水澆灌,1）以下說(shuō)法正確的是 （ ） A、所有的限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列 B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體 C、運(yùn)載體必須具備的條件之一是：具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接 D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來(lái),C,練習(xí),2）不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理

14、由是 A、能復(fù)制 （ ） B、有多個(gè)限制酶切點(diǎn) C、具有標(biāo)記基因 D、它是環(huán)狀DNA,D,練習(xí),3）有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是（ ） A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對(duì)連接起來(lái) B、 限制性?xún)?nèi)切酶用于目的基因的獲得 C、目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞 D、 人工合成目的基因不用限制性?xún)?nèi)切酶,A,練習(xí),4）有關(guān)基因工程的敘述正確的是 （ ） A、限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用 B、重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完成 C、質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體 D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料,D,練習(xí),5）基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的。在基因操作的基

15、本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的步驟是 （ ） A、人工合成目的基因 B、目的基因與運(yùn)載體結(jié)合 C、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 D、目的基因的檢測(cè)和表達(dá),C,練習(xí),,,知識(shí)點(diǎn)一：1.原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),,,,,,,非編碼區(qū),,非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn),啟動(dòng)子,終止子,,啟動(dòng)子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。沒(méi)有啟動(dòng)子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。 終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動(dòng)，并使其從DNA模板鏈上脫離下來(lái)，使轉(zhuǎn)錄終止。,RNA聚合酶:能夠識(shí)別啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)并與其

16、結(jié)合的一種蛋白質(zhì).(以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落),不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能 編碼蛋白質(zhì)。,：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能 編碼蛋白質(zhì),編碼區(qū),非編碼區(qū),原核細(xì)胞的 基因結(jié)構(gòu),,,有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核 苷酸序列，在該序列中， 最重要的是位于編碼區(qū)上 游的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。,,,,,,,,,非編碼區(qū),,非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,啟動(dòng)子,終止子,,,,,,,,,,,,,,編碼區(qū),與RNA聚合酶 結(jié)合位點(diǎn),,,內(nèi)含子,外顯子,能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子,不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子,啟動(dòng)子,終止子,編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,內(nèi)含子：,外顯子：,知識(shí)點(diǎn)一：2.真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),真核細(xì)胞的 基因結(jié)構(gòu),,編碼區(qū),非編碼區(qū),,外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列 內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列,：有調(diào)控作用的核苷酸序列， 包括位于編碼區(qū)上游的RNA 聚合酶結(jié)合位點(diǎn)等。,非編碼序列：,包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子,原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較,思考,編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長(zhǎng)嗎？,連續(xù),不連續(xù),編碼區(qū),非編碼,