組織細(xì)胞的三維培養(yǎng)

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1、組織細(xì)胞的三維培養(yǎng) 學(xué)生：張旭朗 導(dǎo)師：馬小軍 研究員 2005 5 18 Seminar 概念 三維培養(yǎng)的構(gòu)成 三維培養(yǎng)的特點(diǎn) 三維培養(yǎng)的方法 研究方法 三維培養(yǎng)的應(yīng)用 展望 一、三維培養(yǎng)的概念 相對(duì)于單層細(xì)胞的二維培養(yǎng)而言，利用 各種方法及材料，使細(xì)胞呈空間立體方 式生長(zhǎng)，形成類似體內(nèi)組織的結(jié)構(gòu)，發(fā) 揮其功能 二、三維培養(yǎng)的構(gòu)成 1、輔助物：人工軟骨 1、 PET聚乙烯酯 2、 纖維蛋白支架 3、膠原支架 4-5、旋轉(zhuǎn)生 物反應(yīng)器 6、微膠囊 7、中空纖維 8 2、細(xì)胞：原代組織細(xì)胞大鼠肝、軟骨、 脂肪 9、成骨樣細(xì)胞、干細(xì)胞 10、 腫瘤 細(xì)胞 11 三、三維培養(yǎng)的特點(diǎn) 1、生長(zhǎng)特點(diǎn)：三

2、維結(jié)構(gòu)、異質(zhì)性、生長(zhǎng)速 率及氧氣、葡萄糖等梯度分布 2、組織學(xué)特點(diǎn)：細(xì)胞分三層（直徑 300m） 可有類似組織基質(zhì)的物質(zhì)產(chǎn)生 3、生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)：三維培養(yǎng)細(xì)胞以 G1/G0期 細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)， S期細(xì)胞較少 四、三維培養(yǎng)的方法 1、旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)：旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)或培養(yǎng) 瓶，旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器同時(shí)產(chǎn)生較多量直 徑為 1 2mm的細(xì)胞球 2、非黏附物包被的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿：瓊脂、 瓊脂糖、蛋白聚糖、聚苯乙烯 3、支架 五、研究方法 1、細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)：體積直徑 免疫組化（ BrdU、 PCNA、 Ki-67） 流式細(xì)胞儀（ DNA Hoechst33342、 PI） 電鏡 2、細(xì)胞球的生理特性：微電極（ pO2

3、or pH） NMR(脂代謝 ) 生物體發(fā)光技術(shù)（ ATP、 Lactate、 glucose） 六、三維培養(yǎng)的應(yīng)用 1、實(shí)驗(yàn)性治療 放射效應(yīng) 12：分化程度影響放療效 果 藥物耐受 13：培養(yǎng)方式是決定耐藥 的因素之一 免疫療法 14：腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞 作用 2、代謝及代謝環(huán)境研究 三維培養(yǎng)的細(xì)胞可模擬腫瘤生成中的無 血管階段、微轉(zhuǎn)移灶或毛細(xì)血管之間的 微區(qū)域 模擬在體細(xì)胞的環(huán)境： 良好生長(zhǎng)環(huán)境 缺氧、缺乏營(yíng)養(yǎng)、廢物積聚或 pH降低 等協(xié)同作用 “ toxic enviroment” 15 3、細(xì)胞的生物學(xué)特性 浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移：腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)共培養(yǎng) （ E-cadherin、 ICAM-1 ）

4、 16,17 細(xì)胞黏附：研究細(xì)胞聚集過程中黏附 因子的作用 18 血管形成： VEGF（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因 子）在惡性腫瘤血管形成中起主要作用 19 4、實(shí)驗(yàn)性組織模型 移植物以組織或器官的方式培養(yǎng)，使 其在一定時(shí)間內(nèi)保持原有功能 簡(jiǎn)單的講：使細(xì)胞自發(fā)或借助人工基 質(zhì)聚集并誘導(dǎo)細(xì)胞分化、維持細(xì)胞功能 舉例：人工肝（肝細(xì)胞、纖維細(xì)胞等 與明膠海綿、瓊脂、膠原共培養(yǎng)） 20-22 5、胚體干細(xì)胞與擬胚體 胚胎發(fā)育到囊胚期，此時(shí)細(xì)胞分化為 兩大類，即位于周邊的滋養(yǎng)層細(xì)胞和位 于腔內(nèi)但居于一端的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ inner cell mass ICM）。只有 ICM將來發(fā)育成 胚胎本身，把 ICM從胚胎中分離出

5、來在一 定條件下培養(yǎng)，可形成具有無限增殖能 力的細(xì)胞群，稱為胚胎干細(xì)胞 （ embryonic stem cells,ES細(xì)胞） 當(dāng) ES細(xì)胞經(jīng)過 2天懸滴培養(yǎng)、 2天懸浮 培養(yǎng)后，可形成簡(jiǎn)單擬胚體（ 3 D）， 擬胚體內(nèi)包含著來源于三個(gè)胚層的不同 細(xì)胞 微囊化腫瘤細(xì)胞用于藥篩 1、抗腫瘤藥物篩選的研究現(xiàn)狀 多采用體外單層培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞：簡(jiǎn)單、 易操作、費(fèi)用低、可大量應(yīng)用、生長(zhǎng)方 式及環(huán)境與在體腫瘤差距較大 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：費(fèi)用高、生存條件苛刻、生 長(zhǎng)方式及環(huán)境與在體相似 手術(shù)切除標(biāo)本：回顧性研究、不能動(dòng)態(tài) 觀察 體外三維培養(yǎng)：模擬腫瘤生長(zhǎng)方式及環(huán) 境、可大量應(yīng)用、費(fèi)用較低，如 MCTS 腫瘤細(xì)胞在

6、體與體外三維生長(zhǎng)示意圖 2、微囊化細(xì)胞三維共培養(yǎng)特點(diǎn) 微膠囊為半透膜 細(xì)胞呈三維立體生長(zhǎng) 生長(zhǎng)空間可控 空間相對(duì)封閉 “ 被動(dòng) ” 共培養(yǎng) 實(shí)質(zhì)與間質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng) -模擬體內(nèi) 3、微囊化腫瘤細(xì)胞的三維培養(yǎng) 材料：海藻酸鈉，聚賴氨酸，人乳腺癌 細(xì)胞系 MCF-7 方法：靜電液滴法 Day 7 Day 0 Day 5 Day 2 4、藥物對(duì)三維生長(zhǎng)細(xì)胞的抑制 藥物：絲裂霉素（ MC）、阿霉素（ ADM）、 5氟尿嘧啶（ 5 FU） 濃度和作用時(shí)間： 0.1ppc,1ppc及 10ppc Peak plasma concentration (ppc), the highest level of dru

7、g that can be obtained in the blood usually following multiple doses, of ADM, MC and 5-FU was 0.4 g/mL, 3.0 g/mL and 10 g/mL, respectively . 分別作用 24h, 48h, 72h b g a f h c e j i d 0 24 48 72 90 100 110 120 130 140 D iam et er of c ells s pheroid (10 6 m) T im e (h) con t ro l 0 . 1 p p c 1 p p c 1 0

8、 p p c * * * 24 48 72 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 I nhibit ion R at e (%) T im e (h) S 10 ppc M 10 ppc a * * * b 0 .1 p p c 1ppc 10ppc -4 0 -2 0 0 20 40 60 80 100 I nhibit ion R at e (%) D rug c onc ent rat ion M 72 h S 72 h * * * 0 .1 p p c 1ppc 10ppc 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 I nhibit ion

9、R at e (%) D rug C onc ent rat ion M -M C 72 h M -AD M 72 h M -5-F U 72 h a * * * 0 .1 p p c 1ppc 10ppc -6 0 -4 0 -2 0 0 20 40 60 80 100 I nhibit ion R at e (%) D rug C onc ent rat ion S-M C 72 h S-AD M 72 h S-5-F U 72 h b * * 七、展望 胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用研究及胚胎發(fā)育 致癌機(jī)制的研究 reference 1. Darling EM, Athanasiou KA. Reta

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